本發(fā)明涉及一種高持久性多效自交聯(lián)流體凝膠及其制備方法與應(yīng)用，屬于天然生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

由于老化、損傷和外傷、超重、一側(cè)過度使用、關(guān)節(jié)或者相關(guān)的結(jié)構(gòu)如骨骼、韌帶和軟骨等缺乏體育鍛煉，可能會導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)一系列的退行性疾病，對日常生活帶來諸多不便。其中最常見的是骨關(guān)節(jié)炎(OA)。OA是目前美國中致殘的主要原因，美國患者每年的相關(guān)治療費用約5700美元。而目前全球內(nèi)OA已經(jīng)導(dǎo)致4300萬人中度至重度殘疾。我國膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎患病率約為9.56％。對于OA目前沒有根治的方法，通過注射黏彈性補充劑是緩解關(guān)節(jié)炎疼痛的重要方法。對于重度關(guān)節(jié)炎的手術(shù)中，也有應(yīng)用黏彈性補充劑作為緩解患者術(shù)中疼痛的輔助手段。

目前市面上的關(guān)節(jié)黏彈性補充劑成分多為透明質(zhì)酸。對透明質(zhì)酸制品過敏或者患側(cè)膝關(guān)節(jié)或關(guān)節(jié)周圍有感染者，不能接受透明質(zhì)酸類產(chǎn)品的注射治療。對于鳥類蛋白、羽毛或雞蛋制品過敏的患者，則應(yīng)慎用提取自公雞雞冠的透明質(zhì)酸產(chǎn)品，如Synvisc(欣維可)、Synvisc One、Hyalgan、3H玻璃酸鈉和佰備。且透明質(zhì)酸類黏彈性補充劑在體內(nèi)留存時間較短，一般一個療程內(nèi)需要連續(xù)注射3～5針才能維持6個月的療效，例如Euflexa、Hyalgan、和Supartz分別需要連續(xù)注射3次、5次、和3次才能維持26周的療效，不僅給患者和醫(yī)生帶來諸多不便，同時也增加了患者就醫(yī)成本。因此國外一些廠家通過選用高分子量的透明質(zhì)酸或者通過交聯(lián)的方式延長其在關(guān)節(jié)處的留存時間，以期達到更長的療效。例如Gel one、Synvisc(欣維可)、Synvisc One中的透明質(zhì)酸經(jīng)過交聯(lián)后，分別注射1針、3針和1針的療效可達13周、26周和26周。

由于關(guān)節(jié)處存在透明質(zhì)酸酶，因此要延長透明質(zhì)酸類黏彈性補充劑的療效，則需要對其分子量或者交聯(lián)程度提出較高的要求，但同時也會大大增加注射頂推力，給注射帶來困難。專利CN105131348A、CN103124558A和CN1326352A中制備的黏彈性補充劑包含兩種組分，一是交聯(lián)的透明質(zhì)酸顆粒，起到延長制劑在體內(nèi)留存時間的作用；另一種是未交聯(lián)的透明質(zhì)酸液體，起到減小注射阻力和增加制劑柔軟度的作用。但是固液混懸的制劑形式，存在分散均勻性的問題，且顆粒會有堵塞注射器的風(fēng)險，造成注射困難，或者需要使用直徑更大的針頭，給患者造成更大的創(chuàng)傷。

與透明質(zhì)酸相比，殼聚糖無免疫原性，不會引起過敏反應(yīng)；來源廣泛，資源可再生，成本低；且結(jié)構(gòu)與糖氨多糖近似，可參與蛋白多糖的代謝；其黏度與滑液近似，有良好的組織相容性；殼聚糖類可直接促進軟骨增殖，減輕細胞損傷對關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的干擾，從而達到保護和修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨，減緩關(guān)節(jié)退變的發(fā)生并緩解疼痛的作用，而透明質(zhì)酸不能誘導(dǎo)軟骨增殖；另外，殼聚糖類還具有一定的抗菌消炎作用。由于關(guān)節(jié)處沒有降解殼聚糖及其衍生物的酶，因此其具有相對較好的耐酶解性能。

目前市面上基于幾丁糖制備的黏彈性補充劑僅有一款。專利CN1306824A中介紹了水溶性醫(yī)用幾丁糖的制備及在防黏連和防治退變性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用。但該方法制備的幾丁糖制劑及醫(yī)用幾丁糖黏彈性補充劑均未采用交聯(lián)等方式，而其在體內(nèi)仍存在自由基降解等，因此體內(nèi)留存時間仍然有限，且組分為單一高分子組分，功能單一，注射初期雖能較好地發(fā)揮緩沖墊的作用，但促修復(fù)功能相對滯后。

多硫酸木聚糖，又名多硫酸戊聚糖(PPS)，來自于水青岡樹，主要結(jié)構(gòu)是半纖維素，平均分子量接近7500D。PPS可使滑膜細胞合成高分子量的透明質(zhì)酸正?；⒁种蒲a體活化及白細胞核滑膜細胞的促炎性介質(zhì)的釋放，從而保護滑膜細胞，降低滑膜炎癥。PPS還可促進軟骨合成蛋白聚糖，強力抑制分解代謝。臨床研究表明，對OA患者應(yīng)用PPS，OA臨床癥狀在治療1個月后有明顯改善，滑液黏彈性升高。

硫酸軟骨素是構(gòu)成軟骨的重要成分之一，分子量相對較低，更容易被吸收進軟骨，可直接參與軟骨的構(gòu)建，加速軟骨的再生和修復(fù)，且具有一定的止痛作用。因此將硫酸軟骨素和多硫酸木聚糖與羧甲基殼聚糖進行復(fù)配制備關(guān)節(jié)用黏彈性補充劑，可以起到協(xié)同增效的作用，提高產(chǎn)品在注射全周期內(nèi)的吸收修復(fù)效果，并賦予產(chǎn)品一定的止痛功能并增加產(chǎn)品潤滑性。

交聯(lián)是目前提高黏彈性補充劑療效的常用方法。但目前使用的交聯(lián)劑多為化學(xué)交聯(lián)劑。例如，DVS、BDDE、環(huán)氧氯丙烷等交聯(lián)劑毒性大，生物相容性欠佳，產(chǎn)物中存在交聯(lián)劑殘留的風(fēng)險。EDC或者氨基酸類作為交聯(lián)劑時，雖然生物相容性較好，但是成本較高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高持久性多效自交聯(lián)流體凝膠及其制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明流體凝膠具有均相、高持久性、多效的特點；制備方法簡單，采用物理自交聯(lián)反應(yīng)；應(yīng)用具有生物安全性。

本發(fā)明提供的流體凝膠的制備方法，包括如下步驟：1)將水溶性殼聚糖置于水中溶解，得到水溶性殼聚糖水溶液；然后過濾，收集濾液；

2)將所述濾液進行反復(fù)凍融，得到高持久性自交聯(lián)流體凝膠；

3)將所述高持久性自交聯(lián)流體凝膠與功能調(diào)節(jié)劑混合，即得到所述流體凝膠。

本發(fā)明中，步驟1)所述水優(yōu)選純化水。

上述的制備方法中，所述水溶性殼聚糖為羧甲基殼聚糖和/或羥丙基殼聚糖；

所述水溶性殼聚糖的分子量可為10萬～40萬，具體可為10萬、20萬、30或10萬～30萬；

所述水溶性殼聚糖水溶液的濃度可為10～40mg/mL，具體可為10mg/ml、25mg/ml、40mg/ml、10～25mg/mL或25～40mg/mL。

本發(fā)明中，所述羧甲基殼聚糖羧化度可為80％～100％，具體可為82％；所述羥丙基殼聚糖的取代度可為0.4～1，具體可為0.6或0.4～0.6。

上述的制備方法中，步驟1)中，所述溶解的溫度為10～80℃，具體可為30℃、50℃、65℃、30～50℃、50～65℃或30～65℃。

本發(fā)明中，步驟1)中過濾采用本領(lǐng)域常規(guī)的過濾方法。上述的制備方法中，步驟2)中，所述反復(fù)凍融包括如下步驟：先于-20℃～-40℃冷凍12～72h；再于0℃～30℃下解凍1～5h；所述反復(fù)凍融的次數(shù)為1～10次。

所述反復(fù)凍融具體包括如下1-4中任一種操作步驟：

1、置于-20℃冰箱中冷凍24h后，于10℃下解凍4h，如此反復(fù)凍融2次；

2、置于-30℃冰箱中冷凍36h后，于25℃下解凍3h，如此反復(fù)凍融6次；

3、置于-40℃冰箱中冷凍48h后，于20℃下解凍3h，如此反復(fù)凍融8次；

4、置于-20℃～-40℃冰箱中冷凍24～48h后，于10～25℃下解凍3～4h，如此反復(fù)凍融2～8次。

上述的制備方法中，制備所述功能調(diào)節(jié)劑包括如下步驟：將硫酸軟骨素和多硫酸木聚糖溶解在pH緩沖液中制成。

上述的制備方法中，所述功能調(diào)節(jié)劑包括如下濃度的組份，單位以mg/ml計：

所述功能調(diào)節(jié)劑具體包括如下濃度的組份：

上述的制備方法中，所述硫酸軟骨素的分子量為4000～8000道爾頓，具體可為4000道爾頓、5000道爾頓、6000道爾頓、4000～5000道爾頓、5000～6000道爾頓或4000～6000道爾頓；

所述多硫酸木聚糖的分子量為6000～8000道爾頓，具體可為6000道爾頓、7000道爾頓、8000道爾頓、6000～7000道爾頓或7000～8000道爾頓。

上述的制備方法中，所述高持久性自交聯(lián)流體凝膠與功能調(diào)節(jié)劑的體積比為1:1。

本發(fā)明還提供了上述的制備方法制備得到的所述流體凝膠。

本發(fā)明進一步提供了所述流體凝膠制備治療關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)材料中的應(yīng)用；具體可制備治療關(guān)節(jié)炎修復(fù)材料。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明選用水溶性殼聚糖衍生物為黏彈性補充劑的主要功能成分，具有相對較好的耐酶性；自交聯(lián)制備則進一步延長其體內(nèi)留存時間，使其能發(fā)揮長效的隔離、潤滑和緩沖外力的作用。

2、本發(fā)明通過交聯(lián)法進一步延長其療效時，對交聯(lián)程度要求不高，且本發(fā)明制備的凝膠為均相流體凝膠，因此可以顯著降低注射頂推力，不存在顆粒堵塞針頭的風(fēng)險，且使用較小針頭即可順利完成注射給藥過程，明顯降低注射產(chǎn)生的疼痛并減小對機體部位的損傷。

3、本發(fā)明能有效降低感染的機會、促進蛋白聚糖的合成，抑制分解代謝和滑膜炎癥。采用相對分子質(zhì)量較低的硫酸軟骨素和多硫酸木聚糖，具有快吸收快修復(fù)的特點，在注射初期即可迅速發(fā)揮促修復(fù)的功能。隨著硫酸軟骨素和多硫酸木聚糖的逐漸消耗，大分子的水溶性殼聚糖逐漸降解成氨基多糖繼續(xù)參與軟骨合成和滑膜修復(fù)，且水溶性殼聚糖具有一定的抗菌消炎功能。本發(fā)明中三者協(xié)同作用保證了注射全周期內(nèi)關(guān)節(jié)炎修復(fù)的及時性、有效性、持久性和多效性。

4、本發(fā)明的凝膠未使用交聯(lián)劑，生物安全性好，僅通過反復(fù)凍融法使高分子間形成以強氫鍵和結(jié)晶區(qū)為物理交聯(lián)點的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明制備方法綠色環(huán)保，簡單易行。

附圖說明

圖1為本發(fā)明流體凝膠的注射圖。

圖2為本發(fā)明實施例3流體凝膠植入4周后關(guān)節(jié)滑膜的病理切片圖；其中圖2(a)為關(guān)節(jié)炎造模后的軟骨病理切片圖，圖2(b)為本發(fā)明實施例3流體凝膠植入4周后關(guān)節(jié)軟骨的病理切片圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

實施例1、流體凝膠的制備

1)將羧甲基殼聚糖置于30℃純化水中攪拌充分溶解后用G3砂芯漏斗過濾收集濾液，羧甲基殼聚糖的分子量、羧化度、濃度分別為10萬、82％和10mg/ml；2)將步驟1)的羧甲基殼聚糖水溶液置于-20℃冰箱中冷凍24h后，于10℃下解凍4h，如此反復(fù)凍融2次，得到高持久性自交聯(lián)流體凝膠；3)將硫酸軟骨素和多硫酸木聚糖溶解在pH緩沖液中，硫酸軟骨素濃度和分子量分別為20mg/ml和4000道爾頓，多硫酸木聚糖濃度和分子量分別為30mg/ml和6000道爾頓，NaH₂PO₄ 6.28mg/ml，Na₂HPO₄ 11.6mg/ml，NaCl9.4mg/ml；4)將步驟2)的凝膠與步驟3)的溶液按等體積比為1:1進行混合并均質(zhì)，即得到本發(fā)明流體凝膠(又稱均相的高持久性多效自交聯(lián)流體凝膠)。

實施例2、流體凝膠的制備

1)將羥丙基殼聚糖置于50℃純化水中攪拌充分溶解后用G3砂芯漏斗過濾收集濾液，羥丙基殼聚糖的分子量、取代度、濃度分別為20萬、0.6和25mg/ml；2)將步驟1)的羥丙基殼聚糖水溶液置于-30℃冰箱中冷凍36h后，于25℃下解凍3h，如此反復(fù)凍融6次，得到高持久性自交聯(lián)流體凝膠；3)將硫酸軟骨素和多硫酸木聚糖溶解在pH緩沖液中，硫酸軟骨素濃度和分子量分別為50mg/ml和5000道爾頓，多硫酸木聚糖濃度和分子量分別為60mg/ml和7000道爾頓，NaH₂PO₄ 6.28mg/ml，Na₂HPO₄ 11.6mg/ml，NaCl 9.4mg/ml；4)將步驟2)的凝膠與步驟3)的溶液按等體積比為1:1進行混合并均質(zhì)，即得到本發(fā)明流體凝膠。

實施例3、流體凝膠的制備

1)將羧甲基殼聚糖置于65℃純化水中攪拌充分溶解后用G3砂芯漏斗過濾收集濾液，羧甲基殼聚糖的分子量、羧化度、濃度分別為30萬、90％和40mg/ml；2)將步驟1)的羧甲基殼聚糖水溶液置于-40℃冰箱中冷凍48h后，于20℃下解凍3h，如此反復(fù)凍融8次，得到高持久性自交聯(lián)流體凝膠；3)將硫酸軟骨素和多硫酸木聚糖溶解在pH緩沖液中，硫酸軟骨素濃度和分子量分別為80mg/ml和6000道爾頓，多硫酸木聚糖濃度和分子量分別為60mg/ml和8000道爾頓，NaH₂PO₄ 6.28mg/ml，Na₂HPO₄ 11.6mg/ml，NaCl 9.4mg/ml；4)將步驟2)的凝膠與步驟3)的溶液按等體積比為1:1進行混合并均質(zhì)，得到本發(fā)明流體凝膠。

實施例4、應(yīng)用

1、推擠力實驗

將各樣品平衡至室溫，注入5ml針管中，安裝25G注射頭，推擠針頭前端少量的空氣后，于萬能材料試驗機中在推擠速度為30mm/min的推動速度下進行測試，對照品選用某關(guān)節(jié)注射用醫(yī)用幾丁糖和Gel 結(jié)果如下：

表1高持久性多效自交聯(lián)流體凝膠的推擠力測試結(jié)果

由表1可知，本發(fā)明實施例樣品的推擠力與市面上玻璃酸鈉注射液相當(dāng)甚至更小，且遠小于Gel 的推擠力。這說明本安發(fā)明樣品更易注射。

2、粘度測試

采用旋轉(zhuǎn)式粘度計，在剪切速率不小于0.25Hz、(25±0.1)℃條件下分別對實施例一、二、三的3個樣品進行測試，對照品選用Gel 粘度結(jié)果如下：

表2高持久性多效自交聯(lián)流體凝膠的粘度測試結(jié)果

由表2可知，本發(fā)明實施例樣品的粘度均較Gel 小，這有利于降低注射時的頂推力，使產(chǎn)品更易注射。

3、細胞毒性實驗

表3高持久性多效自交聯(lián)流體凝膠的細胞毒性測試結(jié)果

取試驗液，按照GB/T16886.5規(guī)定的方法試驗和按GB/T14233.2-2005規(guī)定評級，結(jié)果表明本發(fā)明制備的樣品細胞毒性符合要求。

4、抑菌性實驗

采用生長速率法測定樣品對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。將0.5ml樣品加入至細菌培養(yǎng)基中混合均勻，以純化水為陰性對照，以Gel 為陽性對照，測定樣品對金黃色葡萄球菌的抑制效果。將培養(yǎng)基均勻加入至2個直徑為9cm的培養(yǎng)基中，待完全凝固后，在每個培養(yǎng)基中接種2塊直徑為5mm的菌餅。在25℃下培養(yǎng)48h后，測量菌落直徑，計算樣品的抑菌率。

表4高持久性多效自交聯(lián)流體凝膠的抑菌性實驗結(jié)果

由表2可知，本發(fā)明制備的樣品抑菌率可以達到70％-80％，這對于防止關(guān)節(jié)炎注射過程中的感染等具有重要意義。

5、關(guān)節(jié)炎治療效果評價

取健康新西蘭兔72只，隨機分為12組，通過關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入木瓜蛋白酶溶液造成骨關(guān)節(jié)病變模型。造模后，試驗組關(guān)節(jié)腔注射本發(fā)明實施例1、2、3分別為0.3ml，陰性對照組關(guān)節(jié)上腔注射生理鹽水0.3ml，陽性對照關(guān)節(jié)注射用醫(yī)用幾丁糖，同樣注射0.3ml。在給藥后第1、2、3、4周處死，并進行病理學(xué)觀察，記錄病理積分。結(jié)果如表5和圖2所示。

表5高持久性多效自交聯(lián)流體凝膠的關(guān)節(jié)炎治療效果

對各試驗組結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析表明：注射黏彈性補充劑的實驗組與陰性對照組有顯著差異。1周時，本發(fā)明實施例3和對照品1對兔關(guān)節(jié)炎具有明顯的改善作用；而在2～4周時，本發(fā)明實施例3的樣品對兔關(guān)節(jié)炎具有更持久的緩解和修復(fù)作用；而對照品1對兔關(guān)節(jié)炎的緩解修復(fù)作用較短，因此在實際應(yīng)用中需要每周注射一次，連續(xù)注射3～5次以保持相對較長的療效。

由圖2可知注射本發(fā)明的黏彈性補充劑后4周，軟骨細胞增殖明顯，滑膜上皮細胞點狀增生，并有輕度血管增生，血運較好，恢復(fù)情況良好。