技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，且特別是堿性磷酸酶在治療如腎功能減退等腎病中的用途。本發(fā)明還涉及藥學(xué)領(lǐng)域，且特別是堿性磷酸酶的藥物用途。
背景技術(shù)：
：有多種腎病可以導(dǎo)致腎功能減退。急性腎衰竭(ARF)是一種可以導(dǎo)致腎功能減退的腎病。下面對ARF進(jìn)行詳述，這些描述并不限制本發(fā)明的范圍。急性腎衰竭(ARF)是指導(dǎo)致血清肌酸酐水平升高的急性腎功能損失。社區(qū)獲得性ARF的年發(fā)病率為每一百萬人口約100例，而其僅在1％的住院者中被診斷出。另一方面，醫(yī)院獲得性ARF發(fā)生在4％的住院者和20％的重護(hù)理住院者中。醫(yī)院獲得性ARF發(fā)病率的增加有多方面的因素：其與患ARF風(fēng)險增加的老年人群、可能在醫(yī)院的設(shè)置中暴露于對腎臟有害的環(huán)境的高度普遍性以及疾病嚴(yán)重性的增加有關(guān)。在過去的40年中，急性腎衰竭的存活率并沒有得到改善，主要原因是受其影響的患者年齡增大且患有更多的并發(fā)癥。依據(jù)腎衰竭的嚴(yán)重性，其死亡率可以在7％至高達(dá)80％的范圍。在急性腎衰竭中，腎小球濾過率在數(shù)天至數(shù)周內(nèi)下降。結(jié)果造成含氮廢物的排泄降低，并且不能維持體液和電解質(zhì)平衡?；加屑毙阅I衰竭的患者通常沒有癥狀，而所述病癥是通過所觀察到的血尿素氮(BUN)和血清肌酸酐水平的上升來診斷的。當(dāng)血清肌酸酐水平每天增加至少0.5mg/dL(等于每天44μmol/L)且每天的尿排出小于400mL(少尿癥)時，則出現(xiàn)完全的腎機(jī)能停止。病理生理學(xué)：腎小球濾過的驅(qū)動力是從腎小球到腎小囊腔的壓力梯度。腎小球壓力主要依賴于腎血流(RBF)并受控于腎入球和出球微動脈的聯(lián)合阻力。不管ARF的成因是什么，RBF的降低代表腎小球濾過率(GFR)減小的共同病理途徑。ARF的病因包括三種主要機(jī)制。腎前性腎衰竭定義為具有正常腎小管和腎小球功能的病癥。在腎前性急性腎衰竭中，問題是腎血流減少，這種腎血流減少由實際血管內(nèi)損耗、腎有效循環(huán)血容量的下降、或引起腎血流減少使GFR下降的藥劑所引起。腎實質(zhì)性急性腎衰竭被細(xì)分為四類：腎小管疾病、腎小球疾病、血管疾病和間質(zhì)疾病。在腎實質(zhì)性急性腎衰竭中，腎實質(zhì)受到損傷。梗阻后腎衰竭首先引起腎小管壓力增加，從而降低過濾驅(qū)動力。腎后性急性腎衰竭僅在兩條排尿管均被阻塞，或孤立腎的排出管被阻塞時才會發(fā)生。這種病癥最通常由下尿路的阻塞造成的。腎前性腎衰竭引起腎前性急性腎衰竭的主要藥劑是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑和非甾體抗炎藥(NSAIDs)。對ACE的抑制阻止了血管緊張素I向血管緊張素II的轉(zhuǎn)化，這導(dǎo)致血管緊張素II水平的降低。血管緊張素II通過引起出球微動脈收縮來增加腎小球濾過率；其缺乏使腎小球濾過率降低，這是由于出球微動脈的擴(kuò)張而引起的。腎實質(zhì)性急性腎衰竭腎小管疾病由RBF下降引起的急性腎小管壞死是住院患者患腎實質(zhì)性急性腎衰竭的最常見病因。腎血流的減少引起腎實質(zhì)缺血。如果長時間的缺血，就可能發(fā)展為急性腎小管壞死。這種最初的缺血損傷引發(fā)產(chǎn)生即使在RBF恢復(fù)后還會繼續(xù)導(dǎo)致細(xì)胞損傷的氧自由基和酶。腎小管細(xì)胞損傷導(dǎo)致細(xì)胞間緊密連接的斷裂，這使得腎小球濾出物回漏并進(jìn)一步降低有效的GFR。此外，臨終的細(xì)胞脫落進(jìn)入小管，形成阻塞脫落物，這進(jìn)一步降低GFR并導(dǎo)致少尿癥。缺血性急性腎小管壞死通常是可逆的，但是如果缺血嚴(yán)重到足以引起皮質(zhì)層壞死，則會發(fā)生不可逆的腎衰竭。急性腎小管壞死有三個階段。腎損傷在持續(xù)數(shù)小時至數(shù)天的起始階段中發(fā)展。在持續(xù)數(shù)天至數(shù)周的維持階段期間，腎小球濾過率達(dá)到其最低點，且尿排出也處于其最低點?；謴?fù)階段持續(xù)數(shù)天，通常首先出現(xiàn)后急性腎小管壞死多尿癥。在此階段還會出現(xiàn)由于過量尿排出導(dǎo)致的血容量不足。盡管產(chǎn)尿量得到恢復(fù)，但由于腎小管功能尚未完全恢復(fù)，患者仍面臨尿毒癥以及電解質(zhì)和酸的體內(nèi)平衡的難題。腎小球疾病導(dǎo)致ARF的最常見腎小球疾病是腎小球腎炎。腎小球腎炎的特征是高血壓、蛋白尿和血尿。在腎小球腎炎的眾多類型中，大多數(shù)與慢性腎疾病有關(guān)。大體而言，引起急性腎衰竭的兩類腎小球腎炎是急進(jìn)性腎小球腎炎和急性增殖性腎小球腎炎。后一種類型發(fā)生在患有細(xì)菌性心內(nèi)膜炎或其它后傳染性病癥的患者中。血管疾病微血管或大血管疾病(主要腎動脈阻塞或嚴(yán)重腹主動脈疾病)可以引起急性腎衰竭。間質(zhì)疾病急性間質(zhì)性腎炎通常表現(xiàn)出發(fā)熱、皮疹和嗜曙紅細(xì)胞增多。嗜曙紅細(xì)胞為陽性的尿染色預(yù)示患有這種病癥。急性間質(zhì)性腎炎通常是對藥物過敏性反應(yīng)的結(jié)果，但是其也可以由自身免疫性疾病、感染或浸潤性疾病所引起。ARF的恢復(fù)首先依賴于RBF的恢復(fù)。RBF正?；珙A(yù)示著腎功能恢復(fù)的預(yù)后更好。在腎前性腎衰竭中，循環(huán)血量的恢復(fù)通常是充分的。在腎后性腎衰竭中，尿阻塞的快速緩解可使血管收縮迅速下降。對于腎實質(zhì)性腎衰竭，單獨的血量恢復(fù)無法恢復(fù)腎功能。對于腎小球或腎小管疾病，去除腎小管毒素和開始對其進(jìn)行治療會降低腎入球血管收縮并可逆轉(zhuǎn)ARF。盡管正在探尋急性腎衰竭的病因，但最初的治療應(yīng)該關(guān)注于糾正體液和電解質(zhì)平衡和尿毒癥。用鹽水復(fù)蘇體液容量不足的患者。然而，更常見的是體液容量過度負(fù)荷，特別是在患者患少尿癥或無尿癥的情況下。現(xiàn)有治療的一個實例是經(jīng)靜脈施用速尿靈(Lasix)?，F(xiàn)有治療中的另一個實例是經(jīng)靜脈施用鈣。利用經(jīng)靜脈施用的胰島素(10個單位)和葡萄糖(25g)、吸入的β-激動劑或經(jīng)靜脈施用碳酸氫鈉可以使鉀臨時移入細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。施用聚苯乙烯磺酸鈉(Kayexalate)和/或利尿劑來實現(xiàn)鉀的排泄。聚苯乙烯磺酸鈉口服給藥(25至50g，混合有100mL20％山梨醇)或作為灌腸劑給藥(50g，于50mL70％山梨醇和150mL自來水中)。如果這些方法不能控制鉀水平，則開始進(jìn)行透析。如果血清碳酸氫鹽水平小于15mEq/L(15mmol/L)或pH小于7.2，則通常通過靜脈或口服施用碳酸氫鈉來治療酸中毒。也可以通過口服碳酸氫鈉片劑、30mL劑量的Shohl溶液或粉末狀碳酸氫鈉對患者進(jìn)行治療。血清碳酸氫鈉水平和pH應(yīng)該密切相關(guān)。難以減輕的酸中毒需要進(jìn)行透析。應(yīng)對全部藥物做出評價，并應(yīng)基于藥物的腎小球濾過率和血清水平調(diào)節(jié)它們的劑量。有20％至60％的患者需要短期透析，特別是當(dāng)BUN超過100mg/dL(35.7mmol/每升尿液)且血清肌酸酐水平超出5-10mg/dL(442-884μmol/L)的范圍時。透析的適應(yīng)癥包括對藥理學(xué)治療無反應(yīng)的酸中毒或電解質(zhì)紊亂、對利尿劑無反應(yīng)的體液過多、和尿毒癥。對于患進(jìn)行性急性腎衰竭的患者，需要腎病學(xué)家的緊急會診。一些上述治療導(dǎo)致(部分)恢復(fù)的腎功能。與未經(jīng)治療人群相比，其它治療導(dǎo)致功能的改善。然而，仍需要備選的治療。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供改善腎功能的備選治療，特別是在腎功能至少部分地受損/減退的情況中。本發(fā)明提供使用堿性磷酸酶以改善腎功能減退的情況的備選治療。在第一實施方案中，本發(fā)明提供了堿性磷酸酶(AP)在制備改善腎功能減退的藥物中的用途。術(shù)語“改善”包括使延緩減退、終止減退或至少部分地逆轉(zhuǎn)腎功能的減退。術(shù)語“腎功能減退”通常用于表示通過將至少一種腎相關(guān)參數(shù)的值與所述參數(shù)公認(rèn)的或平均(實驗室)值相比，而確定腎功能下降的情況。例如，如果受試者(優(yōu)選人)尿中蛋白質(zhì)含量(顯著地)大于公認(rèn)的或平均(實驗室)值，則稱此人患有“腎功能減退”。相應(yīng)的分析可以在實驗室中進(jìn)行，也可以在家中進(jìn)行。例如，自2006年9月起，荷蘭“Nierstichting”已引入了可以在家中進(jìn)行的，測試腎功能是否正常的簡單測試(稱為Niercheck)。此測試針對于尿液中蛋白質(zhì)的含量?？梢詼y試的參數(shù)的其它實例是腎小球濾過率(GFR)、血清肌酸酐水平、電解質(zhì)紊亂、產(chǎn)尿量、血尿素氮(BUN)、鈣、磷、白蛋白水平、或尿中的紅細(xì)胞和白細(xì)胞?？梢赃M(jìn)行的其它測試是分類全血細(xì)胞計數(shù)。優(yōu)選地，對全部可能的患者進(jìn)行以下尿液檢查：浸漬檢查法、顯微鏡檢查、鈉和肌酸酐水平和尿摩爾滲透壓濃度測定。如本文實驗部分所公開，也可以分析尿樣品中RNA分子的存在或缺失。優(yōu)選地，所述RNA分子是mRNA分子。更優(yōu)選地，所述mRNA分子是iNOSmRNA。在最優(yōu)選的實施方案中，所述RNA從分泌尿的腎細(xì)胞中獲得?；谏鲜龇治?，確定是否受試者(優(yōu)選人)正患有腎功能減退。例如，GFR降低或血清肌酸酐水平升高或產(chǎn)尿量下降或上述指標(biāo)的任意組合是所測試的受試者需要本文所述治療的明顯指標(biāo)。因此，在本文所述的用途之前可以有分析步驟，例如，所述分析步驟包括從疑似患有腎功能減退的受試者中取樣，并分析所述樣品中任何上述給出的參數(shù)(或其組合)，并將所獲得的結(jié)果與平均或公認(rèn)的值進(jìn)行比較。適合的樣品的實例是尿樣品或血液樣品。在對尿和/或血液樣品的分析之外，還可以附加腎超聲檢查。在優(yōu)選的實施方案中，由醫(yī)生或在醫(yī)生負(fù)責(zé)下進(jìn)行分析。當(dāng)很明確有腎功能減退時，則開始如本發(fā)明的治療。腎功能減退可以是不同疾病的結(jié)果。腎功能受損的許多病例導(dǎo)致輕微，無癥狀的疾病，此疾病未被患者察覺，未引起醫(yī)學(xué)關(guān)注且仍未確診。此輕微腎功能受損事件的發(fā)病率和流行程度尚不確定，但認(rèn)為其是相當(dāng)大的。然而，此輕微的功能障礙會發(fā)展為嚴(yán)重的問題，因此早期治療(例如如本文所述)很重要。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了堿性磷酸酶(AP)在制備改善腎功能減退的藥物中的用途，其中所述腎功能減退是由腎衰竭引起的。腎衰竭是腎無法正常發(fā)揮功能的病癥。生理學(xué)上，將腎衰竭描述為腎小球濾過率的下降。在臨床上，其表現(xiàn)為血清肌酸酐升高。其大致分為兩類：急性腎衰竭和慢性腎衰竭。慢性腎衰竭(CRF)發(fā)展緩慢，并且最初幾乎不表現(xiàn)出癥狀。其可以是大量腎病如腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎和尿潴留的并發(fā)癥。末期腎衰竭(ESRF)是其最終的結(jié)果，在此類病例中通常需要透析直到找到用于腎移植的供體。在急性腎衰竭中，腎功能幾乎完全被破壞。在優(yōu)選的實施方案中，所述腎衰竭是急性腎衰竭。如其名稱的意思，急性腎衰竭(ARF)是腎功能的快速進(jìn)行性損失，通常的特征為少尿癥(產(chǎn)尿量下降，定量表示為成人小于400mL/天，兒童小于0.5mL/kg/h或嬰兒小于1mL/kg/h)、體內(nèi)水分和體液失調(diào)以及電解質(zhì)紊亂。由于其病癥的嚴(yán)重性，患有急性腎衰竭的患者通常需要住院治療。目前，必需確定根本病因以阻止疾病進(jìn)程，并且需要透析來彌補(bǔ)治療這些根本病因所需的時間間隔?；诒景l(fā)明，即便不知道其根本病因，就可以立即開始使用堿性磷酸酶的治療，而且不浪費寶貴時間。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了堿性磷酸酶(AP)在制備改善腎功能減退的藥物中的用途，其中所述腎功能減退是由于腎衰竭所引起或維持或加重的，且其中腎衰竭是急性腎衰竭，即在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了堿性磷酸酶(AP)在制備治療由急性腎衰竭(ARF)所引起或維持或加重的腎功能減退的藥物中的用途。急性腎衰竭可以在慢性腎衰竭的基礎(chǔ)上存在。這被稱為慢性腎衰竭基礎(chǔ)上的急性腎功能衰竭(AoCRF)。AoCRF的急性部分是可逆的，且治療的目的是使患者恢復(fù)其原始的腎功能，這通常通過血清肌酸酐來測定。在另一實施方案中，本發(fā)明因此提供了堿性磷酸酶(AP)在制備改善腎功能減退的藥物中的用途，其中所述腎功能(進(jìn)一步)下降是由于慢性腎衰竭基礎(chǔ)上的急性腎功能衰竭引起的。在另一優(yōu)選的實施方案中，腎功能減退是可逆的，即通過根據(jù)本發(fā)明的治療可以至少使腎功能在某種程度上得到改善。如Agrawal和Swartz(AmericanFamilyPhysician,April1,2000volume61,no7；coverstory)所述，急性腎衰竭的病因可以通過使用步進(jìn)式方法來確定。基于此文章，技術(shù)人員能夠很好地將患者細(xì)分到3個ARF類別中的任意一個，即確定是否患者患有腎前性ARF、腎實質(zhì)性ARF或腎后性ARF。例如，診斷腎實質(zhì)性ARF通?；诓∈泛蜕眢w檢查、大于3％的鈉排泄分?jǐn)?shù)、250-300mOsm的尿摩爾滲透壓濃度、活性尿沉淀物來確定。在腎實質(zhì)性急性ARF中，腎實質(zhì)受到損傷。腎小管細(xì)胞的損傷導(dǎo)致某些特定的尿顯微鏡檢查結(jié)果。實質(zhì)損傷引起鈉再吸收受損并導(dǎo)致上述參數(shù)，例如大于3％的鈉排泄分?jǐn)?shù)和250-300mOsm等滲壓的尿摩爾滲透壓濃度。腎實質(zhì)性急性腎衰竭被細(xì)分為四類：腎小管疾病、腎小球疾病、血管疾病和間質(zhì)疾病。急性腎小管壞死是住院患者中腎實質(zhì)性急性腎衰竭的最主要病因。此病癥通常由缺血或毒素所引起。與腎前性急性腎衰竭不同，在缺血性急性腎小管壞死中，腎小球濾過率不隨腎血流的恢復(fù)而改善。缺血性急性腎小管壞死通常是可逆的，但是如果缺血嚴(yán)重到足以引起皮質(zhì)層壞死，則會發(fā)生不可逆的腎衰竭。造影劑和抗生素，特別是氨基糖苷是與急性腎小管壞死最相關(guān)的藥劑。該病癥也可以由來自肌紅蛋白尿(橫紋肌溶解)或血紅蛋白尿(溶血)中的色素引起。急性腎小管壞死有3個階段。腎損傷在持續(xù)數(shù)小時至數(shù)天的起始階段中發(fā)展。在持續(xù)數(shù)天至數(shù)周的維持階段期間，腎小球濾過率達(dá)到其最低點，且尿排出也處于其最低點?；謴?fù)階段持續(xù)數(shù)天，通常首先出現(xiàn)后急性腎小管壞死多尿癥。在此階段還會出現(xiàn)由于過量尿排出導(dǎo)致的血容量不足。盡管產(chǎn)尿量恢復(fù)，但由于腎小管功能尚未完全恢復(fù)，患者仍面臨尿毒癥和電解質(zhì)和酸的體內(nèi)平衡的難題。持續(xù)監(jiān)測應(yīng)貫穿于急性腎小管壞死的全部階段。有患急性腎小管壞死風(fēng)險的患者包括那些患有糖尿病、充血性心力衰竭或慢性腎功能不全的患者。可以通過迅速治療帶有缺血性或腎前性急性腎衰竭的可逆病因的患者，并通過在接受腎毒素的患者中保持適當(dāng)?shù)乃蟻眍A(yù)防急性腎小管壞死。一旦急性腎小管壞死發(fā)展，則要進(jìn)行輔助治療。藥物如甘露醇、袢利尿劑、多巴胺和鈣通道阻斷劑在促進(jìn)動物利尿上取得了一些成功，但是在人類中并未獲得類似的結(jié)果。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了堿性磷酸酶(AP)在制備改善腎功能減退的藥物中的用途，其中所述腎功能減退是由于腎衰竭(優(yōu)選急性腎衰竭)所引起，且其中所述腎功能減退是由于腎實質(zhì)性急性腎衰竭(優(yōu)選急性腎小管壞死)所引起或維持或加重的。即，本發(fā)明還提供了堿性磷酸酶(AP)在制備治療急性腎小管壞死的藥物中的用途。腎小球腎炎的特征是高血壓、蛋白尿和血尿。腎小球腎炎通常被描述為腎小球發(fā)炎。在腎小球腎炎的眾多類型中，大多數(shù)與慢性腎疾病有關(guān)。大體而言，引起急性腎衰竭的兩類腎小球腎炎是急進(jìn)性腎小球腎炎和急性增殖性腎小球腎炎。后一種類型發(fā)生在患有細(xì)菌性心內(nèi)膜炎或其它后傳染性病癥的患者中。急進(jìn)性腎小球腎炎可以是原發(fā)疾病，或其可以在全身疾病后發(fā)生。一旦懷疑有此病癥，必需通過血清學(xué)標(biāo)記物或腎活檢來檢查可治療的全身疾病。腎功能在急進(jìn)性腎小球腎炎患者中快速下降，且在數(shù)天至數(shù)周內(nèi)后會發(fā)展為末期腎疾病。通常用糖皮質(zhì)激素和環(huán)磷酰胺(Cytoxan)治療急進(jìn)性腎小球腎炎患者。人們認(rèn)為血漿交換對Goodpasture綜合癥患者有利，但尚未證實其也對其它類型的腎小球腎炎患者有利。此類型的ARF也可以使用堿性磷酸酶來治療，因此，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了堿性磷酸酶(AP)在制備改善腎功能減退的藥物中的用途，其中所述腎功能減退是由于腎衰竭(優(yōu)選急性腎衰竭)所引起，且其中所述腎功能減退是由于腎實質(zhì)性急性腎衰竭(優(yōu)選腎小球腎炎)所引起或維持或加重的。即，本發(fā)明還提供了堿性磷酸酶(AP)在制備治療腎小球腎炎的藥物中的用途。一般的腎衰竭和具體的急性腎衰竭可以因不同的根本誘因而發(fā)生，或在不同疾病的病程中發(fā)展，所述疾病如缺血、造影劑色素、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、小血管血管炎、紫癜、Goodpasture綜合癥、心內(nèi)膜炎、后鏈球菌感染、后肺炎球菌感染、糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化或癌癥。已知使用某些抗微生物劑(如兩性霉素B、卡泊芬凈、萬古霉素、左氧氟沙星和氨基糖苷，如托普霉素和慶大霉素)、其它藥物(如化療藥劑(如順鉑、卡鉑、甲氨蝶呤)、蛋白酶抑制劑(如茚地那韋和利托那韋)、金、鋰、抗炎藥(如非甾體抗炎藥、環(huán)孢菌素、他克莫司、西羅莫司)、血壓藥(如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑(ARB))、和某些化學(xué)品(如硅酸鹽、烴、重金屬(如Cd、Hg、Pb)、殺蟲劑、除草劑、乙二醇和細(xì)菌毒素(如破傷風(fēng)、鏈球菌毒素))也可以引起服用或接觸所述藥劑或化學(xué)品的受試者腎功能減退。本發(fā)明可以用于治療由任何上述誘因所引起或維持或加重的腎功能減退。因此，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了堿性磷酸酶(AP)在制備改善腎功能減退的藥物中的用途，其中所述腎功能減退是由于藥物、藥劑和/或毒素所引起或維持或加重的，所述藥物、藥劑和/或毒素優(yōu)選自由以下組成的組：抗生素、蛋白酶抑制劑、化療藥劑、抗炎藥、血壓藥、殺蟲劑、除草劑、乙二醇、造影劑、重金屬和細(xì)菌毒素。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了堿性磷酸酶(AP)在制備改善腎功能減退的藥物中的用途，其中所獲得的腎功能改善并非通過AP對LPS解毒的結(jié)果。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了堿性磷酸酶(AP)在制備改善腎功能減退的藥物中的用途，其中所述腎功能減退是由于腎血流下降和/或缺血所引起或維持或加重的。所述腎血流下降和/或缺血優(yōu)選是由于脫水、心力衰竭、感染性休克、嚴(yán)重失血、高血壓、動脈粥樣硬化和/或血栓形成所引起或維持或加重的。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了堿性磷酸酶(AP)在制備改善腎功能減退的藥物中的用途，其中所述腎功能減退是由于腎血流下降和/或缺血所引起或維持或加重的，其中所述腎血流下降和/或缺血優(yōu)選是由于藥物或藥劑或毒素所引起或維持或加重的，所述藥物、藥劑和/或毒素優(yōu)選自由以下物質(zhì)組成的組：抗炎藥(最優(yōu)選非甾體抗炎藥)和血壓藥(最優(yōu)選血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑和/或血管緊張素受體阻斷劑(ARB))。本發(fā)明還提供了堿性磷酸酶(AP)在制備治療或預(yù)防由于(腎)誘導(dǎo)型NO合酶(iNOS)表達(dá)增加所引起的腎功能減退的藥物中的用途。此治療在所謂早期腎損傷/衰竭的治療中十分有用，且因此可以用于如治療或預(yù)防早期腎病。需要此治療的人群可以很容易通過測定iNOS含量并將獲得的值與平均水平比較來確定。通過向被診斷為早期腎損傷/衰竭的個人施用有效量的堿性磷酸酶，可以降低腎iNOS的含量。本發(fā)明人已經(jīng)確定堿性磷酸酶治療導(dǎo)致腎細(xì)胞中iNOSmRNA表達(dá)增加的減緩，從而導(dǎo)致NO代謝物尿排泄的減少。AP治療緩解炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致對腎iNOS表達(dá)誘導(dǎo)的減少，這引起NO代謝物產(chǎn)量減少和鄰近腎小管損傷的減少。腎衰竭通常伴隨有分泌到尿中的腎細(xì)胞的結(jié)構(gòu)損傷。從尿樣品中分離這些細(xì)胞和隨后進(jìn)行RNA合成分析為腎功能、腎損傷和損傷最終逆轉(zhuǎn)提供了有用的監(jiān)測工具。在實施例1中，將分泌尿的腎細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表達(dá)用作為腎衰竭的標(biāo)志物，且由此可將其用于監(jiān)測損傷和由AP治療所引起的損傷逆轉(zhuǎn)。損傷的根本機(jī)制是iNOS誘導(dǎo)活性氧化物產(chǎn)物(reactiveoxidespecies,ROS)，從而導(dǎo)致腎泄漏。使用此方法可以監(jiān)測通過iNOS下調(diào)而導(dǎo)致的對ROS的誘導(dǎo)的減少。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了AP在制備改善腎功能減退的藥物中的用途，進(jìn)一步包括分析尿樣品中RNA分子的存在或缺失。優(yōu)選地，所述RNA分子是mRNA分子。更優(yōu)選地，所述mRNA分子是iNOSmRNA。在最優(yōu)選的實施方案中，所述RNA從分泌尿的腎細(xì)胞中獲得。本發(fā)明使用堿性磷酸酶(AP)來改善腎功能減退(或損傷)。堿性磷酸酶(AP)(根據(jù)IUBMB酶命名法為EC3.1.3.1，常用名為堿性磷酸酶)是催化磷酸酶單酯和H2O反應(yīng)生成醇和磷酸鹽的酶。AP的其它名稱為堿性磷酸單酯酶、磷酸單酯酶、甘油磷酸酶、堿性磷酸水解酶、堿性苯基磷酸酶、正磷酸單酯磷酸水解酶(最適宜堿性)。AP的系統(tǒng)名稱為磷酸單酯磷酸水解酶(最適宜堿性)。AP是廣譜特異性酶，其也可以催化轉(zhuǎn)磷酸作用。已知在人和其它動物中至少有四種不同但相關(guān)的堿性磷酸酶。它們是腸、胎盤、胎盤樣和肝/骨/腎(或組織非特異性)堿性磷酸酶。前三種一起位于2號染色體上，而組織非特異性形式則位于1號染色體上。尚不知道AP具體的生理學(xué)功能，但AP似乎參與大量生理學(xué)過程。AP的來源可以是商業(yè)的AP酶、或包含AP酶的任何組合物、和能生產(chǎn)本發(fā)明所述功能性AP酶的任何手段，如編碼AP蛋白質(zhì)的DNA或RNA核酸?？梢詫⒕幋aAP的核酸插入到適合的載體中，如質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體、(逆轉(zhuǎn)錄)病毒、轉(zhuǎn)座子、基因治療載體和能夠誘導(dǎo)或使AP產(chǎn)生的其它載體。此外天然或重組微生物，如細(xì)菌、真菌、原生動物和酵母也可以用作本發(fā)明所述AP的來源。根據(jù)本發(fā)明所用的包含AP的組合物優(yōu)選包含真核生物AP，更優(yōu)選哺乳動物AP，其類型可以是組織非特異性AP，如肝-骨或腎類型、或組織特異性，如胎盤AP、腸AP、胎盤樣AP。后者也被稱為生殖細(xì)胞AP，其位于睪丸、胸腺和某些生殖細(xì)胞腫瘤(1)，且與胎盤和腸形式的堿性磷酸酶緊密相關(guān)(2)。技術(shù)人員能夠熟練地搜索核酸文庫并選擇編碼堿性磷酸酶的序列。最優(yōu)選地，哺乳動物AP是人或牛AP。因此，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了堿性磷酸酶(AP)在制備改善腎功能減退的藥物中的用途，其中所述AP是哺乳動物AP，且更優(yōu)選地所述AP是人AP。人AP序列的非限定性實例可以在NCBI(Genpept)集合中找到，且其包括NP_001622(腸AP)、NP_001623(胎盤AP)、NP_112603(胎盤樣AP)或NP_000469(組織非特異性AP)。本發(fā)明還包括任何所述序列多態(tài)性的用途。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述AP是胎盤AP、胎盤樣AP、腸AP或肝/骨/腎AP。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了AP在制備改善腎功能減退的藥物中的用途，其中所述AP是重組的AP。在構(gòu)象方面，堿性磷酸酶大致由兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：花冠結(jié)構(gòu)域和活性位點結(jié)構(gòu)域?；钚晕稽c結(jié)構(gòu)域可以分為單獨的部分，如催化殘基和三個金屬離子位點(Zn1、Zn2和Mg3)。從一級結(jié)構(gòu)看，很明顯花冠結(jié)構(gòu)域與形成活性位點結(jié)構(gòu)域的氨基酸側(cè)面連接。堿性磷酸酶的氨基酸序列和催化和花冠結(jié)構(gòu)域的相對位置是技術(shù)人員已知的。例如，以圖10作為參考，所述圖10中顯示出四條人堿性磷酸酶的氨基酸序列。這些序列中的花冠結(jié)構(gòu)域用下劃線標(biāo)出。堿性磷酸酶存在于從細(xì)菌到人類的幾乎所有生物體中。在優(yōu)選的實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，其中AP是包含花冠結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域的分離或重組的堿性磷酸酶，其中所述花冠結(jié)構(gòu)域和所述催化結(jié)構(gòu)域可以從不同的堿性磷酸酶獲得，且其中所述不同的磷酸酶中的至少一個是人磷酸酶。其它磷酸酶是如ECAP(大腸桿菌(Escherichiacoli)堿性磷酸酶)或七個已知BIAP(牛腸堿性磷酸酶)中的一個。在優(yōu)選的實施方案中，使用包含花冠結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域的分離或重組的堿性磷酸酶，其中所述花冠結(jié)構(gòu)域和所述催化結(jié)構(gòu)域獲得自不同的堿性磷酸酶，且其中不同的堿性磷酸酶是人磷酸酶。這一點在將修飾的磷酸酶隨后用在人治療中的情況下特別有用。希望此(遺傳)修飾的人源磷酸酶沒有免疫原性或免疫原性很低。然而，技術(shù)人員清楚如果將修飾的磷酸酶用在如“體外”或“離體”診斷中，修飾的磷酸酶可以由如人和大腸桿菌堿性磷酸酶構(gòu)成，或可以由牛和大腸桿菌堿性磷酸酶構(gòu)成。在另一優(yōu)選的實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，其中AP是包含花冠結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域的分離或重組的堿性磷酸酶，其中所述花冠結(jié)構(gòu)域和所述催化結(jié)構(gòu)域可以從不同的堿性磷酸酶獲得，且其中所述花冠結(jié)構(gòu)域是胎盤AP(ALPP)的花冠結(jié)構(gòu)域，且其中所述催化結(jié)構(gòu)域是腸AP(ALPI)的催化結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，所述不同的磷酸酶中的至少一個是人磷酸酶，且在更優(yōu)選的實施方案中，兩個不同的磷酸酶都是人磷酸酶?；谌藟A性磷酸酶的其它優(yōu)選的結(jié)構(gòu)域交換突變體為：催化結(jié)構(gòu)域花冠結(jié)構(gòu)域名稱ALPIGCAP催化ALPI/花冠GCAPTNAP催化ALPI/花冠TNAPALPPGCAP催化ALPP/花冠GCAPTNAP催化ALPP/花冠TNAPGCAPALPI催化GCAP/花冠ALPIALPP催化GCAP/花冠ALPPTNAP催化GCAP/花冠TNAPTNAPALPI催化TNAP/花冠ALPIALPP催化TNAP/花冠ALPPGCAP催化TNAP/花冠GCAP為了清楚起見，ALPI是腸AP，ALPP是胎盤AP，GCAP是胎盤樣AP，且TNAP是組織非特異性AP。很明顯也可以產(chǎn)生ECAP或任何人形式(ALPI、ALPP、GCAP或TNAP)的催化結(jié)構(gòu)域與BIAP的花冠結(jié)構(gòu)域之間的組合。此外，也可以產(chǎn)生BIAP的花冠結(jié)構(gòu)域與ECAP或任何人形式的催化結(jié)構(gòu)域的組合。另一類有用的修飾磷酸酶是指原來在自然條件下通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定物與細(xì)胞膜連接，但現(xiàn)在經(jīng)修飾而不再與細(xì)胞膜連接的磷酸酶。GPI錨定的磷酸酶的實例是堿性磷酸酶和5’-核苷酸酶。全部同工酶均在細(xì)胞膜上有功能性活性，且缺乏GPI錨定物的形式不以可檢測的水平自然存在。雖然已經(jīng)表明了血清堿性磷酸酶的活性，但是通常認(rèn)為此酶仍存在于脫落的膜部分或膜囊泡中。奶中AP活性也存在于包含膜囊泡的部分中。GPI錨定物作為前體分子存儲在細(xì)胞中，在此處其通過轉(zhuǎn)酰胺酶與附著位點連接。GPI錨定物的骨架在哺乳動物中是相同的，但是已知有依賴細(xì)胞類型的修飾。發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶主要通過其GPI錨定物與質(zhì)膜結(jié)合。例如，嗜中性粒細(xì)胞將該酶呈遞在其帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜背景下，而非將其釋放進(jìn)入炎性微環(huán)境中。出于此原因，在本發(fā)明之前通常認(rèn)為，為了獲得最佳的AP體內(nèi)活性，應(yīng)將該酶嵌入細(xì)胞膜或囊膜中。對于人受試者中AP的藥學(xué)用途，大多數(shù)應(yīng)用中優(yōu)選將人形式的該酶用于藥物和治療，這是因為獲得自其它物種的AP形式在人受試者中具有免疫原性，且治療會引起免疫反應(yīng)和病理學(xué)上的副作用。在一些受試者中，甚至?xí)l(fā)生致死的副作用，即過敏性休克(顯示在我們的動物研究中)，因此，優(yōu)選將免疫副作用的風(fēng)險降至最低。從人中分離AP在實踐中并不可行，通?？梢栽诓煌闹亟M表達(dá)平臺上制備人重組形式的AP蛋白質(zhì)。然而，GPI修飾和膜錨定的蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化十分困難；GPI蛋白質(zhì)很難從膜分離且很難分離和純化。然而，在本發(fā)明之前，通常認(rèn)為GPI錨定物和膜定位是AP生物學(xué)活性所必需的。然而在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，其中AP是在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中包含修飾的分離或重組的磷酸酶，其中所述修飾導(dǎo)致分泌性磷酸酶，即磷酸酶未附著到細(xì)胞膜上。在優(yōu)選的實施方案中，使用在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中包含修飾的分離或重組的磷酸酶，其中所述修飾導(dǎo)致具有生物活性的分泌性磷酸酶，即其顯示出對生物學(xué)(相關(guān))底物的活性。負(fù)責(zé)GPI錨定物連接的通用序列并不存在，但是可見明顯的共有序列：1)C末端的氨基酸的疏水延伸(至少11個氨基酸，但是優(yōu)選大于11個氨基酸)。2)疏水區(qū)上游，親水氨基酸間隔區(qū)(5-12個氨基酸)。3)GPI與小氨基酸(甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、絲氨酸或半胱氨酸)連接。4)GPI連接位點下游之后的2個后續(xù)氨基酸必然是小氨基酸，且在多數(shù)情況下其選自于甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、絲氨酸或半胱氨酸?；诖斯灿行蛄校夹g(shù)人員能夠通過如插入一個或多個氨基酸和破壞部分共有序列來突變此共有序列。然而，在優(yōu)選的實施方案中，使用在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中包含修飾的分離或重組的磷酸酶，其中所述修飾導(dǎo)致有分泌性磷酸酶，且其中所述修飾包括對含共有GPI信號序列的氨基酸序列的突變或刪除。對于在人治療中的應(yīng)用，希望所得修飾的磷酸酶沒有免疫原性或免疫原性很低，即此修飾的磷酸酶主要是人源的。在優(yōu)選的實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，其中AP是在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中包含修飾的分離或重組的磷酸酶，其中所述修飾導(dǎo)致分泌性磷酸酶(優(yōu)選具有針對生物學(xué)相關(guān)底物的活性)，且其中所述磷酸酶是人磷酸酶。GPI錨定的磷酸酶的實例是堿性磷酸酶和5’-核苷酸酶，因此，在優(yōu)選的實施方案中，使用在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中包含修飾的分離或重組的磷酸酶，其中所述修飾導(dǎo)致分泌性磷酸酶，且其中所述磷酸酶是堿性磷酸酶，例如人堿性磷酸酶，如人肝-腎-骨磷酸酶、人腸堿性磷酸酶或人胎盤樣堿性磷酸酶。很明顯任何所述可分泌的修飾磷酸酶均可通過如以下步驟來產(chǎn)生：向宿主細(xì)胞內(nèi)引入能夠編碼所述可分泌的磷酸酶的核酸，優(yōu)選所述核酸與調(diào)控序列可操作地連接，且允許所述宿主細(xì)胞表達(dá)所述可分泌的磷酸酶，并任選地從用于生長和/或維持宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離所產(chǎn)生的磷酸酶。然而，除了在上述GPI連接序列中進(jìn)行突變之外，還存在制備無GPI錨定連接分泌蛋白的其它方法：1)在作為膜錨定的蛋白質(zhì)表達(dá)后，可以使用磷脂酶來切除GPI錨定物。2)可以通過干擾GPI錨定物的產(chǎn)生或使用在GPI錨定物產(chǎn)生中存在缺陷的細(xì)胞(類型)來產(chǎn)生可分泌形式的GPI錨定蛋白。在GPI錨定生物化學(xué)中存在缺陷的細(xì)胞系的實例是，例如Jurkat、AM-B、C84、BW、S49、CHO和Raji。3)可以通過干擾轉(zhuǎn)酰胺酶或使用缺乏轉(zhuǎn)酰胺酶的細(xì)胞來抑制GPI錨定物與蛋白質(zhì)的連接，使得蛋白質(zhì)無錨定且可分泌?？梢酝ㄟ^誘變CHO來獲得此類缺陷性細(xì)胞。技術(shù)人員清楚可以對包含花冠結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域的修飾的磷酸酶做進(jìn)一步修飾并使其可分泌，其中所述花冠結(jié)構(gòu)域和所述催化結(jié)構(gòu)域獲得自不同堿性磷酸酶。因此，在優(yōu)選的實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，其中AP是在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信號序列中包含修飾的分離或重組的磷酸酶，其中所述修飾導(dǎo)致分泌性磷酸酶，且其中所述重組的磷酸酶還包含從不同磷酸酶獲得的花冠結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域。圖10提供了此(堿性)磷酸酶突變體的非限定性實例。此組合的或“雙”突變體產(chǎn)生例如修飾的磷酸酶，其具有某種特定活性、穩(wěn)定性或底物特異性，且同時由于可以從生產(chǎn)細(xì)胞周圍的培養(yǎng)基中將其分離，此產(chǎn)物的產(chǎn)量得到極大的提高。可以通過不同途徑，如靜脈、直腸、支氣管或口服施用AP。在優(yōu)選的實施方案中，所用的給藥途徑是靜脈給藥。技術(shù)人員清楚優(yōu)選遞送有效量的AP。可以使用10-500U/kg/天的初始量。如果使用靜脈途徑給藥，優(yōu)選通過連續(xù)輸注來施用AP(至少持續(xù)一段時間)。本發(fā)明還提供了包含AP源的組合物，其中有包含AP源的藥物和營養(yǎng)保健品組合物。組合物可以任選地包含藥學(xué)上可接受的賦形劑、穩(wěn)定劑、活化劑、載體、滲透劑、拋射劑、消毒劑、稀釋劑和防腐劑。適合的賦形劑是藥物制劑領(lǐng)域公知的，且技術(shù)人員很容易找到并應(yīng)用，參見如Remmington'sPharmaceuticalSciences,MacePublishingCompany,PhiladelphiaPA,17thed.1985。在優(yōu)選的實施方案中，包含AP源的組合物適于口服施用，且包含腸包衣以保護(hù)AP免受胃液和低pH的不利影響。腸包衣和控釋制劑是本領(lǐng)域所公知的(參見上述文獻(xiàn))。本領(lǐng)域的腸包衣組合物可包含混有活性成分如AP的水溶性腸包衣聚合物的溶液和其它賦形劑，將其分散到水溶液中并可以隨后干燥和/或成丸。形成的腸包衣為AP提供抵抗以免受存儲期間空氣濕氣和氧，以及在服用后胃液和低pH的攻擊，而其在下腸道的堿性條件下很容易分解。在優(yōu)選的實施方案中，向受試者(優(yōu)選人)提供有效量的AP(通任何適合的給藥途徑)和任何適當(dāng)形式的AP。優(yōu)選地，在施用AP之前和之后測定指示腎功能的參數(shù)，以確定治療是否成功。通常需要反復(fù)施用更多的劑量，優(yōu)選直到認(rèn)為腎功能參數(shù)可接受為止。適合參數(shù)的一個實例是RNA分子的存在或缺失。優(yōu)選地，所述RNA分子是mRNA分子。更優(yōu)選地，所述mRNA分子是iNOSmRNA。在最優(yōu)選的實施方案中，所述RNA從分泌尿的腎細(xì)胞中獲得。另一個優(yōu)選的施用形式包括使用包含AP來源的藥物組合物，其可以在延長期中采用每天劑量方案進(jìn)行遞送。優(yōu)選地，藥物組合物包含腸包衣以保護(hù)AP免受胃液(pH1.0至2.5)的有害影響，并確保AP的有效遞送。在另一實施方案中，將AP在制備改善腎功能減退的藥物中的用途與任何其它治療相結(jié)合(即組合治療)。例如，這些其它治療也意在改善腎功能。意在改善腎功能的其它治療的實例如上所述。非限定性實例是用速尿靈(Lasix)、鈣或透析進(jìn)行的治療。適合的組合治療的其它實例是用AP和至少一種iNOS抑制劑的治療或用AP和至少一種TNFα抑制劑的治療?？梢砸来位蛲瑫r施用活性化合物。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了治療患有腎功能減退的受試者(優(yōu)選為人)的方法，包括向需要AP的受試者施用有效量的AP。在優(yōu)選的實施方案中，所述腎功能減退是由腎衰竭引起的?？梢酝ㄟ^確定患有腎功能降低的受試者將所述方法可以進(jìn)一步延伸。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了治療患有腎功能減退的受試者(優(yōu)選為人)的方法，包括向需要AP的受試者施用有效量的AP，其中所獲得的腎功能改善并非通過AP對LPS解毒的結(jié)果。一個實施方案提供了治療患有腎功能減退的受試者(優(yōu)選為人)的方法，包括向需要AP的受試者施用有效量的AP，其中所述腎功能減退是由于藥物、藥劑和/或毒素所引起或維持或加重的。所述藥物、藥劑和/或毒素優(yōu)選自由以下組成的組：抗生素、蛋白酶抑制劑、化療藥劑、抗炎藥、血壓藥、殺蟲劑、除草劑、乙二醇、造影劑、重金屬和細(xì)菌毒素。本發(fā)明還提供了治療患有腎功能減退的受試者(優(yōu)選為人)的方法，包括向需要AP的受試者施用有效量的AP，其中所述腎功能減退是由于急性腎衰竭所引起或維持或加重的。所述腎功能減退優(yōu)選是由于腎實質(zhì)性急性腎衰竭所引起或維持或加重的。在一個實施方案中，所述急性腎衰竭是由于藥物、藥劑或毒素所引起或維持或加重的，所述藥物、藥劑和/或毒素優(yōu)選自由以下組成的組：氨基糖苷、化療藥劑、造影劑、重金屬和細(xì)菌毒素。進(jìn)一步提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述腎功能減退是由于腎實質(zhì)性急性腎衰竭所引起或維持或加重的。所述腎實質(zhì)性急性腎衰竭優(yōu)選為急性腎小管壞死和/或腎小球腎炎。優(yōu)選地，所述急性腎小管壞死和/或腎小球腎炎是由于藥物或藥劑或毒素所引起或維持或加重的，所述藥物或藥劑或毒素最優(yōu)選自由以下組成的組：氨基糖苷、化療藥劑、造影劑、重金屬和細(xì)菌毒素。進(jìn)一步提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述腎功能減退是由于腎血流降低和/或缺血所引起或維持或加重的。在一個實施方案中，所述腎血流降低和/或缺血是由于脫水、心力衰竭、感染性休克、嚴(yán)重失血、高血壓、動脈粥樣硬化和/或血栓形成所引起或維持或加重的。優(yōu)選地，所述腎血流降低和/或缺血是由于藥物或藥劑或毒素所引起或維持或加重的，所述藥物或藥劑或毒素最優(yōu)選自由以下組成的組：血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑和非甾體抗炎藥(NSAIDs)。進(jìn)一步提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述AP是哺乳動物AP，優(yōu)選是人AP。更優(yōu)選地，AP是胎盤AP、胎盤樣AP、腸AP或肝/骨/腎AP。最優(yōu)選地，AP是重組的。將在以下非限定性實施例中對本發(fā)明進(jìn)行更為詳盡的解釋。附圖說明圖1.腎iNOS表達(dá)和NO和GST的尿排泄。(A)安慰劑治療(空心柱，n＝4)和AP治療(實心柱，n＝8)患者的iNOSmRNA表達(dá)。以管家基因GAPDH(CT＝23.6±0.3,δCT＝12.1±0.1)的平均循環(huán)閾(CT)值對照健康志愿者(數(shù)據(jù)未顯示)中iNOSmRNA的相對表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并將其設(shè)為1。在安慰劑(Δ，n＝5)和AP治療的患者(■，n＝10)中，在干預(yù)后多個時間測定的尿中(B)NO代謝物、(C)GSTA1-1和(D)GSTP1-1水平。利用NO代謝物和GST的尿排泄對肌酸酐排泄進(jìn)行校正，并在完整曲線反復(fù)測定后通過ANOVA進(jìn)行分析。(A)數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±SE，且(B+C+D)表示為25％范圍安慰劑和75％范圍AP的中值。(*；與安慰劑組相比差異顯著,P<0.05)。圖2.對照大鼠、慶大霉素腎毒性大鼠和堿性磷酸酶治療的慶大霉素腎毒性大鼠中的血清肌酸酐水平。圖3.對照大鼠、慶大霉素腎毒性大鼠和堿性磷酸酶治療的慶大霉素腎毒性大鼠中的血清血尿素氮(BUN)水平。圖4.對照大鼠、慶大霉素腎毒性大鼠和堿性磷酸酶治療的慶大霉素腎毒性大鼠中的尿肌酸酐水平。圖5.對照大鼠、慶大霉素腎毒性大鼠和堿性磷酸酶治療的慶大霉素腎毒性大鼠中的肌酸酐清除率。圖6.AP顯著降低順鉑腎毒性后的尿蛋白質(zhì)排泄。假處理：沒有進(jìn)行順鉑處理；對照處理：順鉑+載體；AP：順鉑+堿性磷酸酶。圖7.AP降低順鉑腎毒性后的尿蛋白質(zhì)排泄。假處理：沒有進(jìn)行順鉑處理；對照處理：順鉑+載體；AP：順鉑+堿性磷酸酶。圖8.AP降低伴有腎功能減退的尿毒癥患者的血清肌酸酐。圖9.AP降低伴有腎衰竭的尿毒癥患者的血清肌酸酐(定義為血清肌酸酐>150μmol/L，或在基線時間已經(jīng)過腎替代治療)。圖10.四種人堿性磷酸酶同工酶的序列。注意：這些是成熟蛋白質(zhì)的序列(即沒有信號序列)，但除嵌合AP之外，是在添加GPI錨定物并進(jìn)行C末端氨基酸的伴隨加工之前的序列。具體實施方式實驗部分材料和方法實施例1：AP對敗血癥患者腎功能的影響患者對加護(hù)病房中診斷為腎功能減退的15名患者進(jìn)行隨機(jī)AP治療(2AP：1安慰劑)。治療后，在0至24小時間的若干時間點收集動脈血和導(dǎo)管尿。記錄尿量并在進(jìn)行前述分析(6)前將用于NO代謝物測定的樣品在-80℃冷凍。通過常規(guī)臨床化學(xué)測定肌酸酐和蛋白質(zhì)。干預(yù)牛腸堿性磷酸酶(AP，AM-Pharma，Bunnik，荷蘭)源自于<6月齡小牛的腸粘膜。符合條件的患者在24小時中以2:1的比例靜脈接受AP或匹配的安慰劑(2.5mMTris-HCl、2.5mM氯化鎂、0.05mM氯化鋅，pH7.3，以及40％甘油作為穩(wěn)定劑)。隨機(jī)至AP的患者在10分鐘內(nèi)接受67.5U/kg體重的初始大劑量注射，隨后在剩余的23小時50分鐘內(nèi)接受132.5U/kg的連續(xù)輸注?；瘜W(xué)分析根據(jù)Moshage等(18)，使用Griess反應(yīng)測定穩(wěn)定NO代謝物、硝酸鹽和亞硝酸鹽的總量，以測定NO自由基的產(chǎn)量。將肝素化的血漿和尿樣品分別用蒸餾水稀釋四倍和四十倍。如前所述(19；20)，測定尿液中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶Al-I(GSTAl-I)和GSTPl-I的含量以區(qū)分近端和末梢的腎小管細(xì)胞損傷，并通過ELISA進(jìn)行分析，一式三份。iNOSmRNA表達(dá)的測定在4℃和700g下將尿樣品離心10分鐘。如前所述(6)，將RNA從細(xì)胞沉淀物中分離并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用AppliedBiosystems提供的預(yù)先開發(fā)的GeneExpressionAssay來擴(kuò)增人iNOS和GAPDH(iNOS；Hs00167248_ml,GAPDH；Hs99999905_ml)。全部實驗一式三份進(jìn)行。參照管家基因GAPDH的表達(dá)，對樣品的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。實施例2：AP對慶大霉素引起的腎衰竭的影響在慶大霉素引起的Wistar大鼠腎毒性模型中評價堿性磷酸酶(AP)的影響。連續(xù)7天以120mg/kg通過肌肉注射向動物提供慶大霉素。在第6天24小時內(nèi)收集尿樣品以測定尿量、電解質(zhì)(Na+、K+)、肌酸酐、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)和蛋白質(zhì)。最后，在第7天收集血液樣品；測定血清肌酸酐、BUN和電解質(zhì)(Na+、K+)的濃度。在每天施用慶大霉素前，通過緩慢靜脈注射向慶大霉素處理組(每組n＝8)提供賦形劑或AP(100U/kg)，隨后每12小時另外給藥連續(xù)7天(14次AP劑量總和＝1400U/kg)。對照組(n＝8)在第0天接受一次腹膜注射生理鹽水，并使用與AP所述相同的每天兩次給藥方案緩慢靜脈注射賦形劑。實施例3：AP對順鉑引起的腎衰竭的影響在以7.5mg/kg單次腹膜注射順鉑后(指定為第0天)，在Wistar大鼠中評價堿性磷酸酶(AP)對腎功能的影響。在第2天和第5天的24小時內(nèi)收集尿樣品以測定尿量、電解質(zhì)(Na+、K+)、肌酸酐和蛋白質(zhì)。在第3天和第6天收集血液樣品；測定血清肌酸酐、BUN和電解質(zhì)(Na+、K+)的濃度。在接受順鉑注射前30分鐘，通過緩慢靜脈注射向順鉑處理組(每組n＝8)提供賦形劑或AP(200U/kg)，隨后在12小時后第二次給藥；靜脈給藥將在第1天(x2)和第2天(x1)繼續(xù)，總共5次給藥(總AP劑量為1000U/kg)。對照組(n＝8)在第0天接受一次腹膜注射生理鹽水，并使用與AP所述相同的每日兩次給藥方案緩慢靜脈注射賦形劑。實施例4：AP對患有腎衰竭的敗血癥患者的影響患者對8所獨立的醫(yī)院加護(hù)病房中診斷為敗血癥的36名患者進(jìn)行隨機(jī)AP治療(2AP:1安慰劑)。在治療后0至48小時間的若干時間點收集動脈血和導(dǎo)管尿。將AP治療組和安慰劑處理組作為整體或小組進(jìn)行分析，所述小組限于表現(xiàn)出腎衰竭(定義為基線血清肌酸酐>150μmol/L)或已經(jīng)進(jìn)行腎移植治療的患者。分析各組的血清肌酸酐(通過常規(guī)臨床化學(xué))、死亡率和對腎移植治療的需求。干預(yù)牛腸堿性磷酸酶(AP，AM-Pharma，Bunnik，荷蘭)源自于<6月齡小牛的腸粘膜。符合條件的患者在24小時中以2:1的比例靜脈接受AP或匹配的安慰劑(2.5mMTris-HCl、2.5mM氯化鎂、0.05mM氯化鋅，pH7.3，以及40％甘油作為穩(wěn)定劑)。隨機(jī)至AP的患者在10分鐘內(nèi)接受67.5U/kg體重的初始大劑量注射，隨后在剩余的23小時50分鐘內(nèi)接受132.5U/kg的連續(xù)輸注?？梢杂糜谶M(jìn)一步體現(xiàn)堿性磷酸酶在治療腎功能減退中功效的其它適合模型的實例是：(1)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠急性腎衰竭(J.Nephrol.2005；18:374-381)通過靜脈注射LPS(1mg/kg,來自E.coliO111:B4,Sigma，德國)在雌性Sprague-Dawley大鼠中誘發(fā)急性腎衰竭。此模型的特點是腎小球濾過率降低、血壓降低和NOx排泄增加。(2)實驗性系膜增生性腎小球腎炎的抗Thy-1.1模型如Jefferson等所述(J.Nephrol.1999；12:297-307)，可以通過用Lewis大鼠胸腺細(xì)胞(每次注射2×l08個細(xì)胞)多次免疫山羊來制備山羊-抗-大鼠胸腺細(xì)胞血清。在第二次和第三次注射后收集血清，合并，并使用辛酸法獲得富集IgG的部分。隨后使用20mg/100g體重的單次靜脈給藥來引起180-230g雄性Wistar大鼠患病。(3)鈣誘導(dǎo)的腎小球腎炎如Jacquillet等所述(Am.J.Physiol.RenalPhysiol.2006；290:127-137)，通過在5天中每日腹腔注射500μgCd2+/kg使其中毒，并隨后不做任何處理被放置15天的大鼠顯示出腎小球濾過率降低。在這些實驗?zāi)Ｐ椭?，將通過靜脈途徑施用堿性磷酸酶，以預(yù)防、減緩、終止或逆轉(zhuǎn)疾病過程?？梢栽诩膊∫l(fā)前或在疾病建立早起或后期施用堿性磷酸酶。可以單次施用堿性磷酸酶，或在疾病建立期間，可以施用多次或連續(xù)輸注堿性磷酸酶。例如以10U/kg/天至500U/kg/天的劑量范圍施用堿性磷酸酶。功效參數(shù)可以選自但不限于：炎性參數(shù)(浸潤、白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化態(tài)、細(xì)胞因子產(chǎn)生、補(bǔ)體活化)、氧化應(yīng)激(H2O2產(chǎn)生、腎中髓過氧物含量、iNOS誘導(dǎo)、NOx產(chǎn)生等)、腎損傷(抗體處理、凝血、組織學(xué))和血液化學(xué)，如肌酸酐水平。結(jié)果實施例1：AP對敗血癥患者腎功能的影響患者在15個月的周期中隨機(jī)分配腎功能減退的15名患者(AP,n＝10；安慰劑,n＝5)。AP減弱腎iNOS誘導(dǎo)在基線時間和干預(yù)后最初24小時內(nèi)的3個獨立時間點的尿樣品中分離細(xì)胞沉淀物，使用Q-PCR(或定量RT-PCR)來測定細(xì)胞沉淀物中iNOSmRNA的水平。如前所述(6)，參照相對于管家基因GAPDH(CT＝23.6±0.3,δCT＝12.1±0.1)的平均循環(huán)域(CT)值，對照健康志愿者(n＝4,數(shù)據(jù)未顯示)中iNOS的相對表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并設(shè)為1。與對照相比，患者組中iNOS表達(dá)被誘導(dǎo)提高了42倍，且施用AP在最初24小時內(nèi)將此誘導(dǎo)降低了80±5％。與此相反，與基準(zhǔn)水平相比，安慰劑處理的患者在治療后的最初24小時內(nèi)iNOS水平進(jìn)一步增加(840±85％，圖1A)。血液中NO代謝物在AP和安慰劑處理的患者之間未有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，在施用AP24小時后，NO代謝物的尿排泄降低了80％[-85--75]，從基準(zhǔn)的227[166-531]降至41[28-84]μmol/10mmol肌酸酐,(P<0.05)。在安慰劑治療后，尿NO代謝物的含量進(jìn)一步增加了70％[45-570](從81[64-419]增至628[65-1479]μmol/l0mmol肌酸酐,P<0.05)。此外，在AP治療的患者中累積的尿NO代謝物排泄顯著降低(圖1B)。AP減弱腎損傷在28天的隨訪期患者均不需要腎替代治療。如表1所示，全部患者顯示出帶有輕微蛋白尿癥的腎功能損傷。如表1所示，在最初24小時，血漿肌酸酐清除率在AP治療的患者中改善了45％[30-180]，而在安慰劑治療的病人中惡化了25％[-35--15]。在隨訪期，中間血漿肌酸酐水平在AP治療的患者中顯著下降，而在安慰劑治療的患者中未觀察到顯著變化(表1)。在全部患者中，GSTAl-I和GSTPl-I的尿排泄均升高，分別表明近端和末梢的腎小管損傷。在最初24小時，與安慰劑治療的患者中增加200％[45-525](從26.9[15.2-32.8]增至38.9[33.0-205.8],P<0.05)相比，在AP治療的患者尿中GSTAl-I的含量降低了70％，從32.7[11.5-131.1]降至6.5[5.4-15.7]μg/10mmol肌酸酐(P<0.05)。在AP治療的患者中累積的尿GSTAl-IA排泄顯著降低(圖1C)。此外，基于AP治療，尿GSTPl-I排泄的增加有減緩的趨勢(在24小時后從基準(zhǔn)的22.7[13.6-41.3]至11.9[8.5-82.5]μg/10mmol肌酸酐,P＝0.072)。然而，在治療的最初24小時，在兩個治療組間未觀察到累積的尿GSTPl-I排泄的顯著差異(圖1D)。實施例2：AP對慶大霉素引起的腎衰竭的影響慶大霉素(120mg/kg×7)引起嚴(yán)重的大鼠腎損傷，表現(xiàn)為多尿癥、蛋白尿癥、電解質(zhì)排泄降低、FENa增加、酶尿(NAG)、血清肌酸酐和BUN升高、肌酸酐清除率減少、腎小球濾過率的測量值和腎重量增加。每日兩次AP注射(100U/kg每天兩次×14)(第一次給藥在每天施用慶大霉素之前)導(dǎo)致血清肌酸酐(圖2)和BUN(圖3)水平降低，以及尿中肌酸酐排泄的增加(圖4)。這些改善是AP治療所導(dǎo)致的肌酸酐清除率增加的結(jié)果(圖5)。在此實施例中，在BUN、SCr、CCr和UCr方面，AP(100U/kgIV每天兩次×7)顯示出對慶大霉素引起的大鼠腎毒性具有保護(hù)作用。實施例3：AP對順鉑引起的腎衰竭的影響順鉑(7.5mg/kg,經(jīng)腹腔)引起腎功能減退，體現(xiàn)為以下參數(shù)：多尿癥、蛋白尿癥、電解質(zhì)排泄降低、血清肌酸酐和BUN升高、肌酸酐清除率減少、腎小球濾過率的測量值。在此實施例中，AP(200U/kg×5,經(jīng)靜脈)顯示出保護(hù)大鼠免于產(chǎn)生順鉑引起的蛋白尿癥(圖6)(測定此模型中腎小管損傷的方式)，并改善內(nèi)源性肌酸酐清除率。實施例4：AP對患有腎衰竭的敗血癥患者的影響患者將36名敗血癥患者隨機(jī)分配進(jìn)行安慰劑(n＝11)或AP(n＝25)治療，并分析血清肌酸酐水平、對腎替代治療的需要和死亡率。此外，對在基線時間表現(xiàn)出腎衰竭的小組(安慰劑n＝5；APn＝11)進(jìn)行這些結(jié)果的分析。血清肌酸酐在基線時間和干預(yù)后12小時、24小時和48小時測定血清肌酸酐水平。圖8顯示了敗血癥患者組在基線時間血清肌酸酐水平增加，說明腎功能減退。圖8還顯示了AP能夠在治療開始后48小時內(nèi)降低血清肌酸酐水平，而安慰劑治療則不能。如果分析僅局限于表現(xiàn)出腎衰竭的患者(定義為血清肌酸酐>150μmol/L，或在基線時間已經(jīng)過腎替代治療)，則此效果會更加顯著(圖9)。因此，從此實施例中可以得出AP能夠改善敗血癥患者的腎功能，且此影響在表現(xiàn)出腎衰竭的敗血癥患者中更加顯著。腎替代治療表II顯示了在研究中所包括的全部患者中，36％的安慰劑治療患者需要腎替代治療(透析)，然而24％的AP治療的患者需要此治療。在基線時間已表現(xiàn)出腎衰竭的患者中，此比例分別為80％和27％。因此，此實施例中顯示的數(shù)據(jù)表明AP能夠降低表現(xiàn)出腎衰竭的敗血癥患者對透析的需要。死亡率在90天觀察期中，在研究的群體中全因死亡率是28％(表II)。AP治療的死亡率(24％)相對安慰劑治療的死亡率(36％)略有優(yōu)勢。然而，在敗血癥中，腎衰竭是最常見的末梢器官衰竭，在此研究中體現(xiàn)為表現(xiàn)出腎衰竭的小組中死亡率較高(腎衰竭組為36％，而全部患者中為28％)。令人感興趣的是，在腎衰竭組中AP對降低死亡率的影響更加顯著(安慰劑組為60％，AP治療組為27％)。在此實施例中，顯示出AP治療(200U/kg/24h)改善表現(xiàn)出腎功能減退的敗血癥患者的腎功能，因此降低死亡率和對腎替代治療的需要。表I:腎功能數(shù)據(jù)以中值表示(25-75％范圍)。與安慰劑組相比有顯著差異，*P<0.05，或與基線時間相比，##P<0.01。表II:死亡率和腎替代治療RRT:腎替代治療*在基線時間血清肌酸酐>150μmol/L或在基線時間已經(jīng)過RRT參考文獻(xiàn)1.HendrixPG,HoylaertsMF,NouwenEJandDeBroeME.Enzymeimmunoassayofhumanplacentalandgerm-cellalkalinephosphataseinserum.ClinChem1990；36(10):1793-1799.2.LeDuM-H,MillanJL.Structuralevidenceoffunctionaldivergenceinhumanalkalinephosphatases.JBiolChem2002；51:49808-49814.6.HeemskerkS,PickkersP,BouwMP,DraismaA,vanderHoevenJG,PetersWHetal.Up-regulationofrenalinduciblenitricoxidesynthaseduringhumanendotoxemiaandsepsisisassociatedwithproximaltubuleinjury.ClinJAmSocNephrol2006；1:853-62.18.Mo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