本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種組合物及其在制備改善慢性鼻炎的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：慢性鼻炎(chronicrhinitis)是鼻腔粘膜和粘膜下層的慢性炎癥。表現(xiàn)為鼻粘膜的慢性充血腫脹，稱慢性單純性鼻炎(chronicsimplerhinitis)。其主要特點(diǎn)是炎癥持續(xù)三個(gè)月以上或反復(fù)發(fā)作，經(jīng)久不愈，間歇期亦不能恢復(fù)正常，且無(wú)明確的致病微生物，伴有不同程度的鼻塞，分泌物增多，鼻黏膜腫脹或增厚等障礙。引起慢性鼻炎的因素很多，主要分為全身因素、局部因素和環(huán)境因素3類。如如貧血、結(jié)核、糖尿病、風(fēng)濕病、急性傳染病后及慢性心、肝、腎疾病等，均可引起鼻黏膜長(zhǎng)期淤血或反射性充血；鼻腔及鼻竇的慢性炎癥，或臨近感染灶的影響，促使發(fā)生慢性鼻炎；職業(yè)或生活環(huán)境中長(zhǎng)期吸入各種粉塵，如煤、巖石、水泥、面粉、石灰等可損傷鼻黏膜纖毛功能，引起慢性鼻炎。在常規(guī)慢性鼻炎治療中，西醫(yī)主要采用粘膜血管收縮劑、口服抗菌藥或手術(shù)等，有一定療效，但難以消除全部癥狀。中醫(yī)采用各類中藥材熬制而成。但總體而言，目前并沒有改善慢性鼻炎的特效藥，進(jìn)一步該法用于改善慢性鼻炎的產(chǎn)品具有十分重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種組合物及其在制備改善慢性鼻炎的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種組合物，包括中藥提取物、干細(xì)胞提取物A和干細(xì)胞提取物B；中藥提取物由金銀花和薄荷水煎提取制得；干細(xì)胞提取物A由干細(xì)胞的培養(yǎng)上清液過濾、濃縮后凍干制得；干細(xì)胞提取物B由干細(xì)胞勻漿后與Tris-HCl溶液混合，離心后沉淀以乙酸水溶液溶解制得干細(xì)胞提取物B。每100mL組合物中包括干細(xì)胞提取物A20mg～200mg；干細(xì)胞提取物B50μg～100μg；余量為中藥提取物。一些實(shí)施例中，每100mL組合物中包括干細(xì)胞提取物A20mg；干細(xì)胞提取物B50μg；余量為中藥提取物。一些實(shí)施例中，每100mL組合物中包括干細(xì)胞提取物A100mg；干細(xì)胞提取物B100μg；余量為中藥提取物。一些實(shí)施例中，每100mL組合物中包括干細(xì)胞提取物A200mg；干細(xì)胞提取物B80μg；余量為中藥提取物。本發(fā)明提供的組合物中，干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。具體的，干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得方法為市場(chǎng)購(gòu)得或自行制備本發(fā)明對(duì)此不做限定，其實(shí)施皆在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。干細(xì)胞的制備方法包括：步驟1：臍帶以含有200U/m雙抗的PBS溶液沖洗3遍后，剪成2cm長(zhǎng)小段，剝?nèi)?dòng)、靜脈管和外膜后，剪碎成1-2mm2小塊，均勻貼附于10cm培養(yǎng)皿，37℃5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)倒放1-2h；培養(yǎng)基為X-VIVO15無(wú)血清培養(yǎng)基。步驟2：加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃5％CO2培養(yǎng)2～3天后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)6～8天，待細(xì)胞從組織塊中爬出，棄去組織塊繼續(xù)培養(yǎng)；步驟3：待生長(zhǎng)至80％融合，倒去培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS終止消化，400g離心5min收集臍帶間充質(zhì)細(xì)胞。本發(fā)明中，干細(xì)胞的培養(yǎng)的采用含有EGF的X-VIVO15無(wú)血清培養(yǎng)基；其中EGF的濃度為10ng/mL。干細(xì)胞的培養(yǎng)方法為，將細(xì)胞接種至含有EGF的X-VIVO15無(wú)血清培養(yǎng)基37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至80％融合后繼續(xù)傳代。干細(xì)胞提取物A的制備方法包括：將干細(xì)胞培養(yǎng)上清液以0.45μm濾膜過濾后，濾液再經(jīng)0.22μm濾膜過濾，所得濾液以切向流過濾器循環(huán)過濾3h后，經(jīng)冷凍干燥制得干細(xì)胞提取物A。干細(xì)胞培養(yǎng)上清液為P2或P3代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。干細(xì)胞提取物B的制備方法包括：步驟1：收集干細(xì)胞以生理鹽水清洗后，與緩沖液混合，進(jìn)行勻漿；步驟2：步驟1中所得勻漿液與Tris-HCl溶液混合后，18000rpm離心10min，取沉淀以濃度為0.1mol/L乙酸水溶液溶解制得干細(xì)胞提取物B。步驟1中所述緩沖液中含有HEPES、MgCl2和EGTA；其中，HEPES的濃度為50mmol/L；MgCl2的濃度為3mmol/L；EGTA的濃度為1mmol/L。該緩沖液的pH值為7.4。作為優(yōu)選，步驟2中勻漿液與Tris-HCl溶液混合后，18000rpm離心10min的操作重復(fù)3次。所述Tris-HCl溶液的濃度為50mmol/L，pH值為7.4。所述勻漿液與Tris-HCl溶液的體積比為1:1至1:5。本發(fā)明實(shí)施例中，每μg干細(xì)胞提取物B由0.04×107個(gè)細(xì)胞制成。一些實(shí)施例中，中藥提取物中金銀花與薄荷的質(zhì)量比為1：(1～5)。水煎提取中藥提取物中，金銀花與薄荷的質(zhì)量之和與水的質(zhì)量體積比為1:10至1:50。所述水煎提取的溫度為80～100℃，時(shí)間為30min～60min.水煎提取后，以100目篩網(wǎng)過濾，獲得中藥提取物。每100ml中藥由100～500g金銀花，100～500g薄荷制成。本發(fā)明提供的組合物在制備改善慢性鼻炎的產(chǎn)品中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明，相對(duì)于不做處理的對(duì)照組，本發(fā)明提供的組合物能夠顯著改善慢性鼻炎模型小鼠的嚴(yán)重程度，流涕、噴嚏、鼻癢癥狀減輕。相對(duì)于巾給予中藥提取物的對(duì)照組和僅給予干細(xì)胞提取物A和B的對(duì)照組，本發(fā)明提供的組合物對(duì)鼻炎模型小鼠癥狀的改善效果皆存在顯著性差異(p<0.05)。本發(fā)明還提供了一種改善慢性鼻炎的產(chǎn)品，包括本發(fā)明提供的的組合物。本發(fā)明提供的組合物可單獨(dú)用于改善慢性鼻炎，也可添加其他輔料制成不同的劑型用于改善慢性鼻炎，本發(fā)明對(duì)此不做限定。優(yōu)選劑型為噴劑。實(shí)驗(yàn)表明，給予本發(fā)明提供的組合物制成的噴劑能夠有效改善慢性鼻炎，有效率可達(dá)95％；治愈率可達(dá)60％。本發(fā)明還提供了一種改善慢性鼻炎的方法，該方法為給予本發(fā)明提供的組合物。給予本發(fā)明提供的組合物的劑量為每次1-2滴/孔。本發(fā)明提供了一種組合物，其中包括中藥提取物、干細(xì)胞提取物A和干細(xì)胞提取物B。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的組合物能夠顯著改善慢性鼻炎的癥狀，將其用于治療慢性鼻炎，有效率可達(dá)95％；治愈率可達(dá)60％。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種組合物及其在制備改善慢性鼻炎的產(chǎn)品中的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臍帶以含有200U/m雙抗的PBS溶液沖洗3遍后，剪成2cm長(zhǎng)小段，剝?nèi)?dòng)、靜脈管和外膜后，剪碎成1-2mm2小塊，均勻貼附于10cm培養(yǎng)皿，37℃5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)倒放1-2h；培養(yǎng)基為X-VIVO15無(wú)血清培養(yǎng)基加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃5％CO2培養(yǎng)2～3天后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)6～8天，待細(xì)胞從組織塊中爬出，棄去組織塊繼續(xù)培養(yǎng)；待生長(zhǎng)至80％融合，倒去培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS終止消化，400g離心5min收集臍帶間充質(zhì)細(xì)胞。以含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15無(wú)血清培養(yǎng)基重懸臍帶間充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果接種2-3皿(接種密度為1-5×105cell/ml)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合后繼續(xù)傳代，至P2或P3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞和培養(yǎng)上清液的收集。實(shí)施例2干細(xì)胞提取物A的制備收集實(shí)施例1中制得的P2和P3代干細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用Slice200切向流過濾器濃縮，循環(huán)過濾的時(shí)間為3h，該過程中，經(jīng)0.45μm濾膜過濾除去大顆粒物質(zhì)，再經(jīng)0.22μm濾膜過濾，除去3kDa以下小顆粒物質(zhì)；濃縮液用凍干機(jī)制成凍干粉，即為干細(xì)胞提取物A。實(shí)施例3干細(xì)胞提取物B的制備1、收集實(shí)施例1中制得的P2和P3代干細(xì)胞，消化收集。收集細(xì)胞懸液與50ml離心管，400g離心，去上清液，加生理鹽水清洗兩遍。2、沉淀細(xì)胞中加入冰冷的勻漿液(HEPES:50mM，PH7.4，MgCl2：3mM，EGTA：1mM)將溶液和沉淀轉(zhuǎn)移到勻漿器中，勻漿。3、將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中，加入適量的Tris–HCl(50mM,pH7.4)4℃，18000rpm(40000g)離心10分鐘。在沉淀中加入同前量的勻漿液，再勻漿，勻漿后加入適量的tris-HClbuffer.4℃18000rpm(40000g)離心，共離心三次。4在最后一次離心得到沉淀中加入0.1M的乙酸溶液溶解，于-80℃冰箱中備用。實(shí)施例4中藥提取物的制備1.取金銀花和薄荷按1:1的質(zhì)量比混合后，取混合物200g加入1L水煎提取后(80℃熬制60min)，冷卻。(每100ml提取物由100g金銀花，100g薄荷制成)。實(shí)施例5中藥提取物的制備1.取金銀花和薄荷按1:5的質(zhì)量比混合后，取混合物200g加入1L水煎提取后(100℃熬制30min)，冷卻。(每100ml提取物由100g金銀花，500g薄荷制成)。實(shí)施例6組合物的制備混合實(shí)施例4制得的中藥提取物、實(shí)施例3制得的干細(xì)胞提取物B，加入實(shí)施例2制得的干細(xì)胞提取物A，制得組合物每100ml組合物中含有：干細(xì)胞提取物A20mg干細(xì)胞提取物B50μg其余為中藥提取物。實(shí)施例7組合物的制備混合實(shí)施例5制得的中藥提取物、實(shí)施例3制得的干細(xì)胞提取物B，加入實(shí)施例2制得的干細(xì)胞提取物A，制得組合物每100ml組合物中含有：干細(xì)胞提取物A100mg干細(xì)胞提取物B100μg其余為中藥提取物。實(shí)施例8組合物的制備混合實(shí)施例5制得的中藥提取物、實(shí)施例3制得的干細(xì)胞提取物B，加入實(shí)施例2制得的干細(xì)胞提取物A，制得組合物每100ml組合物中含有：干細(xì)胞提取物A200mg干細(xì)胞提取物B80μg其余為中藥提取物。實(shí)施例9組合物對(duì)動(dòng)物模型鼻炎癥狀的改善1、鼻炎動(dòng)物模型構(gòu)建：取健康Wistar大鼠若干只，以卵清蛋白(OVA)作為致敏原進(jìn)行致敏作用，具體操作如下：a取0.3mg的OVA和30mg的佐劑Al(OH)3，加生理鹽水1ml形成混懸液，進(jìn)行腹腔注射，隔日一次，共7次；b用0.5％的OVA生理鹽水滴鼻。每側(cè)0.05ml，每日一次，共7次。當(dāng)出現(xiàn)嚴(yán)重鼻癢、抓撓鼻、噴嚏、流涕則動(dòng)物模型構(gòu)建成功。2、給藥實(shí)驗(yàn)：取鼻炎模型構(gòu)建成功大鼠35只，隨機(jī)分成7組，分別進(jìn)行給藥，其中，對(duì)照組1：不進(jìn)行任何藥物使用；對(duì)照組2：公開號(hào)為CN105311003的專利藥物；對(duì)照組3：實(shí)施例5中藥提取物；對(duì)照組4：生理鹽水中混合實(shí)施例3干細(xì)胞提取物B80μg(3.2×107個(gè)細(xì)胞)、實(shí)施例2干細(xì)胞提取物A200mg；實(shí)驗(yàn)組1：給予實(shí)施例6組合物；實(shí)驗(yàn)組2：給予實(shí)施例7組合物；實(shí)驗(yàn)組3：給予實(shí)施例8組合物；連續(xù)7天，每天2次，每次1ml，第7天觀察狀態(tài)。3、效果評(píng)估：鼻癢輕度：1分，輕擦鼻幾次；重度：2分，抓撓鼻、面不止，到處摩擦；噴嚏輕度：1分，1～3個(gè)/小時(shí)；中度：2分，4～10個(gè)/小時(shí)；重度：3分，11個(gè)以上/小時(shí)；流涕輕度：1分，留到鼻前孔中度：2分，流過鼻前孔重度：3分，流涕滿面；4、評(píng)分結(jié)果表1評(píng)分結(jié)果組別分值對(duì)照組18.25對(duì)照組24.8對(duì)照組35.2對(duì)照組43.4實(shí)驗(yàn)組10.25實(shí)驗(yàn)組20.25實(shí)驗(yàn)組30.4實(shí)驗(yàn)表明，相對(duì)于不做處理的對(duì)照組，本發(fā)明提供的組合物能夠顯著改善慢性鼻炎模型小鼠的嚴(yán)重程度，流涕、噴嚏、鼻癢癥狀減輕。相對(duì)于巾給予中藥提取物的對(duì)照組和僅給予干細(xì)胞提取物A和B的對(duì)照組，本發(fā)明提供的組合物對(duì)鼻炎模型小鼠癥狀的改善效果皆存在顯著性差異(p<0.05)。實(shí)施例10組合物對(duì)受試人群鼻炎癥狀的改善選取100名慢性鼻炎志愿者(男性65名，女性35名，年齡20-55歲，平均年齡37歲，慢性鼻炎時(shí)間2-8年)，隨機(jī)分成5組，分別進(jìn)行如下試驗(yàn)：對(duì)照組1：不進(jìn)行任何藥物使用；對(duì)照組2：公開號(hào)為CN105311003的專利藥物；對(duì)照組3：實(shí)施例5中藥提取物；對(duì)照組4：生理鹽水中混合實(shí)施例3干細(xì)胞提取物B80μg(3.2×107個(gè)細(xì)胞)、實(shí)施例2干細(xì)胞提取物A200mg；實(shí)驗(yàn)組1：給予實(shí)施例6組合物；實(shí)驗(yàn)組2：給予實(shí)施例7組合物；實(shí)驗(yàn)組3：給予實(shí)施例8組合物；各組組合物制成噴劑，每天早中晚各一次，所有人群持續(xù)使用半年，調(diào)查效果：治愈率＝治愈數(shù)/病例數(shù)有效率＝(好轉(zhuǎn)數(shù)+治愈數(shù))/病例數(shù)得到結(jié)果如下表：表2治療效果實(shí)驗(yàn)表明，給予本發(fā)明提供的組合物制成的噴劑能夠有效改善慢性鼻炎，有效率可達(dá)95％；治愈率可達(dá)60％。該效果顯著優(yōu)于對(duì)照組。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3