本發(fā)明涉及一種用于光動力治療的聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球的制備方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是目前威脅人類健康及導(dǎo)致人類死亡率最為嚴(yán)重的疾病之一。手術(shù)治療、化學(xué)療法(化療)以及放射療法(放療)是目前治療惡性腫瘤的三大常用方法。手術(shù)治療是腫瘤治療的一種常見方法，對早期無轉(zhuǎn)移的腫瘤，通過手術(shù)治療可以切除癌變組織，取得良好的治療效果。然而，對于中晚期的腫瘤，因癌細(xì)胞已經(jīng)在體內(nèi)擴(kuò)散，僅通過手術(shù)治療并不能夠徹底根除惡性腫瘤。放療是利用放射線的高組織穿透能力，使細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生電離，破壞細(xì)胞內(nèi)DNA分子，從而殺死癌細(xì)胞的一種腫瘤治療方法。放療存在的主要問題在于其毒副作用明顯，許多癌細(xì)胞類型對放療不敏感及加速癌細(xì)胞擴(kuò)散等。化療是利用化學(xué)藥物抑制或殺死癌細(xì)胞來治療惡性腫瘤的一種常見的方法。但傳統(tǒng)化療存在化療藥物生物相容性差、靶向性差和毒副作用大等問題。

光動力療法是除手術(shù)、放療、化療外，治療惡性腫瘤的一種新興的治療方法。光動力治療是利用特定波長的光激發(fā)光敏劑，在周圍氧分子存在的條件下生成具有細(xì)胞毒性的氧自由基及單線態(tài)氧，從而殺死腫瘤細(xì)胞。在傳統(tǒng)的光動力療法中，光敏劑的激發(fā)光通常為紫外或者可見光，組織穿透深度有限，從而限制了光動力療法在深部腫瘤治療中的應(yīng)用。且多數(shù)光敏劑存在水溶性差且容易聚集的問題，這也限制了直接靜脈注射光敏劑的給藥的方式。最為重要的是，由于光動力療法產(chǎn)生的活性氧壽命極短(≤3.5μs)且傳播距離有限(≤0.02μm)，將導(dǎo)致其在細(xì)胞基質(zhì)中極易消失。眾所周知，理想的納米藥物載體應(yīng)該具有水溶性和高的載藥量，能夠在體內(nèi)保持穩(wěn)定性，且在治療過程中可以不斷地產(chǎn)生活性氧殺死癌細(xì)胞。因此，研制一種新型的納米藥物載體，解決光敏劑藥物水溶性差，提高載藥量及組織穿透深度，具有重要的臨床應(yīng)用價值。

近紅外光具有不容易被人體吸收的性質(zhì)，比紫外光及可見光有更深的組織穿透能力，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。將近紅外光引入到光動力治療中可以有效的解決傳統(tǒng)光敏劑制劑激發(fā)光穿透滲透有限的問題，從而可將光動力治療引入到深部腫瘤的治療。上轉(zhuǎn)換納米晶是一類利用近紅外光激發(fā)而短波長發(fā)射的納米熒光材料，它具有窄發(fā)射峰，較大的反Stokes位移，熒光穩(wěn)定性好，組織穿透能力深等優(yōu)點(diǎn)，是一種備受關(guān)注的新型熒光探針。利用雙親性高分子形成膠束將上轉(zhuǎn)換納米粒子和光敏劑包裹起來制備納米藥物載體，不但可以解決光敏劑水溶性差，激發(fā)光組織穿透能力低等缺點(diǎn)，還可以實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的熒光成像。所以，本文擬采用一種雙親性高分子將上轉(zhuǎn)換納米粒子及光敏劑包裹起來，構(gòu)建一種高穩(wěn)定性、高載藥量、多功能化的納米藥物遞送系統(tǒng)，為惡性腫瘤的光動力治療提供新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)并制備一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的納米藥物遞送系統(tǒng)，用于提高光敏劑藥物的穩(wěn)定性、載藥量和激發(fā)光組織穿透深度。我們采用超聲乳化法，用谷氨酸十八烷基季銨鹽將上轉(zhuǎn)換納米粒子從油相轉(zhuǎn)移到水相。然后利用納米沉淀法使雙親性嵌段聚合物聚苯乙烯-聚丙烯酸(PS-PAA，PS:PAA 70,000:13,000)自組裝形成膠束，將上轉(zhuǎn)換納米粒子和光敏劑包裹在膠束內(nèi)，形成一種載有光敏劑及上轉(zhuǎn)換納米粒子的載藥微球。該載藥微球不但解決了光敏劑酞菁鋅在體內(nèi)水溶性較差的問題，同時由于包裹了上轉(zhuǎn)換納米粒子，還可以用于深部腫瘤的熒光成像及光動力治療。本技術(shù)與現(xiàn)有的光敏劑納米藥物制劑相比，所制備的納米粒子粒徑更加均勻，載藥量更高。后期活性氧實(shí)驗(yàn)證明該聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球能夠在980nm近紅外激光照射下產(chǎn)生活性氧，具有很好的光動力治療效果。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種用于光動力治療的聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球的制備方法；其特征是步驟如下：

1)取10～15mg谷氨酸十八烷基季銨鹽溶解到1mL的去離子水中，作為水相A；

2)將1～2mL的上轉(zhuǎn)換納米顆粒的環(huán)己烷溶液進(jìn)行離心，沉淀重新分散于1mL三氯中形成油相B；

3)將水相A至于冰浴環(huán)境中，在超聲條件下，按照體積分?jǐn)?shù)比為油相B：水相A＝1:2～4，將油相B加入到水相A中形成水油均勻分散的乳液；然后將乳液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋蒸，當(dāng)有機(jī)溶劑完全蒸發(fā)后，即形成谷氨酸十八烷基季銨鹽修飾的上轉(zhuǎn)換納米粒子，此時溶液做為溶液C；

4)將1～2mg聚苯乙烯-聚丙烯酸共聚物溶解到1mL的四氫呋喃中形成溶液D；然后加入10～40μL的酞菁鋅四氫呋喃溶液，攪拌30min后，將100～200μL溶液C通過10μL/s的滴加方式，加入到溶液D中；

5)然后將3～5mL的去離子水滴加到溶液D中；滴加完畢后，體系攪拌1h；再將所得溶液加入透析袋中，純水透析12h；

6)透析完畢后，將產(chǎn)物離心除去，沉淀重新分散于于離子水中，所得樣品即為聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球。

所述的步驟4)中優(yōu)選酞菁鋅四氫呋喃溶液濃度為0.8～1mg/mL。

所述的步驟5)中3～5mL的去離子水滴加到溶液D中，優(yōu)選前期滴加速率為10μL/s，待體系變?yōu)椴煌该鲿r溶液時，滴加速率可變?yōu)?00μL/s。

所述的聚谷氨酸十八烷基季銨鹽溶液(水相A)的質(zhì)量濃度優(yōu)選為13～15mg/mL；所述的酞菁鋅四氫呋喃溶液優(yōu)選加入量為30～40μL；

制備得到的納米粒子的載藥率為8～18％，平均粒徑在60～120nm之間。

上述的谷氨酸十八烷基季銨鹽及上轉(zhuǎn)換納米粒子可以采用如下方法制備：

1)本發(fā)明所述的谷氨酸十八烷基季銨鹽(OQPGA)按照文獻(xiàn)報道的方式制得(Su W,Wang H,Sheng W,et al.PEG/RGD-modified magnetic polymeric liposomes for controlled drug release and tumor cell targeting[J].International Journal of Pharmaceutics,2012,426(1–2):170-181.)。具體為：將2g聚γ谷氨酸(γ-PGA)，研磨成粉狀，置于250mL四口燒瓶中，然后加入160mL異丙醇和10ml水進(jìn)行攪拌，緊接著加入1.6g二甲基十八烷基環(huán)氧丙基氯化銨(QA)，整個反應(yīng)維持在25℃下反應(yīng)48h。最后用分子量8000～14000的透析袋透析4天，得到的產(chǎn)物即為谷氨酸十八烷基季銨鹽(OQPGA)。

2)上述上轉(zhuǎn)換納米粒子采用文獻(xiàn)報道的溶劑熱法制得(Wang H,Liu Z,Wang S,et al.MC540and upconverting nanocrystal coloaded polymeric liposome for near-infrared light-triggered photodynamic therapy and cell fluorescent imaging.[J].Acs Applied Materials&Interfaces,2014,6(5):3219-3225.)上轉(zhuǎn)換納米粒子NaYF₄:Yb,Er具體合成步驟為800μL氯化鏡(1M)水溶液，200μL氯化憶(1M)水溶液和200μL氯化餌(0.1M)水溶液加入到三口燒瓶中，升溫到100℃蒸發(fā)稀土鹽溶液中的水分，直至變成白色固體。然后將溫度降到稍冷卻80℃，加入6mL油酸及15mL十八烯后，升溫到150℃使鹽溶液完全溶解。溫度再次降低到60℃，加入溶有100mg氫氧化鈉、100mg氟化鈉的5mL甲醇溶液。升高溫度，除去甲醇，最后將溫度升到120℃，抽真空20～30min。后體系通氬氣，反應(yīng)溫度維持在300℃反應(yīng)1h。最后經(jīng)過離心洗滌，產(chǎn)物即為NaYF₄:Yb,Er納米粒子。

有益效果

本發(fā)明制備的用于光動力治療的聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球的優(yōu)勢：

1)本發(fā)明采用將上轉(zhuǎn)換納米粒子包進(jìn)載光敏劑的聚苯乙烯-聚丙烯酸納米微中，有效解決了傳統(tǒng)光敏劑酞菁鋅由于激發(fā)波長穿透深度小，從而導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生效率低的缺點(diǎn)。

2)本發(fā)明所制備的聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球粒徑在60～120nm之間，粒徑均勻。通過納米粒子的被動靶向作用，可有效聚集于腫瘤組織，克服了傳統(tǒng)酞菁鋅制劑在體內(nèi)水溶性差，容易團(tuán)聚，不易到達(dá)腫瘤組織的缺點(diǎn)。

3)本發(fā)明制備的載藥微球載藥率可達(dá)18％，且制備過程簡單快捷、制備周期短，產(chǎn)率高，穩(wěn)定性好，適合大批量生產(chǎn)。

附圖說明

圖1：用于光動力治療的聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球的宏觀照片。

圖2：用于光動力治療的聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球的透射照片。

圖3：用于光動力治療的聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球的載藥量圖。

圖4：用于光動力治療的聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微的活性氧產(chǎn)生驗(yàn)證圖。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例中將對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。

實(shí)施例1：

1)取10mg谷氨酸十八烷基季銨鹽溶解到1mL的去離子水中，作為水相A；

2)將1mL的上轉(zhuǎn)換納米顆粒的環(huán)己烷溶液進(jìn)行離心，沉淀重新分散于1mL三氯中形成油相B；

3)將水相A至于冰浴環(huán)境中，在超聲條件下，按照體積分?jǐn)?shù)比為油相B：水相A＝1:2，將油相B加入到水相A中形成水油均勻分散的乳液；然后將乳液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋蒸，當(dāng)有機(jī)溶劑完全蒸發(fā)后，即形成谷氨酸十八烷基季銨鹽修飾的上轉(zhuǎn)換納米

粒子，此時溶液做為溶液C；

4)將1mg聚苯乙烯-聚丙烯酸共聚物溶解到1mL的四氫呋喃中形成溶液D。然后加入10μL的酞菁鋅四氫呋喃溶液(1mg/mL)，攪拌30min后，將100μL溶液C通過10μL/s的緩慢滴加方式，加入到溶液D中；

5)然后將3mL的去離子水通過滴加方式加入到上述所得溶液中。滴加速率為先慢后快，前期滴加速率為10μL/s，待體系變?yōu)椴煌该鲿r溶液時，滴加速率可變?yōu)?00μL/s。滴加完畢后，體系攪拌1h。再將所得溶液加入透析袋中，純水透析12h；

6)透析完畢后，將產(chǎn)物離心除去，沉淀重新分散于于離子水中，所得樣品即為聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球。制備得到的納米粒子的載藥率為8％，平均粒徑為80nm。

實(shí)施例2：

1)取12mg谷氨酸十八烷基季銨鹽溶解到1mL的去離子水中，作為水相A；

2)將1mL的上轉(zhuǎn)換納米顆粒的環(huán)己烷溶液進(jìn)行離心，沉淀重新分散于1mL三氯中形成油相B；

3)將水相A至于冰浴環(huán)境中，在超聲條件下，按照體積分?jǐn)?shù)比為油相B：水相A＝1:2，將油相B加入到水相A中形成水油均勻分散的乳液；然后將乳液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋蒸，當(dāng)有機(jī)溶劑完全蒸發(fā)后，即形成谷氨酸十八烷基季銨鹽修飾的上轉(zhuǎn)換納米粒子，此時溶液做為溶液C；

4)將1mg聚苯乙烯-聚丙烯酸共聚物溶解到1mL的四氫呋喃中形成溶液D。然后加入20μL的酞菁鋅四氫呋喃溶液(1mg/mL)，攪拌30min后，將100μL溶液C通過10μL/s的緩慢滴加方式，加入到溶液D中；

5)然后將4mL的去離子水通過滴加方式加入到上述所得溶液中。滴加速率為先慢后快，前期滴加速率為10μL/s，待體系變?yōu)椴煌该鲿r溶液時，滴加速率可變?yōu)?00μL/s。滴加完畢后，體系攪拌1h。再將所得溶液加入透析袋中，純水透析12h；

6)透析完畢后，將產(chǎn)物離心除去，沉淀重新分散于于離子水中，所得樣品即為聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球?？梢缘闹苽涞玫降募{米粒子的載藥率為13％，平均粒徑為120nm。圖1為按照實(shí)施例2制備的聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球的宏觀照片，制備載藥微球溶液呈藍(lán)色，當(dāng)受到980nm激光器照射時，可以發(fā)出綠色熒光。

實(shí)施例3：

1)取12mg谷氨酸十八烷基季銨鹽溶解到1mL的去離子水中，作為水相A；

2)將1.5mL的上轉(zhuǎn)換納米顆粒的環(huán)己烷溶液進(jìn)行離心，沉淀重新分散于1mL三氯中形成油相B；

3)將水相A至于冰浴環(huán)境中，在超聲條件下，按照體積分?jǐn)?shù)比為油相B：水相A＝1:2，將油相B加入到水相A中形成水油均勻分散的乳液；然后將乳液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋蒸，當(dāng)有機(jī)溶劑完全蒸發(fā)后，即形成谷氨酸十八烷基季銨鹽修飾的上轉(zhuǎn)換納米粒子，此時溶液做為溶液C；

4)將1mg聚苯乙烯-聚丙烯酸共聚物溶解到1mL的四氫呋喃中形成溶液D。然后加入20μL的酞菁鋅四氫呋喃溶液(1mg/mL)，攪拌30min后，將150μL溶液C通過10μL/s的緩慢滴加方式，加入到溶液D中；

5)然后將4mL的去離子水通過滴加方式加入到上述所得溶液中。滴加速率為先慢后快，前期滴加速率為10μL/s，待體系變?yōu)椴煌该鲿r溶液時，滴加速率可變?yōu)?00μL/s。滴加完畢后，體系攪拌1h。再將所得溶液加入透析袋中，純水透析12h；

6)透析完畢后，將產(chǎn)物離心除去，沉淀重新分散于于離子水中，所得樣品即為聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球。制備得到的納米粒子的載藥率為14％，平均粒徑為120nm。

實(shí)施例4：

1)取15mg谷氨酸十八烷基季銨鹽溶解到1mL的去離子水中，作為水相A；

2)將2mL的上轉(zhuǎn)換納米顆粒的環(huán)己烷溶液進(jìn)行離心，沉淀重新分散于1mL三氯中形成油相B；

3)將水相A至于冰浴環(huán)境中，在超聲條件下，按照體積分?jǐn)?shù)比為油相B：水相A＝1:3，將油相B加入到水相A中形成水油均勻分散的乳液；然后將乳液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋蒸，當(dāng)有機(jī)溶劑完全蒸發(fā)后，即形成谷氨酸十八烷基季銨鹽修飾的上轉(zhuǎn)換納米粒子，此時溶液做為溶液C；

4)將1.5mg聚苯乙烯-聚丙烯酸共聚物溶解到1mL的四氫呋喃中形成溶液D。然后加入30μL的酞菁鋅四氫呋喃溶液(1mg/mL)，攪拌30min后，將200μL溶液C通過10μL/s的緩慢滴加方式，加入到溶液D中；

5)然后將4mL的去離子水通過滴加方式加入到上述所得溶液中。滴加速率為先慢后快，前期滴加速率為10μL/s，待體系變?yōu)椴煌该鲿r溶液時，滴加速率可變?yōu)?00μL/s。滴加完畢后，體系攪拌1h。再將所得溶液加入透析袋中，純水透析12h；

6)透析完畢后，將產(chǎn)物離心除去，沉淀重新分散于于離子水中，所得樣品即為聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球。制備得到的納米粒子的載藥率為17％，平均粒徑為85nm。

實(shí)施例5：

1)取15mg谷氨酸十八烷基季銨鹽溶解到1mL的去離子水中，作為水相A；

2)將2mL的上轉(zhuǎn)換納米顆粒的環(huán)己烷溶液進(jìn)行離心，沉淀重新分散于1mL三氯中形成油相B；

3)將水相A至于冰浴環(huán)境中，在超聲條件下，按照體積分?jǐn)?shù)比為油相B：水相A＝1:4，將油相B加入到水相A中形成水油均勻分散的乳液；然后將乳液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋蒸，當(dāng)有機(jī)溶劑完全蒸發(fā)后，即形成谷氨酸十八烷基季銨鹽修飾的上轉(zhuǎn)換納米粒子，此時溶液做為溶液C；

4)將2mg聚苯乙烯-聚丙烯酸共聚物溶解到1mL的四氫呋喃中形成溶液D。然后加入40μL的酞菁鋅四氫呋喃溶液(1mg/mL)，攪拌30min后，將200μL溶液C通過10μL/s的緩慢滴加方式，加入到溶液D中；

5)然后將5mL的去離子水通過滴加方式加入到上述所得溶液中。滴加速率為先慢后快，前期滴加速率為10μL/s，待體系變?yōu)椴煌该鲿r溶液時，滴加速率可變?yōu)?00μL/s。滴加完畢后，體系攪拌1h。再將所得溶液加入透析袋中，純水透析12h；

6)透析完畢后，將產(chǎn)物離心除去，沉淀重新分散于于離子水中，所得樣品即為聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球。制備得到的納米粒子的載藥率為18％，平均粒徑為60nm。

實(shí)施例6：

形態(tài)觀察、粒徑其分布測定。

取樣品溶液經(jīng)9000轉(zhuǎn)離心15min后，將沉淀物重新分散于8mL蒸餾水中，取10μL滴于碳支持膜上制樣，在透射電鏡下觀察其形貌狀態(tài)并拍照。所制得的納米載藥微球如圖2所示。透射電鏡下可以清楚的看到聚苯乙烯-聚丙烯酸共聚物通過自組裝作用形成了納米微球，粒徑在60～120nm之間，上轉(zhuǎn)換納米粒子位于聚苯乙烯-聚丙烯酸微球的邊緣，微球中間用于裝載藥物。

實(shí)施例7：

載藥量的測定。

1)將聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球制劑凍干后，稱取一定質(zhì)量M；然后加入一定體積V的二甲基亞砜(DMSO)，使光敏劑酞菁鋅和高分子全部釋放出來；離心除去上轉(zhuǎn)換納米粒子，稱的質(zhì)量為M₁，則光敏劑酞菁鋅和高分子的總質(zhì)量為M₂＝M一M₁；

2)用紫外一可見吸收光譜測得光敏劑酞菁鋅吸光值A(chǔ)。根據(jù)光敏劑酞菁鋅濃度同吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出DMSO中酞菁鋅的濃度C；根據(jù)濃度C和DMSO的體積V，可以計(jì)算得到酞菁鋅的質(zhì)量M₃。

3)載藥率即可按照以下計(jì)算公式得到：

載藥率(％)＝酞菁鋅質(zhì)量/(酞菁鋅質(zhì)量+高分子質(zhì)量)*100％＝M₃/M₂*100％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，隨著光敏劑加入量的不斷增加，聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球的載藥量也逐漸增加。當(dāng)光敏劑加入量在10～40μL(1mg/mL)時，聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球的載藥量在8～18％之間。當(dāng)加入40μL光敏劑時，納米微球的載藥量達(dá)到最大值18％。

實(shí)施例8：

活性氧產(chǎn)生的驗(yàn)證。

光動力反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧可使9,10-蒽基-雙(亞甲基)二丙二酸(活性氧探針)在430nm處的熒光發(fā)生淬滅。故將實(shí)驗(yàn)所得的聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球至于石英皿中，加入200μL(10uM)9,10-蒽基-雙(亞甲基)二丙二酸(ABDA)溶液。將石英皿至于980nm激光器照射下照射10min，記錄隨著照射時間變化熒光值的變化情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，在0min時，活性氧探針9,10-蒽基-雙(亞甲基)二丙二酸的在430nm處的熒光值最高，為5000a.u.。當(dāng)聚苯乙烯-聚丙烯酸納米載藥微球受到980nm激光器照射時，活性氧探針在430nm處的熒光值隨著時間的增加不斷降低。10min后，其430nm處的熒光值降為2000a.u.?；钚匝跆结槦晒怆S時間淬滅是因?yàn)樯限D(zhuǎn)換納米粒子吸收了980nm激光器發(fā)出的近紅外光，并將其轉(zhuǎn)換為光敏劑可吸收的波長。光敏劑受到激發(fā)后同空氣中氧分子反應(yīng)產(chǎn)生了活性氧，從而使得9,10-蒽基-雙(亞甲基)二丙二酸熒光發(fā)生淬滅。

述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。