本發(fā)明涉及生物納米材料領(lǐng)域，具體涉及一種葉酸分子靶向且酸敏響應(yīng)的羥磷灰石納米藥物復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是危害全人類健康的最主要疾病之一。目前全球每年新發(fā)癌癥患者高達一千多萬，死亡六百多萬，其危害的嚴重性和治療的艱巨性已引起許多國家公眾、政府和科學(xué)界的極大重視。發(fā)展能夠更加有效地治療這類疾病的手段，對促進人類健康具有重大意義。

抗癌藥物化療是除手術(shù)之外最重要的癌癥治療手段。目前多數(shù)小分子抗癌藥水溶性較差，臨床上通常使用表面活性劑對其進行乳化，但血液穩(wěn)定性較差，基本上不具有緩釋或控釋性能，而且具有血液半衰期短、毒副作用大等眾多缺點。因此，研究新型的高效藥物運輸載體已成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。其中，羥磷灰石納米藥物載體以其優(yōu)異的生物化學(xué)性能和應(yīng)用發(fā)展?jié)摿?，不斷吸引業(yè)界的廣泛關(guān)注。

通常，實現(xiàn)活性腫瘤靶向的方法主要包括瘤內(nèi)注射和載體修飾兩大類。瘤內(nèi)注射雖然簡便，大多數(shù)情況下由于實際腫瘤部位無法精確探知，所以并不適用。目前，更多是用能夠識別癌細胞膜上特定分子信號的特殊配體來修飾藥物載體外層，主要包括葉酸、縮氨酸(如環(huán)狀五肽cRGD)、鐵傳遞蛋白和某些抗體。與其他靶向分子相比，葉酸相對分子質(zhì)量小，無免疫原性，價廉易得，穩(wěn)定性好，與藥物或載體之間的化學(xué)鍵結(jié)合簡單易行。故葉酸是靶向適配分子較為理想的選擇。

葉酸(folic acid,FA)又稱蝶酰谷氨酸、維生素B11，是一種人體必需的維生素，在細胞內(nèi)可還原為四氫葉酸，后者是一碳單位轉(zhuǎn)移酶的輔酶，參與一碳單位代謝和嘌呤、胸腺嘧啶的合成，是細胞代謝、DNA合成及修復(fù)的基本組成成分。腫瘤細胞的快速生長需要充足的葉酸以維持DNA的合成。動物細胞內(nèi)缺少合成葉酸的酶，細胞的生長和增殖依賴從外界環(huán)境獲得葉酸。葉酸受體(folate receptor,FR)是細胞膜表面糖基化磷脂?；?GPI)錨定的糖化多肽，包括三種異構(gòu)體：α-FR、β-FR、γ-FR。β-FR是細胞膜相關(guān)蛋白，通過GPI錨定在細胞膜上，二者具有70％的同源性。α-FR和γ-FR缺少修飾GPI錨附著的羧基末端信號肽，組成上屬于分泌型蛋白。葉酸受體有三個顯著特點：(1)FR與游離葉酸的親和力非常高，解離常數(shù)Kd＜1nmol/L；(2)FR對葉酸分子通過化學(xué)鍵與其他大分子物質(zhì)連接形成的復(fù)合物的親和力和胞吞效應(yīng)與游離葉酸相當(dāng)，具有良好的入胞轉(zhuǎn)運潛能；(3)FR對葉酸及其衍生物的結(jié)合、轉(zhuǎn)運是特異的受體-配體結(jié)合，并能被游離葉酸競爭抑制。葉酸與受體結(jié)合，通過內(nèi)化方式通過細胞膜，是葉酸進入細胞內(nèi)的主要途徑。葉酸受體在正常組織中的表達高度保守，只在腎、肺、脈絡(luò)膜、胎盤中有低到中等水平表達，且以β亞型為主。但在大部分惡性腫瘤細胞中，如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、非小細胞肺癌、結(jié)腸癌和鼻咽癌等均高度表達，有時可比正常組織高出100-300倍。葉酸受體轉(zhuǎn)運機制如下：外源性的葉酸復(fù)合物與細胞膜表面的葉酸受體特異性結(jié)合，周圍形成凹陷，進入細胞內(nèi)形成內(nèi)涵體。在核體內(nèi)質(zhì)子泵的作用下，內(nèi)涵體內(nèi)部的pH由7下降至5，使復(fù)合物構(gòu)象改變，葉酸修飾的藥物從復(fù)合物上解離，釋放到細胞內(nèi)，而葉酸受體可以再回到細胞膜表面，循環(huán)轉(zhuǎn)運藥物。

由于隨著生物體內(nèi)pH的變化，有機藥物載體如脂質(zhì)體、聚合微球等不穩(wěn)定，易發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，不能有效進行藥物釋放。所以以無機納米材料作為藥物載體用于靶向藥物輸送系統(tǒng)，近年來得到迅猛發(fā)展。無機藥物載體如二氧化硅、四氧化三鐵等雖然藥物負載能力高，化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性好，但若在體內(nèi)過量積聚，會對正常組織造成損傷，目前已有文獻報道體內(nèi)過量積聚的二氧化硅對肺和肝的損傷尤為明顯。而羥磷灰石(HAP)是脊椎動物骨骼和牙齒的主要無機組成成分，具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性、安全低毒、穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)和載藥性廣等優(yōu)點。此外，在酸性條件下(pH3.5-6)，羥磷灰石易水解，且對正常細胞無毒副作用，是一種有潛力的藥物載體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種葉酸分子靶向且酸敏響應(yīng)性的羥磷灰石納米藥物載體，用于靶向表面葉酸受體過表達的腫瘤細胞，從而實現(xiàn)抗癌藥物的緩慢靶向釋放。

本發(fā)明首先公開一種葉酸修飾的載藥羥基磷灰石(FA@D@HAP)的制備方法，所述的方法包括：首先制備載藥羥基磷灰石(D@HAP)，并以硅烷偶聯(lián)劑或氨基聚合物對其進行表面氨基化處理的步驟，以及以葉酸對所述表面氨基化的載藥羥基磷灰石進行修飾的步驟。

本發(fā)明目的亦包括提供以上述方法所制備得到的葉酸修飾的載藥羥基磷灰石。

由上述本發(fā)明的方法制備的表面修飾葉酸的納米藥物載體，其作用在于葉酸受體在大多數(shù)腫瘤中高度表達，而葉酸受體同葉酸衍生物及游離葉酸的親和力均很強，葉酸衍生物與受體結(jié)合，并可通過內(nèi)吞方式穿過細胞膜，從而靶向表面葉酸受體過表達的腫瘤細胞，實現(xiàn)抗癌藥物的緩慢靶向釋放。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的葉酸修飾的載藥羥基磷灰石在如下幾個方面都有突出的優(yōu)勢：(1)由于隨著生物體內(nèi)pH的變化，有機藥物載體如脂質(zhì)體、聚合微球等不穩(wěn)定，易發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，不能有效進行藥物釋放。無機藥物載體如二氧化硅、四氧化三鐵等雖然藥物負載能力高，化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性好，但若在體內(nèi)過量積聚，會對正常組織造成損傷。而羥磷灰石(HAP)是脊椎動物骨骼和牙齒的主要無機組成成分，具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性、安全低毒、穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)和載藥性廣等優(yōu)點。此外，在酸性條件下(pH3.5-6)，羥磷灰石易水解，且對正常細胞無毒副作用，是一種有潛力的藥物載體。(2)本發(fā)明所述的藥物載體是將抗癌藥物和羥磷灰石納米顆粒進行共摻雜，而非僅僅將抗癌藥物修飾在納米顆粒表面，從而提高了抗癌藥物的包覆率。(3)摻雜抗癌藥物的羥磷灰石納米顆粒表面修飾上葉酸后，就如同在該納米載體表面覆蓋上一層薄膜，從而有效地降低了該納米載體在血液循環(huán)過程中的抗癌藥物的泄漏率。進而提高了抗癌藥物的釋放效率和局部濃度并降低抗癌藥物的使用劑量和毒副作用等，在癌癥治療領(lǐng)域有著重大的研究價值和應(yīng)用前景。(4)葉酸受體在大多數(shù)腫瘤中高度表達，而葉酸受體同葉酸衍生物及游離葉酸的親和力均很強，葉酸衍生物與受體結(jié)合，并可通過內(nèi)吞方式穿過細胞膜。因此，本發(fā)明制備的FA@DOX@HAP納米藥物載體對腫瘤細胞具有很好的主動響應(yīng)性能，也就是說該納米藥物載體具有良好的葉酸分子特異靶向性，從而實現(xiàn)抗癌藥物的靶向緩慢釋放。

附圖說明

本發(fā)明附圖8幅：

圖1是實施例2.1FA@DOX@HAP納米顆粒的透射電鏡(TEM)圖。其中，a)和b)分別是標尺為1000nm和500nm下的電鏡圖，c)和d)是標尺為200nm下的電鏡圖。其形態(tài)為棒狀，平均長度是50-100nm，平均直徑5-20nm，不易聚集，分散性較好。

圖2是實施例2.2的紅外光譜(FTIR)圖。其中，a)為DOX@HAP，b)為氨基化的DOX@HAP，c)為FA@DOX@HAP。

圖3是實施例2.3HAP，DOX@HAP，氨基化的DOX@HAP，F(xiàn)A@DOX@HAP納米顆粒的Zeta電位圖。其中HAP，DOX@HAP，氨基化的DOX@HAP，F(xiàn)A@DOX@HAP的濃度均為0.5mg/mL。

圖4是實施例2.4的XRD圖。其中，a)為氨基化的DOX@HAP，b)為FA@DOX@HAP。

圖5是實施例3DOX和FA@DOX@HAP納米顆粒的熒光光譜圖。DOX和FA@DOX@HAP濃度分別為2.5mM和5mg/mL，激發(fā)波長為480nm。

圖6是實施例4FA@DOX@HAP在不同pH值下的藥物釋放過程。其中，a)為不同pH值下的相對熒光強度圖，b)為不同pH值下的藥物累積釋放率圖。激發(fā)波長為480nm。

圖7是實施例5FA@DOX@HAP納米顆粒的細胞毒性圖。其中，a)為人肝細胞(HL-7702)，b)為人肝癌細胞(HepG-2)，c)為乳腺癌細胞(MCF-7)，d)為宮頸癌細胞(HeLa)，e)為四種細胞的細胞毒性折線圖。FA@DOX@HAP濃度為5mg/mL，激發(fā)波長為480nm。

圖8是實施例6FA@DOX@HAP在不同細胞、不同時間的熒光共聚焦顯微成像圖。其中，a)為非洲綠猴腎細胞(COS-7)，b)為人肝細胞(HL-7702)，c)為乳腺癌細胞(MCF-7)，d)為宮頸癌細胞(HeLa)。FA@DOX@HAP濃度為5mg/mL，激發(fā)波長為480nm。

具體實施方式

本發(fā)明旨在提供一種葉酸修飾的載藥羥基磷灰石(FA@D@HAP)的制備方法，以及由該方法制備得到的產(chǎn)品。所述的制備方法包括：首先制備載藥羥基磷灰石(D@HAP)，并以硅烷偶聯(lián)劑或氨基聚合物對其進行表面氨基化處理的步驟，以及以葉酸對所述表面氨基化的載藥羥基磷灰石進行修飾的步驟。

如無特殊說明，本說明書中所使用的符號FA均代表葉酸，D代表所載的藥物，DOX代表阿霉素，HAP代表羥基磷灰石，D@HAP代表載藥羥基磷灰石，F(xiàn)A@D@HAP代表葉酸修飾的載藥羥基磷灰石。

具體實施方式中，所述方法中，載藥羥基磷灰石由氣液沉淀水熱法制備:水可溶性鈣鹽、磷酸鹽及藥物在乙醇-水體系中，于100～120℃條件下反應(yīng)制備。其中，所述的可溶性鈣鹽優(yōu)選但不限于Ca(NO₃)₂·4H₂O；所述的可溶性磷酸鹽優(yōu)選但不限于(NH₄)₂HPO₄。

另一方面，該所述載藥羥基磷灰石中述及的所載藥物選自：阿霉素、紫杉醇、順鉑、吉西他濱、氟尿嘧啶、蓋諾、表阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿、博萊霉素、多帕菲或其衍生物。尤其優(yōu)選阿霉素(DOX)或其衍生物，其可舉例但不限于：阿霉素、吡喃阿霉素、表柔比星、米托蒽醌。

所制備的載藥羥基磷灰石是棒狀材料，平均長度為50-100nm，平均直徑為5-20nm。

具體實施方式的另一方面，對所述載藥羥基磷灰石的表面氨基化處理通過與硅烷偶聯(lián)劑或氨基聚合物反應(yīng)完成，其中所述的硅烷偶聯(lián)劑可選自但不限于γ-氨丙基三乙氧基硅烷或乙二胺丙基三乙氧基硅烷中的一種；所述的氨基聚合物選自但不限于聚乙烯亞胺或聚丙烯酰胺中的一種。

具體實施方式的再一方面，所述以葉酸對表面氨基化的載藥羥基磷灰石進行修飾的步驟是：葉酸(FA)、1-(-3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)按照摩爾比1～2:1～2:1～3的混合物與表面氨基化的載藥羥基磷灰石反應(yīng)。

較為具體完整的具體實施方式中，本發(fā)明的葉酸修飾的載藥羥基磷灰石的制備方法，包括如下步驟：

(1)水可溶性硝酸鹽、磷酸鹽及藥物在乙醇-水體系中，于100～120℃條件下反應(yīng)制備載藥羥基磷灰石；

(2)硅烷偶聯(lián)劑或氨基聚合物與載藥羥基磷灰石在乙醇-水體系中反應(yīng)，制備表面氨基化的載藥羥基磷灰石；

(3)葉酸(FA)、1-(-3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)按照摩爾比1～2:1～2:1～3的混合物與表面氨基化的載藥羥基磷灰石反應(yīng)，制備葉酸修飾的載藥羥基磷灰石。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，本發(fā)明的葉酸修飾的載藥羥基磷灰石的制備方法，包括如下步驟：

(1)向濃度為15～30mg/ml、pH為10.5±0.5的Ca(NO₃)₂·4H₂O的乙醇溶液中緩慢滴加濃度為6～10mg/ml的藥物-水溶液，攪拌5～15min后，滴加濃度為60～100mg/ml的(NH₄)₂HPO₄水溶液，繼續(xù)攪拌1～2h；混合物在100～120℃條件下水熱反應(yīng)12～24h后，高速離心，沉淀物洗滌干燥，得到載藥羥基磷灰石；

其中，使用25％(w/w)的氨水來調(diào)節(jié)所述的Ca(NO₃)₂·4H₂O的乙醇溶液的pH值。

(2)向體積比4:1～10:1的乙醇-水溶液中緩慢滴加質(zhì)量分數(shù)為90～98％的硅烷偶聯(lián)劑或氨基聚合物，攪拌15～30min后，緩慢加入載藥羥基磷灰石，所得混合體系超聲1～5min，攪拌1～3h，調(diào)節(jié)pH至10～12，并繼續(xù)反應(yīng)2～3h；高速離心，沉淀物洗滌干燥，得到表面氨基化的載藥羥基磷灰石；

(3)將摩爾比為1～2:1～2:4～8的葉酸(FA)、1-(-3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和去離子水?dāng)嚢?.5～2h，將相對于葉酸1～3倍摩爾量的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)加入FA-EDC體系中，繼續(xù)攪拌5～7h后，緩慢加入相對于葉酸質(zhì)量1～3倍的表面氨基化的載藥羥基磷灰石，調(diào)節(jié)混合物pH至7～8，繼續(xù)攪拌2～3h后，高速離心，沉淀物洗滌干燥，得到葉酸修飾的載藥羥基磷灰石。

進一步，本發(fā)明亦提供上述任意制備方法所制得的葉酸修飾的載藥羥基磷灰石。其基于葉酸分子靶向且酸敏響應(yīng)性羥磷灰石納米藥物載體被用于靶向傳輸抗癌藥物，所得納米藥物載體的結(jié)構(gòu)驗證、大小和形態(tài)等基本性能分別采用傅里葉紅外光譜分析儀(FTIR)、X射線衍射圖譜分析儀(XRD)、Zeta電位分析儀、透射電子顯微鏡(TEM)來測定。其對抗癌藥物負載能力的大小則采用紫外可見分光光度計、熒光顯微鏡來進行驗證，并通過體外細胞實驗來檢測該納米藥物載體的靶向治療效果。

此外，該納米藥物載體還通過細胞實驗來評價這一可定向傳輸抗癌藥物到腫瘤細胞的靶向體系，即采用人肝細胞(HL-7702)、人肝癌細胞(HepG-2)、乳腺癌細胞(MCF-7)、宮頸癌細胞(HeLa)來進行體外的細胞毒性實驗，以測定表面修飾葉酸分子并負載抗癌藥物的羥磷灰石納米載體對不同細胞的細胞毒性。其中HL-7702、HepG2、MCF-7是作為對比實驗，因為這三種細胞表面葉酸受體低表達。

下述非限制性實施例用于對本發(fā)明做進一步的說明，但不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明內(nèi)容任何形式的限定。

實施例1.FA@DOX@HAP的制備

1.1載藥羥基磷灰石(DOX@HAP)的合成

采用氣液沉淀水熱法結(jié)合，稱取30mg鹽酸阿霉素，1.490g的Ca(NO₃)₂·4H₂O和0.495g的(NH₄)₂HPO₄分別溶于2mL的超純水，30mL的無水乙醇和2mL的超純水中，并將Ca(NO₃)₂·4H₂O的乙醇溶液pH調(diào)節(jié)至10.5左右。在這種堿性環(huán)境下，邊攪拌邊緩慢滴加鹽酸阿霉素的水溶液，穩(wěn)定10分鐘后，繼續(xù)滴加(NH₄)₂HPO₄水溶液，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌1h，然后將渾濁液倒入反應(yīng)釜中，120℃條件下水熱反應(yīng)24h，然后高速離心，用超純水和無水乙醇多次洗滌產(chǎn)物，60℃下真空干燥12h，研磨，即得樣品。

1.2制備表面氨基化的載藥羥基磷灰石(DOX@HAP表面氨基化)

將100mgγ-氨丙基三乙氧基硅烷加入到27mL無水乙醇和3mL蒸餾水組成的混合溶劑中，室溫攪拌30分鐘，然后加入300mg載藥羥基磷灰石(DOX@HAP),并超聲5分鐘，使DOX@HAP充分分散于乙醇和水的混合溶劑中。室溫下攪拌2h，然后利用氨水將反應(yīng)體系的pH值調(diào)節(jié)至10，繼續(xù)反應(yīng)3h，高速離心，然后再將固體物質(zhì)用超純水和無水乙醇洗滌多次，除去沒有鍵合在納米DOX@HAP表面的硅烷偶聯(lián)劑，最后將所得物質(zhì)真空干燥，得到納米尺寸的表面氨基化的DOX@HAP。

1.3葉酸修飾的載藥羥基磷灰石(FA@DOX@HAP)

稱取50mg葉酸(FA)和22mg1-(-3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶于140mL去離子水中，并在黑暗的室溫環(huán)境下攪拌30分鐘，隨后稱取35mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)加入到EDC-FA體系中，在黑暗的室溫環(huán)境下攪拌6h。接著稱取200mg表面氨基化的DOX@HAP加入其中，并調(diào)節(jié)pH至7.4，繼續(xù)攪拌3h，最后高速離心，分別用去離子水和無水乙醇洗滌多次，60℃下真空干燥12h，即得葉酸修飾的載藥羥基磷灰石(FA@DOX@HAP)。

實施例2.葉酸修飾的載藥羥基磷灰石基本性能的測試

2.1葉酸修飾的載藥羥基磷灰石大小和形態(tài)的測試

實施例1所得葉酸修飾的載藥羥基磷灰石的形態(tài)大小采用透射電子顯微鏡來觀察確定，測試結(jié)果見圖1。從透射電子顯微鏡圖片可以明顯看出，通過共沉淀和水熱結(jié)合的方法合成的FA@DOX@HAP納米顆粒，其形態(tài)為棒狀，平均長度是50-100nm，平均直徑5-20nm，不易聚集，分散性較好。

2.2高級傅里葉變換紅外光譜測定

取1-2mg葉酸修飾的載藥羥基磷灰石樣品在瑪瑙研缽中與干燥的溴化鉀粉末(A.R.級)混合并研磨成細粉末，裝入模具中，在壓片機上壓制成片后在6700FTIR(Thermo Fisher，USA)上測試。測試參數(shù)為：光譜范圍7800-350cm^-1，分辨率0.09cm^-1，溫度25℃。測試結(jié)果如圖2所示，和DOX@HAP，氨基化的DOX@HAP的FTIR光譜圖比較，F(xiàn)A@DOX@HAP在1641cm^-1，1590cm^-1和1490cm^-1處的峰是羧基的伸縮振動和平面彎曲振動。此外，612cm^-1處的峰是HAP羰基的伸縮振動，1002cm^-1處的峰是HAP的PO₄^3-特征峰。由此證明葉酸很好的修飾在DOX@HAP納米顆粒的表面上。

2.3Zeta電位的測定

Zeta電位的測量在納米粒度及Zeta電位分析儀(Nanozs90，UK)上進行。測試參數(shù)為：溫度25℃，測試數(shù)遍取平均值。測試結(jié)果如圖3所示，由于羥磷灰石幾乎是電中性的，故測其Zeta電位接近于零，而表面氨基化之后，其電位增大，表面修飾上葉酸之后，其電位又變?yōu)榻咏诹?，這也說明葉酸很好的修飾在DOX@HAP納米顆粒的表面上。

2.4XRD的測定

XRD的測量在X射線衍射儀(XD-3A，Japan)上進行，測試參數(shù)為：衍射角為5-80^。，溫度為25℃。測試結(jié)果如圖4所示，F(xiàn)A@DOX@HAP的XRD譜圖與標準譜圖基本吻合，當(dāng)2θ＝30.9^。時，該納米顆粒對應(yīng)標準譜圖的(211)晶面。

實施例3.葉酸修飾的載藥羥基磷灰石光譜性質(zhì)測試

稱取一定質(zhì)量的FA@DOX@HAP和DOX，將稱好的物質(zhì)分別移入1.5ml的棕色容量瓶里面，用DMSO定容，配成濃度分別為5mg/mL和2.5mM的母液。采用量程為10μL微量進樣器吸取3μL母液，移入3ml測試體系石英池中，攪拌均勻，測其吸收和發(fā)射波長。測試結(jié)果如圖5所示，當(dāng)DOX@HAP的表面修飾上葉酸之后，阿霉素的熒光基本上被完全淬滅，究其原因可能是阿霉素被葉酸完全包覆，泄漏率降低。光譜測試在紫外分光光度計(AgIIlent 8453，USA)和熒光分光光度計(AgIIlent Cary EclIIpse，USA)上進行。測試參數(shù)為：抗癌藥物的最大吸收波長為480nm，最大發(fā)射波長為590nm。

實施例4.葉酸修飾的載藥羥基磷灰石中藥物釋放測試

在不同pH值下，如圖6所示，藥物的釋放量不同，并且隨著pH的不斷降低，其藥物釋放量不斷增大，阿霉素的熒光不斷增強。并且在同一pH值，不同時間內(nèi)，藥物的釋放量也不斷增大，當(dāng)pH＝5.5時，其藥物的最大釋放量達到了80％以上，由此說明，合成的該納米載體可以有效地進行藥物緩慢釋放，從而達到治療腫瘤細胞的效果。實施例5.葉酸修飾的載藥羥基磷灰石細胞毒性測試

本實驗選用噻唑藍MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)分析法，以細胞的存活率來評估染料對細胞的毒性大小。分別將對數(shù)生長期的HL-7702，HepG-2，MCF-7，HeLa細胞以每毫升1×105個細胞濃度接種于96孔板中，每孔加入10μL，于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)24h，分別加入10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L的藥物載體FA@DOX@HAP，相同條件下再培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(10μL，5mg/mL)孵育4h后，小心吸掉孔內(nèi)上清液并加入200μL的DMSO，待甲瓚結(jié)晶完全溶解后，在酶標儀上測定570nm的吸光值OD，選擇490nm作為參考波長，平行測定三次。細胞存活率＝(OD_實驗組-OD_空白對照)/(OD_陽性對照-OD_空白對照)×100％，空白對照為不加藥物載體組。

細胞毒性是衡量納米載體用于活細胞成像性能好壞的一項重要指標。測試結(jié)果如圖7所示，從中可以看出，6μL納米載體與HL-7702，HepG-2，MCF-7，和HeLa細胞共培養(yǎng)24h之后，細胞存活率分別在90％、80％、80％和55％左右，表明該納米載體對正常細胞和表面葉酸受體低表達的腫瘤細胞具有較低的細胞毒性，對表面葉酸受體過表達的腫瘤細胞具有較高的細胞毒性。該實驗結(jié)果完全符合實驗預(yù)想。

實施例6.葉酸修飾的載藥羥基磷灰石體外吸收的細胞成像實驗

實驗過程中用到的細胞主要有HeLa(人宮頸癌細胞)、MCF-7(人乳腺癌細胞)、COS-7(非洲綠猴腎細胞)和HL-7702(人肝細胞)。

細胞孵育：待貼壁生長的細胞長滿瓶底，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，并用PBS緩沖溶液洗兩次。加入適量胰酶進行消化，然后加入新鮮的培養(yǎng)基吹掉貼壁細胞，棄去部分細胞懸液，再加入適量新鮮的培養(yǎng)基，放置在37℃，5％CO₂的細胞孵育箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)基為加入10％的胎牛血清和0.1％的硫酸慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基。實驗操作過程中，在細胞培養(yǎng)皿中以每毫升2×105個細胞密度種上細胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待用。

進行細胞成像時，將6μL母液(5mg/mL)加入到細胞培養(yǎng)皿中，在37℃及5％CO₂條件下培養(yǎng)30min后小心地用PBS溶液沖洗除去未進入細胞的染料，加入2mL新DMEM培養(yǎng)基后在Olympus FV1000-IX81激光共聚焦熒光顯微鏡下進行觀察明場和熒光圖像。測試結(jié)果如圖8所示，從中可以看出，納米載體2h后幾乎沒有進入表面葉酸受體低表達的細胞(HL-7702，COS-7)，僅僅是覆蓋在細胞膜表面。MCF-7細胞有少量納米載體攝入。而對于表面葉酸受體過表達HeLa細胞，其納米載體攝入量就大大增多，熒光強度也隨之增強。以上實驗結(jié)果表明，納米載體FA@DOX@HAP能夠特異性識別葉酸受體過表達的腫瘤細胞。