本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種基于化學(xué)偶聯(lián)的殼寡糖疫苗佐劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原，臨床上常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬口蹄疫病毒及豬細(xì)小病毒等混合感染。同時(shí)，PCV2還與豬皮炎與腎病綜合征、豬呼吸道疾病綜合征、母豬繁殖障礙、仔豬先天性震顫、壞死性淋巴結(jié)炎、肉芽腫性腸炎及滲出性表皮炎等疾病密切相關(guān)，這些與PCV2相關(guān)的疾病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒病(Expert review of vaccines,2015,14:473-487)。我國在2000年首次發(fā)現(xiàn)該病，針對豬群的流行病學(xué)調(diào)查顯示，PCV2抗體陽性率高達(dá)80％以上，而被調(diào)查的豬場陽性率達(dá)100％，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失(動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,35:111-115)。目前，對于PCV2造成的豬圓環(huán)病毒病尚無有效的治療措施，防控該病的主要手段是采用疫苗免疫。國際上已經(jīng)商品化的豬圓環(huán)病毒疫苗有5種，國內(nèi)34種，主要分為滅活疫苗、亞單位疫苗及PCVl-PCV2嵌合型疫苗三個(gè)種類。這些疫苗能夠有效減輕PCV2感染引起的臨床癥狀，顯著降低病毒血癥、系統(tǒng)性疾病和病毒排泄，對豬圓環(huán)病毒病的防控起到了關(guān)鍵作用，但是仍不能完全阻止PCV2的感染和傳播。目前商用豬圓環(huán)病毒疫苗基本使用礦物油作為佐劑，主要包括水包油(O/W)、油包水(W/O)、水包油包水(W/O/W)三種劑型。油佐劑疫苗在抗體效價(jià)和免疫持久性方面都優(yōu)于鋁鹽佐劑疫苗，但油佐劑不良反應(yīng)嚴(yán)重，皮下注射會引起發(fā)熱、炎癥、潰瘍和肉芽腫。這些油類長期潴留于組織中不被代謝，嚴(yán)重影響肉產(chǎn)品質(zhì)量(中國家禽,2013,35:44-46)。因此，很有必要研究開發(fā)新型安全高效疫苗佐劑，更好的克服現(xiàn)有豬圓環(huán)病毒疫苗在免疫原性和保護(hù)效力方面的不足，并替代現(xiàn)有的礦物油佐劑，以輔助包括豬圓環(huán)病毒病疫苗在內(nèi)的多種疫苗發(fā)揮其最大的傳染病防控效用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)多糖具有免疫佐劑的作用，能增強(qiáng)疫苗的免疫效果，促進(jìn)機(jī)體特異型免疫與非特異型免疫。而將多糖降解制備的功能性寡糖用作疫苗佐劑的研究也應(yīng)運(yùn)而生。殼寡糖(Chitooligosaccharides，COS)是氨基葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的小分子寡糖，可經(jīng)化學(xué)或酶降解甲殼素工藝制得。殼寡糖對人類健康的影響表現(xiàn)在具有抗氧化作用，有抗菌，具有抗炎、促進(jìn)傷口愈合作用，有助于關(guān)節(jié)健康、心臟血管健康，抑制糖尿病，抗癌、抗腫瘤和抗突變作用，免疫調(diào)節(jié)作用，具有抗病毒作用，減肥功效，同時(shí)能增強(qiáng)記憶和改善大腦健康(杜昱光.殼寡糖的功能研究及應(yīng)用.化學(xué)工業(yè)出版社[M],北京,2009)。殼寡糖分子量低、水溶性好，具有良好的生物相容性，并且其來源廣泛、純天然、易吸收，更為值得關(guān)注的是它能夠有效激活機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫，將其開發(fā)為疫苗佐劑具有良好的應(yīng)用前景。Liu等將殼寡糖作為福爾馬林滅活鰻弧菌疫苗的佐劑，能明顯促進(jìn)機(jī)體的體液免疫，有效的抑制病原菌的侵襲，免疫效果與商用佐劑ISA763A相當(dāng)，進(jìn)一步明確了殼寡糖的佐劑活性(Fish&shellfish immunology,2015,47:855-860)。

目前，佐劑最常用的使用方法是與抗原直接物理混合，然后免疫被保護(hù)者。簡單的物理混合雖然能發(fā)揮免疫佐劑活性，但并不一定是發(fā)揮其佐劑活性的最佳方式。文獻(xiàn)報(bào)道，將抗原和佐劑共存于一個(gè)遞送系統(tǒng)中能增強(qiáng)免疫原性，如抗原和佐劑活性的鞭毛蛋白、CpG及LPS等(Vaccine,2009,27:4784-4790；Bioconjugate Chem,2007,18:77-83；Vaccine,2009,27:3013-3021)。研究顯示，只有當(dāng)抗原遞呈細(xì)胞(APC)呈遞一定量的抗原和佐劑才能激活T細(xì)胞，只呈遞其一并不能激活T細(xì)胞(Nature,2006,440:808-812；Vaccine,2008,26:1626-1637)。因此，將佐劑和抗原化學(xué)偶聯(lián)成一個(gè)整體使之到達(dá)相同的APC是增強(qiáng)抗原免疫原性的好策略。Slütter等將OVA抗原和佐劑三甲基殼聚糖(TMC)共價(jià)鍵結(jié)合后，能明顯的增強(qiáng)OVA的免疫原性，產(chǎn)生的IgG抗體滴度是OVA、OVA和TMC物理混合的1000倍，并能有效的刺激樹突細(xì)胞成熟，促進(jìn)抗原呈遞作用(Journal of Controlled Release,2010,143:207-214)。另有研究顯示新型佐劑TLR7激動劑與抗原化學(xué)結(jié)合后，能明顯提高免疫反應(yīng)，并對肺部感染的小鼠模型具有良好的保護(hù)作用(European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,2014,87:310-317)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的之一在于提供一種基于化學(xué)偶聯(lián)的新型殼寡糖疫苗佐劑及應(yīng)用；本發(fā)明的主要目的之二在于提供基于新型殼寡糖佐劑的疫苗制劑的制備方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，具體地，本發(fā)明包括以下幾個(gè)方面：

本發(fā)明提供的一種基于化學(xué)偶聯(lián)的殼寡糖疫苗佐劑，包括巰基化殼寡糖與異型雙功能連接劑，巰基化殼寡糖通過異型雙功能連接劑與疫苗偶聯(lián)。

根據(jù)本發(fā)明的殼寡糖疫苗佐劑，其中，所述巰基化殼寡糖通過活化劑活化殼寡糖(COS)獲得巰基化殼寡糖，所述活化劑可以為2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(IT)、巰基乙酸、3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯等，所述異型雙功能連接劑為3-苯甲酰馬來酰亞胺-N-羥基琥珀酰亞胺(MBS)、3-馬來酰亞胺基丙酸、3-馬來酰亞胺基丙酸羥基琥珀酰亞胺酯、4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯等。

本發(fā)明還公開了用異型雙功能連接劑，即兩端含有不同功能團(tuán)的試劑，來制備殼寡糖偶聯(lián)物的方法。

根據(jù)本發(fā)明的殼寡糖疫苗佐劑，其特征在于，所述巰基化殼寡糖與異型雙功能連接劑的重量比為0.1:1-0.8:1。

本發(fā)明還提供了一種疫苗制劑，所述疫苗制劑包括本發(fā)明上述任一殼寡糖疫苗佐劑與疫苗，所述殼寡糖疫苗佐劑通過異型雙功能連接劑與疫苗的抗原偶聯(lián)。

根據(jù)本發(fā)明的疫苗制劑，其中，所述殼寡糖疫苗佐劑與疫苗的重量比為0.3:1-0.6:1。

根據(jù)本發(fā)明的疫苗制劑，其中，所述疫苗為減毒活疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、多糖疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗。根據(jù)本發(fā)明的疫苗制劑，其中，所述的疫苗為豬圓環(huán)滅活疫苗，還適合于豬藍(lán)耳病疫苗、雞新城疫疫苗及多糖結(jié)合疫苗等其它疫苗。

本發(fā)明還提供一種上述任一所述疫苗制劑的制備方法，包括以下步驟：

1)將殼寡糖巰基化，獲得巰基化殼寡糖；所述巰基化使用的活化劑與殼寡糖的重量比為0.1:1-0.5:1；

2)將異型雙功能連接劑與疫苗混合反應(yīng)，獲得疫苗衍生化學(xué)物；所述異型雙功能連接劑與疫苗的重量比為0.1:1-0.8:1；

3)將巰基化殼寡糖與疫苗衍生化學(xué)物混合反應(yīng)，獲得偶聯(lián)物；所述巰基化殼寡糖與疫苗衍生化學(xué)物的重量比為5:1-1:1；

4)將步驟3)所得偶聯(lián)物純化除菌，制得疫苗制劑。

本發(fā)明還提供了所述疫苗佐劑在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及的偶聯(lián)物純化優(yōu)選凝膠層析，所用填料可以選擇葡聚糖凝膠(Sephadex)、瓊脂糖凝膠(Sepharose)和丙烯葡聚糖凝膠(Sephacryl)中的一種。偶聯(lián)物純化也可以采用離子交換層析或疏水層析。

本發(fā)明的殼寡糖佐劑能夠增強(qiáng)免疫應(yīng)答，具有良好的佐劑作用，可以用作減毒疫苗、蛋白質(zhì)疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的佐劑。本發(fā)明中的殼寡糖已經(jīng)可以大規(guī)模生產(chǎn)，制備方法成熟穩(wěn)定。本發(fā)明為殼寡糖佐劑作用機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)，為找到具有更好佐劑效果的寡糖提供了參考。

附圖說明

圖1為殼寡糖與豬圓環(huán)疫苗化學(xué)偶聯(lián)示意圖。

圖2為SDS-PAGE分析殼寡糖PCV疫苗化學(xué)偶聯(lián)物的電泳圖。

圖3為凝膠分析殼寡糖PCV疫苗化學(xué)偶聯(lián)物色譜圖。

圖4為Superdex 200凝膠分析純化后殼寡糖PCV疫苗化學(xué)偶聯(lián)物色譜圖。

圖5為小鼠免疫后血清特異型抗體滴度示意圖。

圖6為各免疫組注射部位病理切片圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：殼寡糖疫苗佐劑的制備

1、殼寡糖佐劑制備：

(1)殼寡糖COS的巰基化衍生

分別稱取所需質(zhì)量的COS(質(zhì)量比COS:PCV＝1:1)和2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(IT)，按IT:COS＝5:1的摩爾比稱取IT，用20mM PBS(pH 7.4)溶解溶解后混合，常溫下反應(yīng)3h。

反應(yīng)時(shí)間到后，用G25的脫鹽柱洗脫，除去未反應(yīng)的小分子。

(2)豬圓環(huán)滅活疫苗PCV馬來酰亞胺化衍生

根據(jù)所需的的量吸取3mL1.7mg/mL的PCV，按MBS:PCV＝100:1的摩爾比稱取3-苯甲酰馬來酰亞胺-N-羥基琥珀酰亞胺(MBS)，先溶于DMF后用20mM PBS(pH 7.4)溶解，加PCV混合，4℃反應(yīng)3小時(shí)，其中反應(yīng)緩沖液為20mM PB(pH 7.2)，反應(yīng)體系中DMF的體積不超過10％。

3h后，轉(zhuǎn)移至截留分子量為3000的超濾膜管中，6000rpm離心30min，共4次，其中每離心完一次補(bǔ)加3mL 20mM PB(pH 7.2)，以除去小分子。

(3)PCV與COS化學(xué)偶聯(lián)

分別取上述衍生后化合物，按質(zhì)量比1:1混合，4℃反應(yīng)過夜，具體的反應(yīng)方程式如圖1所示。

2、殼寡糖佐劑分離純化：

所得產(chǎn)物用制備色譜柱Superdex 200(2.6cm×60cm)對制備的產(chǎn)物進(jìn)行純化(如圖3所示)，并使用還原性SDS-PAGE對樣品進(jìn)行分析(如圖2所示)，其中設(shè)置壓力0.3MPa，流速3mL/min。分別收集純化的兩個(gè)峰，將收取的樣品進(jìn)行濃縮，分別命名為PCV-COS-1、PCV-COS-2(產(chǎn)物一為殼寡糖多氨基使PCV形成的的多聚體，產(chǎn)物二為多個(gè)殼寡糖對單一PCV的修飾)。用Superdex 200(1.0cm×30cm)對純化的樣品進(jìn)行鑒定(如圖4所示)。

實(shí)施例2：殼寡糖疫苗佐劑的疫苗佐劑活性測定

對實(shí)施例1中的殼寡糖偶聯(lián)物進(jìn)行免疫活性檢測，肌肉注射免疫小鼠，測定抗體滴度。具體方法如下：

實(shí)驗(yàn)動物：C57BL/6小鼠，4-6周齡，6只/組，雌性。

對照溶劑：磷酸鹽緩沖液(PBS)。

給藥劑量：豬圓環(huán)滅活疫苗(PCV)：100μg/mouse(小鼠)；殼寡糖：100μg/mouse；殼寡糖偶聯(lián)物1(PCV-COS-1)：100μg/mouse；殼寡糖偶聯(lián)物2(PCV-COS-2)：100μg/mouse；油乳佐劑(ISA206)：100μg/mouse。

分組：(1)空白對照組(PBS)；(2)單獨(dú)疫苗組(PCV)：PBS+PCV；(3)物理混合組(PCV/COS)：COS+PCV；(4)PCV-COS-1組：PBS+PCV-COS-1；(5)PCV-COS-2組：PBS+PCV-COS-2；(6)油乳佐劑ISA206組：PCV+ISA206。

注射前等體積混合，100μL/鼠，右后肢肌肉注射。

免疫方案：動物按照免疫分組，分別于第0、14、28天對小鼠進(jìn)行免疫。首次免疫后第0、7、14、21、28、35、42天尾靜脈取血，測定血清中抗體滴度。ELISA法測定血清中抗體滴度。

ELISA法所用試劑配制：

1.抗原包被液：50mmol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6。稱取無水Na₂CO₃ 1.696g，NaHCO₃2.856g，加水溶解到1000mL，PH 9.6。

2.洗滌液(10×PBST，PH 7.4)：稱取NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄ 29g，KH₂PO₄ 2g，Tween-20 10mL，加雙蒸水至1000mL，調(diào)至PH 7.4，使用時(shí)稀釋10倍即可。

3.封閉液：5％脫脂奶粉，用50mmol/L PBS PH 7.4溶解。

4.底物液A(TMB-過氧化氫溶液)：取3,3＇,5,5＇-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)200mg，無水乙醇100mL，加雙蒸水至1000mL。

5.底物液B(0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/LNa₂HPO₄緩沖液)：Na₂HPO₄ 24.8g，檸檬酸19.33g，加雙蒸水至1000mL，調(diào)節(jié)pH至5.0～5.4。

6.底物液：使用時(shí)將底物液A和底物液B按1：1，加入30％H₂O₂至終濃度0.5％。

7.終止液：2N H₂SO₄。

PCV抗原用抗原包被液稀釋至5μg/mL，加入96孔板(Corning)中，100μL/孔，4℃包被過夜。用PBST洗3次，5％脫脂奶粉，200μL/孔，37℃封閉1h。用PBST洗滌3次，小鼠抗血清從1:400開始，用PBST按等比稀釋6個(gè)梯度，100μL/孔加入酶標(biāo)板，37℃孵育1h。棄去血清樣品，PBST洗滌3次，加入山羊抗小鼠IgG-HRP抗體(PBST 1:1000倍稀釋)，加入酶標(biāo)板中，100μL/孔，37℃孵育1h。棄去二抗，PBST洗滌6次，加入新配置的新鮮TMB底物顯色液，100μL/孔，室溫避光顯色15min。加入2N硫酸溶液終止顯色，50μL/孔，并用酶標(biāo)儀測定450nm吸光度(A₄₅₀)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

以PCV滅活疫苗為免疫抗原，對各組的特異型抗體滴度進(jìn)行了檢測(圖5)。結(jié)果顯示，PBS組、PCV組、物理混合組只能產(chǎn)生較低的抗體滴度；而本發(fā)明的殼寡糖佐劑組(PCV-COS-1、PCV-COS-2)與物理混合組相比能明顯的產(chǎn)生較高滴度的特異型抗體(P<0.05)，表明化學(xué)偶聯(lián)后的殼寡糖佐劑比簡單的物理混合具有更好的免疫佐劑活性，能夠更好地促進(jìn)抗體的產(chǎn)生。另外，PCV-COS-1能夠快速的促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，并且在大部分時(shí)間優(yōu)于油乳佐劑ISA206組。

實(shí)施例3：殼寡糖疫苗佐劑的病理切片研究

對實(shí)施例2中的各組小鼠的注射部位進(jìn)行收集，然后用常規(guī)的病理學(xué)方法處理。具體的，注射部位組織用10％的福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后切成4-mm的切片，然后用HE染色后用顯微鏡(Leica)在明場下進(jìn)行觀察和拍照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

為了驗(yàn)證本發(fā)明的殼寡糖佐劑是否存在可能的不良反應(yīng)，收集各免疫組小鼠的注射部位進(jìn)行病理切片的比較(圖5)。結(jié)果顯示，油乳佐劑組注射部位產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)，而殼寡糖偶聯(lián)物組及其他各組不存在明顯的變化。表明本發(fā)明的殼寡糖佐劑是無害的，不會在注射部位產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

實(shí)施例4殼寡糖疫苗佐劑

參照實(shí)施例1的方法，使用巰基乙酸按質(zhì)量比0.1:1進(jìn)行巰基化殼寡糖，并以3-馬來酰亞胺基丙酸羥基琥珀酰亞胺酯為異型雙功能連接劑按質(zhì)量比0.3:1偶聯(lián)雞新城疫疫苗，制得疫苗衍生化學(xué)物；將巰基化殼寡糖與疫苗衍生化學(xué)物按質(zhì)量比1:1混合，制得疫苗制劑。以2周齡內(nèi)肉雞雛雞為試驗(yàn)體，參照實(shí)施例2與3的方法進(jìn)行免疫試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明化學(xué)偶聯(lián)后的殼寡糖佐劑比簡單的物理混合具有更好的免疫佐劑活性，能夠更好地促進(jìn)抗體的產(chǎn)生。并且，表明本發(fā)明的殼寡糖佐劑是無害的，不會在注射部位產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

實(shí)施例5殼寡糖疫苗佐劑

參照實(shí)施例1的方法，使用3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯按質(zhì)量比0.8:1進(jìn)行巰基化殼寡糖，并以3-馬來酰亞胺基丙酸為異型雙功能連接劑按質(zhì)量比0.6:1偶聯(lián)豬藍(lán)耳病疫苗，制得疫苗衍生化學(xué)物；將巰基化殼寡糖與疫苗衍生化學(xué)物按質(zhì)量比5:1混合，制得疫苗制劑。以小鼠為試驗(yàn)體，參照實(shí)施例2與3的方法進(jìn)行免疫試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明化學(xué)偶聯(lián)后的殼寡糖佐劑比簡單的物理混合具有更好的免疫佐劑活性，能夠更好地促進(jìn)抗體的產(chǎn)生。并且，表明本發(fā)明的殼寡糖佐劑是無害的，不會在注射部位產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

當(dāng)然，本發(fā)明還可以有多種實(shí)施例，在不背離本發(fā)明精神及其實(shí)質(zhì)的情況下，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明的公開做出各種相應(yīng)的改變和變形，但這些相應(yīng)的改變和變形都應(yīng)屬于本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。