本發(fā)明涉及細胞制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種軟骨干細胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：關(guān)節(jié)軟骨是一種黏彈性物質(zhì)，不同活動部位表現(xiàn)不同的負荷-承載特性。關(guān)節(jié)軟骨的這一重要特性及其減少關(guān)節(jié)表面摩擦的作用是軟骨超微結(jié)構(gòu)組成和化學(xué)構(gòu)成的基本功能體現(xiàn)，關(guān)節(jié)軟骨由稀疏的細胞排列而成，無血管、淋巴和神經(jīng)供應(yīng)。關(guān)節(jié)軟骨在關(guān)節(jié)活動中起重要作用，其結(jié)構(gòu)非常精細、科學(xué)，以適應(yīng)不同的功能需要。創(chuàng)傷或運動損傷常導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的急性損傷，引起關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前，關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療方法主要包括：1、關(guān)節(jié)清理和沖洗：關(guān)節(jié)鏡下清理和沖洗對無局部癥狀的關(guān)節(jié)炎沒有顯著的長期療效，只有在仔細篩選手術(shù)適應(yīng)證，關(guān)節(jié)鏡清理后才能獲得一定療效。2、骨軟骨骨折固定：首先用拋刀、銼或刮匙將無活性的壞死片段予以去除，對臨床上不穩(wěn)定的骨軟骨病片段，X射線片上如果帶有足夠大的軟骨下骨，可以給予固定。固定材料：無頭的金屬空心釘及生物可吸收材料。3.、骨髓刺激技術(shù)：(1)關(guān)節(jié)打磨成形術(shù)：打磨成形術(shù)是一種傳統(tǒng)的關(guān)節(jié)鏡下手術(shù)，利用拋刀和磨鉆取出1～2mm的硬化骨質(zhì)，打入到血管豐富的軟骨下骨板，這樣可以促進纖維凝塊的形成，以后成為纖維軟骨。(2)顯微骨折：微骨折技術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損是骨科臨床和實驗研究的熱點之一，其是由軟骨下鉆孔術(shù)演變而來，同屬于骨髓刺激技術(shù)。4、軟骨移植技術(shù)綜上所述，正常關(guān)節(jié)軟骨的復(fù)雜性和組織上的高度特異性決定了關(guān)節(jié)軟骨一旦損傷或失去后很難修復(fù)。目前還可通過工程支架來實現(xiàn)軟骨修復(fù)，但方法存在組織相容性，并且很難控制支架的降解速度。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，干細胞在治療各種疾病模型中的研究愈來愈多，由于它具有自我更新并可分化成多種類型的細胞，有著廣泛的應(yīng)用前景，因此也被作為治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的主要研究對象。但直接通過干細胞注射治療關(guān)節(jié)軟骨損傷存在細胞存活率偏低、細胞增殖困難的缺點。因此，急需提供一種可有效治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的藥物制劑。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了一種軟骨干細胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。該軟骨干細胞制劑可有效修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種軟骨干細胞制劑，包括軟骨干細胞和富血小板血漿(PRP)。PRP釋放多種高濃度的生長因子，其比例與體內(nèi)正常比例相符，具有最佳的協(xié)同作用。既有單一因子的生物學(xué)效應(yīng)，又有各種生長因子之間的相互作用。PRP中的血小板有促進凝血的作用，可刺激軟骨組織再生，促進傷口愈合。本發(fā)明軟骨干細胞制劑中PRP可明顯減少注射間充質(zhì)干細胞的死亡，并促進軟骨干細胞的增殖及基質(zhì)分泌，而不會影響到蛋白聚糖和膠原的類型。研究結(jié)果顯示本發(fā)明軟骨干細胞制劑可有效修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨損傷。作為優(yōu)選，軟骨干細胞在軟骨干細胞制劑中的濃度為(1～6)×107細胞/mL。在本發(fā)明提供的實施例中，軟骨干細胞在軟骨干細胞制劑中的濃度為1×107細胞/mL。在本發(fā)明提供的另一實施例中，軟骨干細胞在軟骨干細胞制劑中的濃度為3×107細胞/mL。在本發(fā)明提供的另一實施例中，軟骨干細胞在軟骨干細胞制劑中的濃度為6×107細胞/mL。作為優(yōu)選，軟骨干細胞制劑的pH值為6.5～7.5。作為優(yōu)選，軟骨干細胞制劑的滲透壓為280～320毫滲當(dāng)量/升。作為優(yōu)選，軟骨干細胞為自體軟骨干細胞。作為優(yōu)選，富血小板血漿為自體富血小板血漿。本發(fā)明還提供了該軟骨干細胞制劑在制備修復(fù)關(guān)節(jié)損傷的藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明提供的實施例中，關(guān)節(jié)為膝關(guān)節(jié)。作為優(yōu)選，藥物的施用部位為關(guān)節(jié)腔內(nèi)。本發(fā)明還提供了該軟骨干細胞制劑的制備方法，包括將軟骨干細胞重懸于富血小板血漿中，得到軟骨干細胞制劑。在本發(fā)明提供的實施例中，軟骨干細胞的制備方法為：將軟骨組織剪碎，采用胰蛋白酶進行消化，然后采用II型膠原酶進行消化，得到單個細胞；單個細胞經(jīng)原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)后，得到軟骨干細胞。作為優(yōu)選，采用胰蛋白酶進行消化的溫度為37℃，時間為1～2h。作為優(yōu)選，采用II型膠原酶進行消化的溫度為37℃，時間為17～20h。在本發(fā)明提供的實施例中，富血小板血漿的制備方法為：將外周血400g離心10min，分為3層；取上層和中層液體400g離心5min，分為3層；取上層和中層液體1200g離心5min，得到富血小板血漿。本發(fā)明提供了一種軟骨干細胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。該軟骨干細胞制劑包括軟骨干細胞和富血小板血漿。本發(fā)明具有的有益效果為：1、本發(fā)明提供的軟骨干細胞制劑可有效修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷，效果好于透明質(zhì)酸鈉聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞的治療效果；2、作為優(yōu)選，本發(fā)明采用的軟骨干細胞或PRP完全是自身的，無毒、無免疫原性，對患者損傷小，不存在免疫排斥問題和傳播疾病的危險；3、作為優(yōu)選，藥物的施用部位為關(guān)節(jié)腔內(nèi)，關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)都在關(guān)節(jié)腔內(nèi)，可以防止軟骨干細胞和血小板的流失，使其在局部長時間分泌生長因子，保持較高的生長因子濃度有利于軟骨細胞歸巢。具體實施方式本發(fā)明公開了一種軟骨干細胞制劑及其制備方法和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的軟骨干細胞制劑及其制備方法和應(yīng)用中所用生物材料、試劑和儀器均可由市場購得。下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：實施例1軟骨干細胞的分離及培養(yǎng)①無菌條件下分離非受力部位關(guān)節(jié)軟骨，剝離包裹軟骨組織的筋膜和軟骨膜，放入盛有PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中。②將分離得到的軟骨組織剪碎成0.3-0.5mm的組織塊，移入T25培養(yǎng)瓶，用含雙抗的PBS緩沖液沖洗軟骨3次。③加入軟骨體積19-15倍的0.25％胰蛋白酶，37℃消化1-2小時后終止消化。④加入0.02％II型膠原酶，37℃消化17-20小時。⑤在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)游離出單個細胞后，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基將II型膠原酶稀釋終止消化。⑥將細胞團吹打成單個細胞后用200目濾網(wǎng)過濾，收集濾液，1500rpm/min離心5min。⑦棄上清，加入DS培養(yǎng)液重懸，0.2％臺盼藍染色，活細胞率大于90％，把細胞懸液稀釋成(2～3)×105細胞/ml，接種于培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。⑧原代培養(yǎng)：將消化所得的細胞懸液以(2～3)×105細胞/ml接種于T25培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5ml細胞懸液。把培養(yǎng)瓶置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，飽和濕度，5％CO2，95％空氣)。48h后視細胞貼壁情況更換培養(yǎng)液，以后每兩天更換培養(yǎng)液1次。⑨傳代培養(yǎng)：當(dāng)?shù)怪蔑@微鏡觀察軟骨細胞匯合度達90％，傾去培養(yǎng)液，加入0.25％胰蛋白酶2ml，室溫下靜止5～10min，在倒置顯微鏡下若觀察到細胞皺縮變圓，個別細胞開始浮游，此時應(yīng)迅速加入新鮮培養(yǎng)液終止消化，吹打細胞使其分散形成單個軟骨細胞懸液，1500rpm/min離心5min，按照前述方法分瓶培養(yǎng)或凍存以備用。實施例2PRP的制備①無菌采集獲取自體外周全血10ml；②轉(zhuǎn)入15ml離心管，400g離心10min，此時分為3層，上層乏血小板血漿，中層富血小板，下層血細胞；③轉(zhuǎn)移上層和全部中層到新的15ml離心管，400g離心5min，此時分為3層，上層乏血小板血漿，中層富血小板，下層有少量血細胞；④將上層和中層轉(zhuǎn)移入新的15ml離心管，盡量不要吸到血細胞，1200g離心5min，留取需要體積的血漿，并重懸底部血小板，即得PRP。實施例3注射制劑的制備將實施例1獲得的軟骨干細胞經(jīng)實施例2獲得的PRP重懸為1×107細胞/ml，用于注射到患處。該細胞制劑的pH為7.2；滲透壓范圍為303毫滲當(dāng)量/升之間。實施例4注射制劑的制備將實施例1獲得的軟骨干細胞經(jīng)實施例2獲得的PRP重懸為3×107細胞/ml，用于注射到患處。該細胞制劑的pH為7.3；滲透壓為290毫滲當(dāng)量/升。實施例5注射制劑的制備將實施例1獲得的軟骨干細胞經(jīng)實施例2獲得的PRP重懸為6×107細胞/ml，用于注射到患處。該細胞制劑的pH為7.4；滲透壓為315毫滲當(dāng)量/升之間。實施例6膝關(guān)節(jié)軟骨損傷治療研究采用本發(fā)明實施例3～5制得的注射制劑進行膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療研究。具體試驗方法如下：取健康大白仔豬25頭，隨機分為5組：實驗組1：采用實施例3注射制劑進行治療；實驗組2：采用實施例4注射制劑進行治療；實驗組3：采用實施例5注射制劑進行治療；陽性對照組：骨髓間充質(zhì)干細胞+透明質(zhì)酸鈉組陰性對照組：生理鹽水組。通過雙膝關(guān)節(jié)人為制造直徑為5mm的圓斑損傷，建立膝關(guān)節(jié)軟骨損傷模型。造模后，實驗組關(guān)節(jié)上腔注射本發(fā)明0.5ml，陽性對照組關(guān)節(jié)上腔注射1％透明質(zhì)酸鈉+骨髓間充質(zhì)干細胞0.5ml，陰性對照組關(guān)節(jié)上腔注射生理鹽水0.5ml，一周1次，連續(xù)8周完成治療。治療結(jié)束后處死動物，進行病理學(xué)觀察，根據(jù)Mankin骨關(guān)節(jié)病組織學(xué)分類方法，對軟骨進行評分，記錄積分。陽性對照組干細胞制劑制備方法：采用1％透明質(zhì)酸重懸骨髓間充質(zhì)干細胞，細胞濃度為1×107細胞/ml，pH為7.35，滲透壓為295毫滲當(dāng)量/升。陰性對照生理鹽水的pH為6.9，滲透壓為312毫滲當(dāng)量/升。各組豬膝關(guān)節(jié)軟骨病理積分見下表：表1豬膝關(guān)節(jié)軟骨病理積分表動物組別病理積分實驗組15.16±0.37實驗組24.72±0.56實驗組33.34±0.78陽性對照組7.12±0.61陰性對照組12.58±0.97由上表可以看出，實驗組和陽性對照組均可顯著改善豬膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，且實驗組較陽性對照組亦有顯著性差異，說明本發(fā)明注射制劑較透明質(zhì)酸鈉聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞治療效果顯著。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3