本發(fā)明屬于粒毛盤菌黑色素在藥物制備中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及菌種保藏編號(hào)為CCTCC No:M 2011054的粒毛盤菌的胞內(nèi)黑色素(簡稱LIM)作為抗腎衰藥物的用途。

背景技術(shù)：

黑色素一般存在動(dòng)植物和微生物體內(nèi)，它不僅是一類光保護(hù)劑、抗輻射劑、鰲合劑、生物抗氧化劑和免疫促進(jìn)劑,具有抗蛇毒、抗癌、抑制艾滋病毒復(fù)制、治療帕金森癥等作用,因此黑色素在醫(yī)藥、化妝品、食品等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。如中國《食品科學(xué)》(2009,30(17):185-189)、《中國食品添加劑》(2007(2):116-119)及《中國食品學(xué)報(bào)》(2012,12(10):62-66)分別介紹了粒毛盤菌黑色素、葡萄皮色素以及烏賊墨黑色素作為抗氧化物質(zhì)的用途。《微生物學(xué)通報(bào)》(2014,41(2):334-343)介紹了細(xì)菌黑色素具有抗紫外輻射、清除自由基等功能，對(duì)于生物的生長發(fā)育雖非必需，卻能極大提高生物體的生存競爭能力。據(jù)《公共科學(xué)圖書館》(Public Library of Science)(2013,8(2):181-182)文獻(xiàn)報(bào)道，慢性腎功能衰竭與腎組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。中國專利號(hào)ZL201110072469.2公開了本發(fā)明人課題組保藏日期2011年3月2日保藏在位于武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)的一種菌種保藏編號(hào)為CCTCC No:M 2011054的粒毛盤菌(Lachnum)。該粒毛盤菌屬(Lachnum)隸屬于柔膜菌目(Helotiales)晶杯菌科(Hyaloscyphaceae)，是一類腐生性真菌，其深層發(fā)酵可產(chǎn)生大量的黑色素。目前國內(nèi)外未見有公開文獻(xiàn)提及將粒毛盤菌黑色素作為制備抗腎衰藥物的應(yīng)用方面的報(bào)道。

目前國內(nèi)外報(bào)道的關(guān)于慢性腎衰藥物的研究主要是中藥，未見對(duì)粒毛盤菌黑色素作為慢性腎衰治療藥物方面研究的報(bào)道。據(jù)《現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志》(2014,23(2):217-220)報(bào)道，近年來慢性腎衰的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，增長速度加快，趨勢十分嚴(yán)峻。挖掘與開發(fā)天然、有效的抗腎衰藥物，對(duì)預(yù)防和治療慢性腎衰具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種菌種保藏編號(hào)為CCTCC No:M 2011054的粒毛盤菌的胞內(nèi)黑色素(簡稱LIM)作為制備抗腎衰藥物的用途。

本發(fā)明的粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素(簡稱LIM)在制備抗腎衰藥物中的用途，其 特征在于：所述粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素，是將菌種保藏編號(hào)為CCTCC No:M 2011054的粒毛盤菌接種于100L發(fā)酵罐，培養(yǎng)基成分為：酪氨酸濃度為1.0mmol/L，銅離子濃度為1.1mmol/L，葡萄糖質(zhì)量為25.0g/L，酵母膏5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，pH 8.0，培養(yǎng)溫度為27℃，裝料系數(shù)體積比為0.7，接種量為5％(v/v)，通氣量為1.0L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為180r/min，發(fā)酵12d后獲得發(fā)酵液；將發(fā)酵液抽濾，收集菌絲體，50℃烘干，按菌絲體的質(zhì)量(g)與濃度為1mol/L的氫氧化鈉(mL)比為1:100混勻，室溫靜置12h，抽濾得浸提液；向上述浸提液加入1mol/LHCl調(diào)節(jié)pH為1～2，靜置12h后將上述懸浮液離心，所得到的沉淀經(jīng)去離子水洗滌至pH為7后，真空冷凍干燥，即得黑色素粗品；再將該黑色素粗品加入7mol/L HCl于100℃酸解2h，除去與黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)及碳水化合物，酸解后抽濾得到的沉淀經(jīng)雙蒸水洗滌至上清液pH值為7時(shí)重新溶于1mol/L NH₃·H₂O溶液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去NH₃至溶液pH為中性后，依次經(jīng)乙酸乙酯、氯仿、無水乙醇萃取，除去脂類物質(zhì)，萃取后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相，水相調(diào)pH值為2，以4500r/min離心15min，分離得到的沉淀經(jīng)去離子水反復(fù)洗滌至上清液Cl–定性檢測為陰性后，真空冷凍干燥，得到粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素LIM；通過將其對(duì)腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性腎衰小鼠的藥理實(shí)驗(yàn)，確立粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素LIM具有抗慢性腎衰作用；從而按藥劑學(xué)的常規(guī)制備方法，將有效量的該粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素LIM與藥用輔料混合加工制備成口服片劑或膠囊服用。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：經(jīng)藥效學(xué)證明，該粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素LIM可顯著降低腎衰小鼠血清肌酐(SCR)、尿素氮水平(BUN)，增加血清總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)含量，提高腎組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)的水平，降低丙二醛(MDA)含量以及降低炎性因子：腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的表達(dá)以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)水平，改善腎衰患者腎組織形態(tài)的病理改變，且呈一定的量效關(guān)系。粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素LIM表現(xiàn)出明顯的抗腎衰功能，且無毒副作用，因此可以用于制備抗腎衰藥物?？筛鶕?jù)需要按藥劑學(xué)的常規(guī)制備方法，制成各類劑型，服用方便。

附圖說明

圖1為小鼠腎臟組織病理學(xué)檢查照片(400×)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

(一)粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素(LIM)的制備

將菌種保藏編號(hào)為CCTCC No:M 2011054的粒毛盤菌接種于100L發(fā)酵罐，培養(yǎng)基成分為：酪氨酸濃度為1.0mmol/L，銅離子濃度為1.1mmol/L，葡萄糖質(zhì)量為25.0g/L，酵母膏5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，pH 8.0，培養(yǎng)溫度為27℃，裝料系數(shù)體積比為0.7，接種量為5％(v/v)，通氣量為1.0L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為180r/min，發(fā)酵12d后獲得發(fā)酵液；將發(fā)酵液抽濾，收集菌絲體，50℃烘干，按菌絲體的質(zhì)量(g)與濃度為1mol/L的氫氧化鈉(mL)比為1:100混勻，室溫靜置12h，抽濾得浸提液；向上述浸提液加入1mol/LHCl調(diào)節(jié)pH為1～2，靜置12h后將上述懸浮液離心，所得到的沉淀經(jīng)去離子水洗滌至pH為7后，真空冷凍干燥，即得黑色素粗品；再將該黑色素粗品加入7mol/L HCl后于100℃酸解2h，除去與黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)及碳水化合物。酸解后，抽濾得沉淀，沉淀經(jīng)雙蒸水洗滌至上清液pH值為7時(shí)重新溶于1mol/L NH₃·H₂O溶液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去NH₃至溶液pH為中性后，依次經(jīng)乙酸乙酯、氯仿、無水乙醇萃取，以除去脂類物質(zhì)，萃取后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相，水相調(diào)pH值為2，以4500r/min離心15min，分離得到的沉淀經(jīng)去離子水反復(fù)洗滌至上清液Cl–定性檢測為陰性后，真空冷凍干燥，即得到粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素LIM。

(二)粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素LIM的抗腎衰作用藥理實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物：昆明小鼠100只，體重20±2g，生長環(huán)境：溫度23±2℃，濕度55±5％，12h的光照和12h的黑暗交替飼養(yǎng)。

試劑盒：血肌酐(SCR)、尿素氮(BUN)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)，為南京建成科技有限公司產(chǎn)品。

陽性藥物：海昆腎喜膠囊(HC)，為輝南長龍生化藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。

方法：把100只昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，隨機(jī)取10只正常小鼠設(shè)為正常組，生理鹽水灌胃10mL/Kg，其余小鼠給予每公斤飼料含10克腺嘌呤的膳食，連續(xù)3個(gè)星期，檢測小鼠SCR和BUN含量。小鼠SCR含量高于115mM/L和BUN含量高于8.05mM/L時(shí)表示慢性腎衰動(dòng)物模型建立成功。取建模成功小鼠隨 機(jī)分為6組，每組10只，分別為：模型組(生理鹽水10mL/kg)、陽性組(150mg/Kg)、LIM低劑量組(100mg/Kg)、LIM高劑量組(200mg/kg)，LIM+海昆腎喜膠囊低劑量組(100mg/Kg)、LIM+海昆腎喜膠囊高劑量組(200mg/Kg)，連續(xù)給藥28天。

灌胃結(jié)束后，摘眼球取血，3000rpm離心5min取血清，脫頸椎處死，取雙側(cè)腎臟，準(zhǔn)確稱取小鼠腎組織重量，按重量(g):體積(mL)＝1:10的比例加入勻漿介質(zhì)(0.9％的生理鹽水)，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，3000r·min^-1離心10min，取上清得10％組織勻漿液，分別測定勻漿液中SOD、GSH-PX、CAT、GSH和MDA的含量。按照試劑盒說明書方法檢測。另取單側(cè)腎臟，置10％福爾馬林溶液中固定，O.C.T.包埋劑包埋、切片，蘇木精和伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

利用試劑盒測定血清中生化指標(biāo)以及腎組織勻漿中氧化酶及炎性因子活性，包括BUN、SCR、TP、ALB、SOD、GSH、GSH-PX、MDA、CAT、TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS，按試劑盒說明書方法檢測。

(三)結(jié)果

(1)LIM對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠血清SCR和BUN的水平顯著升高，如前所述,表明慢性腎衰小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒊晒?。相比于模型?duì)照組，治療組SCR和BUN水平不同程度降低。此外，在相同劑量下，海昆腎喜膠囊與LIM聯(lián)合組小鼠的SCR和BUN含量顯著高于LIM和海昆腎喜膠囊單獨(dú)治療組。

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠血清中TP和ALB水平顯著降低，相比于模型對(duì)照組，治療組小鼠的TP和ALB水平均有不同程度增加。海昆腎喜膠囊和LIM聯(lián)合組小鼠的TP和ALB水平均高于LIM和海昆腎喜膠囊單獨(dú)組，相同劑量下，海昆腎喜膠囊與LIM聯(lián)合組小鼠的TP和ALB水平接近于正常小鼠。所有的結(jié)果都呈劑量依賴關(guān)系。

表1 LIM對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響

注：與模型組相比，^ap<0.05，^bp<0.01。

(2)LIM對(duì)慢性腎衰小鼠體重的增長速度和腎臟指數(shù)的影響

正常對(duì)照組小鼠體重的增長速度權(quán)重增加了57.34％，模型對(duì)照組小鼠的增長速度遞增32.42％，這是增加最少的，相對(duì)于其他分組。這表明慢性腎衰小鼠模型已成功建立。然而，相對(duì)于正常對(duì)照組時(shí)，其他組小鼠體重的增長速度沒有表現(xiàn)出明顯的差異。相比于模型對(duì)照組，LIM單獨(dú)治療小鼠的體重增長速度明顯提高。LIM與陽性藥物聯(lián)合治療組的體重增長率幾乎與正常對(duì)照組相同，這可能是由于LIM增強(qiáng)了陽性藥物的治療效果。

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組腎臟指數(shù)均顯著增加，與模型對(duì)照組相比，治療組的腎臟指數(shù)均顯著減少，這證實(shí)了LIM對(duì)慢性腎衰有保護(hù)作用。而且，不同劑量的LIM單獨(dú)治療組和LIM與海昆腎喜膠囊聯(lián)合治療組處理的小鼠的腎臟指數(shù)呈劑量依賴性增加。此外，我們發(fā)現(xiàn)，LIM與陽性藥物聯(lián)合治療組的腎臟指數(shù)明顯低于LIM和陽性藥物單獨(dú)治療組。

表2 LIM對(duì)慢性腎衰小鼠體重的增長速度和腎臟指數(shù)的影響

注：與模型組相比，^ap<0.05，^bp<0.01。

(3)LIM對(duì)慢性腎衰小鼠腎組織勻漿氧化指標(biāo)的影響

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)腎臟疾病與生物體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)和活性氧的產(chǎn)生密切相關(guān)。SOD、GSH-PX、CAT、和GSH能清除自由基、抑制自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)以及降低脂質(zhì)過氧化水平，緩解小鼠慢性腎衰竭進(jìn)程。MDA含量高低可間接反映出機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。在小鼠腎組織勻漿中，與模型組相比，低、高劑量的LIM組小鼠的SOD、 GSH-PX、CAT和GSH含量均顯著增加，MDA含量明顯降低，同劑量的LIM與海昆腎喜膠囊聯(lián)合治療組小鼠的SOD、GSH-PX、CAT和GSH含量明顯高于LIM和海昆腎喜膠囊單獨(dú)治療組，而MDA含量低于LIM和海昆腎喜膠囊單獨(dú)治療組，表明LIM能顯著提高小鼠腎組織勻漿中的SOD、GSH-PX、CAT和GSH含量，降低MDA含量，且可增強(qiáng)海昆腎喜膠囊對(duì)慢性腎衰的治療效果。

表3 LIM對(duì)慢性腎衰小鼠腎組織勻漿氧化指標(biāo)的影響

注：與模型組相比，^ap<0.05，^bp<0.01。

(4)LIM對(duì)慢性腎衰小鼠腎組織勻漿炎性因子水平的影響

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠腎組織勻漿的TNF-α，IL-1β，IL-6的水平以及iNOS活動(dòng)顯著增加。與模型對(duì)照組相比，LIM及海昆腎喜膠囊治療組TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的活性均顯著降低，高劑量的LIM和海昆腎喜膠囊聯(lián)合治療組的治療效果明顯優(yōu)于海昆腎喜膠囊和LIM單獨(dú)治療組，且都呈劑量依賴的關(guān)系，說明LIM具有緩解炎癥反應(yīng)的生物活性。

表4 LIM對(duì)慢性腎衰小鼠腎組織勻漿炎性因子水平的影響

注：與模型組相比，^ap<0.05，^bp<0.01。

(5)小鼠腎臟組織病理學(xué)觀察

圖1為各組實(shí)驗(yàn)小鼠腎臟組織病理學(xué)檢查照片(400×)。觀察圖1發(fā)現(xiàn)；正常組小鼠腎小球和腎小管的排列緊湊，無變性壞死。模型組小鼠腎臟組織中有大量氣泡，幾乎沒有正常的腎小球和腎小管。低、高劑量的LIM組小鼠腎臟組織中均可見到少量完整的腎小球和腎小管。低、高劑量的LIM和海昆腎喜膠囊聯(lián)合治療組小鼠腎臟組織中完整的腎小球和腎小管數(shù)目比同劑量的LIM和海昆腎喜膠囊單獨(dú)治療組多，且高劑量的LIM和海昆腎喜膠囊聯(lián)合治療組小鼠腎臟組織腎小管腫脹及官腔擴(kuò)張程度最小，間質(zhì)炎細(xì)胞的浸潤程度較輕。顯然，LIM能改善腎臟病理組織狀態(tài)，且能加強(qiáng)海昆腎喜膠囊腎臟組織的改善效果。

藥效學(xué)證明，菌種保藏編號(hào)為CCTCC No:M 2011054的粒毛盤菌所產(chǎn)生的胞內(nèi)黑色素LIM可顯著降低小鼠的血清SCR、BUN、水平，升高TP和ALB含量，且呈一定的量效關(guān)系；且可提高其血清中SOD活性，降低MDA含量，減少炎性因子TNF-α等水平。表現(xiàn)出明顯的抗腎衰功能，因此它能用于制備抗腎衰藥物。粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素LIM幾乎無毒副作用，可根據(jù)需要制成各類劑型，服用方便。

(四)粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素LIM制劑的加工

1、片劑加工

取500g粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素LIM、稀釋劑糊精240g、助流劑滑石粉50g，混合均勻后加400mL乙醇混合均勻制得軟材，軟材過篩得到濕顆粒，干燥后整粒，最后加入潤滑劑硬脂酸鎂10g混勻后壓片，制成1000片，片重0.8g，黑色素含量0.5g/片。

2、膠囊劑加工

取稀釋劑干淀粉250g，助流劑滑石粉45g，潤濕劑十二烷基硫酸鈉5g混合均勻與500g粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素LIM混合均勻后裝1^#空心膠囊1000粒，黑色素含量0.5g/粒。加400mL乙醇混合均勻制得軟材，軟材過篩得到濕顆粒，干燥后整粒，最后加入潤滑劑硬脂酸鎂10g混勻后壓片，制成1000片，片重0.8g，黑色素含量0.5g/片。