本發(fā)明屬于組織工程生物材料制備技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種海藻酸/PEDOT導(dǎo)電多孔支架及其制備方法。

背景技術(shù)：

心血管病是危害人類健康及生命的主要疾患之一，其中以心肌梗死最為常見，我國心肌梗死發(fā)病率明顯上升且呈現(xiàn)年輕化趨勢。近年來的研究表明，以生物材料、種子細(xì)胞和生長因子為基本要素的心肌組織工程可在一定程度上修復(fù)受損心肌、恢復(fù)心功能，已經(jīng)成為一種潛在的治療心肌梗死的新方法。其中生物材料其非常關(guān)鍵的作用，可為受損心肌的修復(fù)提供必要的力學(xué)支撐，并為移植和宿主細(xì)胞的存活和增殖提供適宜的微環(huán)境。目前用于心肌組織工程的水凝膠主要包括，明膠、海藻酸鈉、纖維蛋白、Matrigel和膠原等。上述材料制備的支架材料均可與多種細(xì)胞(例如，心肌細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等)聯(lián)合構(gòu)建具有心肌修復(fù)功能的工程化心肌組織，用于修復(fù)受損心肌。盡管如此，在設(shè)計這些支架材料時沒有考慮心肌的電活性本質(zhì)，使其與宿主心肌之間的整合受到一定程度的影響。導(dǎo)電多孔支架是解決該問題的主要途徑之一。

近年來，電導(dǎo)活性支架材料作為智能水凝膠家族的一員受到了人們廣泛的關(guān)注，在生物傳感器、藥物釋放、電活性開關(guān)裝置以及組織工程中具有潛在的應(yīng)用前景。特別是基于導(dǎo)電高分子的水凝膠及支架材料由于其優(yōu)良的導(dǎo)電性能和生物相容性，受到越來越多的關(guān)注。但是，由于導(dǎo)電聚合物的溶解性能較差(聚吡咯和聚噻吩均不溶于水和大部分有機溶劑)，致使其形成水凝膠的能力較差，生物降解性以及與心肌修復(fù)的匹配性還有待進一步提高，使其在心肌組織工程中應(yīng)用的受到一定的限制。為了改善這些缺點，研究學(xué)者們采用兩步法制備了雙網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)電水凝膠，該類水凝膠具有優(yōu)良的導(dǎo)電特性，但是其制備過程復(fù)雜，更為重要的是導(dǎo)電高分子在雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠中的分布不均且含量不容易控制，可操作性差。為了研制一種具有良好生物相容性、優(yōu)良力學(xué)性能、導(dǎo)電特性的水凝膠多孔支架材料對心肌組織工程策略修復(fù)受損心肌具有十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種工程化心肌組織構(gòu)建用多孔導(dǎo)電支架材料。

本發(fā)明的目的還在于提供上述導(dǎo)電多孔支架材料的制備方法。

一種海藻酸/PEDOT導(dǎo)電多孔支架，該支架材料是以共價交聯(lián)的海藻酸網(wǎng)絡(luò)為基材，以及在海藻酸網(wǎng)絡(luò)中原位形成的PEDOT顆粒組合而成，該支架中的海藻酸網(wǎng)絡(luò)和PEDOT顆粒質(zhì)量比為1:(1-10)。

上述海藻酸/PEDOT導(dǎo)電多孔支架的制備方法，按照如下步驟進行：

(1)將海藻酸鈉溶解到N-嗎啉代乙磺酸-氯化鈉的水溶液中，配制質(zhì)量濃度為3％、4％、5％、6％和7％的海藻酸鈉溶液，備用；

(2)在步驟(1)制備的海藻酸鈉溶液中加入3,4-乙烯二氧噻吩單體，使3,4-乙烯二氧噻吩單體與海藻酸鈉的質(zhì)量比為(1-10)：1，用渦旋儀充分混勻，得到3,4-乙烯二氧噻吩/海藻酸鈉的乳狀液，備用。

(3)根據(jù)海藻酸鈉的羧基含量向步驟(2)制備的混合液中其中加入己二酸二酰肼，使ADH：COO^-的物質(zhì)的量比為0.5:1，充分溶解后，再在其中加入EDC、NHS和過硫酸銨，其中EDC：NHS：COO^-的摩爾比為1:0.5:1，而過硫酸銨的加入量為EDOT單體質(zhì)量的兩倍，利用漩渦震蕩充分混勻后，將混合溶液倒入到四氟乙烯模具中，室溫放置1-3h后，形成海藻酸/PEDOT水凝膠；

(4)將步驟(3)制備的水凝膠浸泡在去離子水、乙醇及去離子水中依次浸泡4-5小時；

(5)將步驟(4)處理過的水凝膠置于-45℃冰箱中預(yù)凍12小時以上，然后將其置于凍干機中冷凍干燥48h，獲得海藻酸/PEDOT導(dǎo)電多孔支架。

所述海藻酸/PEDOT導(dǎo)電多孔支架的電導(dǎo)率為1-6×10^-2S·cm^-1。

上述的海藻酸/PEDOT導(dǎo)電多孔支架的用途，所述海藻酸/PEDOT導(dǎo)電多孔支架支持細(xì)胞的粘附和生長，并能促進棕色脂肪干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明制備的多孔導(dǎo)電支架材料通過同步原位聚合和化學(xué)交聯(lián)的方式制備，該制備方法免除了有機溶劑的參與，具有一定的環(huán)境友好性，減少了由于合成過程而造成的支架生物相容性降低的缺點。PEDOT的引入明顯增強了支架的導(dǎo)電特性，其疏水性本質(zhì)使其蛋白吸附能力得到明顯增強。制備的多孔支架具有合適的孔隙率，孔徑在100-200μm之間。本發(fā)明的制備的導(dǎo)電多孔支架具有良好的生物相容性，能夠支持多種細(xì)胞的粘附與生長。特別是可以促進棕色脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，電刺激可促進這種促進效果。該方法制備的生物醫(yī)用導(dǎo)電多孔支架材料在心肌組織工程中具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1不同PEDOT/海藻酸比例的多孔支架的掃描電鏡照片：PEDOT/海藻酸比例為(a)7:3,(b)4:6,(c)5:5,(d)6:4,(e)7:3and(f)0:10。

圖2 BADSCs在支架材料中的增殖行為PEDOT/Alg1,3,5分別為PEDOT/Alg比例為7:3,5:5和3:7，Alg為純海藻酸支架。

圖3 BADSCs在支架材料中心肌特異性cTnT蛋白表達；(A)(D)為PEDOT/海藻酸比例為7:3，(B)(E)為PEDOT/海藻酸比例為5:5，(C)(F)為PEDOT/海藻酸比例為3:7。ES-：為不施加電刺激，ES+：施加電刺激。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護范圍并不受具體實施方式的限制。

實施所用的主要原料為海藻酸鈉、3,4-乙烯二氧噻吩、過硫酸銨、碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N-嗎啉代乙磺酸、己二酸二酰肼(ADH)等均為化學(xué)純。

實施例1PEDOT/海藻酸比例為5:5的多孔支架制備

(1)稱取50mg的海藻酸鈉，溶于1ml N-嗎啉代乙磺酸-氯化鈉的水溶液中，充分溶解，備用。

(2)在步驟(1)制備的海藻酸鈉溶液中加入50mg的3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)單體，用渦旋儀充分混勻，得到EDOT/海藻酸鈉的乳狀液，備用。

(3)根據(jù)海藻酸鈉的羧基含量向步驟(2)制備的混合液中其中加入20.2mg的己二酸二酰肼(ADH)。充分溶解后，再在其中依次加入44.3mg EDC、11.3mg NHS和100mg過硫酸銨。利用漩渦震蕩充分混勻后，將混合溶液倒入到四氟乙烯模具中，室溫放置1后，形成海藻酸/PEDOT水凝膠。

(4)將步驟(3)制備的水凝膠浸泡在去離子水、乙醇及去離子水中依次浸泡4小時。

(5)將步驟(4)處理過的水凝膠置于低溫冰箱中(-45℃)預(yù)凍12小時以上，然后將其置于凍干機中冷凍干燥48h，獲得海藻酸/PEDOT質(zhì)量比為5:5的導(dǎo)電多孔支架。

實施例2PEDOT/海藻酸比例為7:3的多孔支架制備

(1)稱取30mg的海藻酸鈉，溶于1ml N-嗎啉代乙磺酸-氯化鈉的水溶液中，充分溶解，備用。

(2)在步驟(1)制備的海藻酸鈉溶液中加入70mg的3,4-乙烯二氧噻吩(EDOT)單體，用渦旋儀充分混勻，得到EDOT/海藻酸鈉的乳狀液，備用。

(3)根據(jù)海藻酸鈉的羧基含量向步驟(2)制備的混合液中其中加入12.1mg的己二酸二酰肼(ADH)。充分溶解后，再在其中依次加入26.6mg EDC、7.98mg NHS和140mg過硫酸銨。利用漩渦震蕩充分混勻后，將混合溶液倒入到四氟乙烯模具中，室溫放置1后，形成海藻酸/PEDOT水凝膠。

(4)將步驟(3)制備的水凝膠浸泡在去離子水、乙醇及去離子水中依次浸泡4小時。

(5)將步驟(4)處理過的水凝膠置于低溫冰箱中(-45℃)預(yù)凍12小時以上，然后將其置于凍干機中冷凍干燥48h，獲得PEDOT/海藻酸質(zhì)量比為7:3的導(dǎo)電多孔支架，該支架具有良好的空間結(jié)構(gòu)(圖1)。

實施例3導(dǎo)電多孔支架材料的生物相容性實驗

(1)將支架裁剪成直徑為10mm，厚度為2mm的薄片，Co60輻射滅菌，備用。

(2)將6×10⁵棕色脂肪干細(xì)胞BADSCs種植多孔支架材料中，在37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)，1，4，7和10天時，在其中加入含10％染液的無酚紅培養(yǎng)基，孵育12h，設(shè)置空孔板加染液為對照組。將染液吸出用酶標(biāo)儀檢測其在570nm和610nm處的吸光度值。計算還原率表征細(xì)胞活力(如圖2所示)。

實施例4導(dǎo)電多孔支架材料對BADSCs向心肌細(xì)胞分化的調(diào)控作用實驗

(1)將支架裁剪成直徑為10mm，厚度為2mm的薄片，Co60輻射滅菌，備用。

(2)將6×10⁵棕色脂肪干細(xì)胞BADSCs種植多孔支架材料中，在37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)，在施加和不施加電刺激的條件下。電刺激參數(shù)為電壓1V，頻率1Hz。

(3)培養(yǎng)10天時，切片且進行cTnT免疫熒光染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該支架材料能夠促進BADSCs向心肌細(xì)胞分化，電刺激可明顯增強該效果(圖3)。

以上公開的僅為本發(fā)明的具體實施例，但是，本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思之的變化都應(yīng)落入本發(fā)明的保護范圍。