本發(fā)明屬于骨質(zhì)疏松內(nèi)固定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種BMP-9基因結(jié)合阿倫磷酸鈉(Alendronate Aln)對(duì)骨質(zhì)疏松內(nèi)固定的模型。

背景技術(shù)：

骨質(zhì)疏松時(shí)，患者的骨代謝處于高轉(zhuǎn)換狀態(tài)，骨的生物機(jī)械強(qiáng)度減低，骨脆性增加，在需要行植入物內(nèi)固定手術(shù)時(shí)，鉆孔或螺釘、假體的植入容易引起細(xì)微骨折和局部熱損傷，誘發(fā)早期內(nèi)植物周圍的炎性反應(yīng)，使破骨細(xì)胞聚集增多，引起骨溶解或骨吸收發(fā)生，而骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)自身修復(fù)的因子表達(dá)缺乏，骨修復(fù)作用降低，最終導(dǎo)致螺釘松動(dòng)，假體的移位、下沉，手術(shù)失敗。近年來，內(nèi)植物-骨界面的穩(wěn)定性研究主要集中在對(duì)內(nèi)植物設(shè)計(jì)和對(duì)內(nèi)植物表面的修飾處理上，如通過螺釘接骨板的鎖定機(jī)制提高螺釘骨界面抗拔出性能，減少早期螺釘切割，或通過植入假體表面羥基磷灰石涂層，增加骨長入。雖然可在一定程度上減少內(nèi)固定的失敗，但提高內(nèi)植物周圍骨質(zhì)量，增強(qiáng)內(nèi)植物-骨界面固定強(qiáng)度才是最終的解決辦法。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)植物植入骨內(nèi)后，周圍骨組織結(jié)構(gòu)的改建，涉及眾多細(xì)胞類型參與及不同因子的調(diào)節(jié)，類似于骨折的修復(fù)。而骨折的修復(fù)，BMP(bone morphogenetic proteins，BMP)起著關(guān)鍵作用。BMP是早期誘導(dǎo)骨組織形成與發(fā)生的重要信號(hào)分子，可誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，在維持骨的礦物質(zhì)含量和骨改建方面起著重要作用。

在目前已知的30多種BMP中，BMP-9誘導(dǎo)成骨作用最強(qiáng)。通過外源性BMP局部給藥促進(jìn)骨再生，具有持續(xù)時(shí)間短、用量大、反復(fù)追加用藥、成本高等缺點(diǎn)。為克服此缺點(diǎn)，將轉(zhuǎn)基因技術(shù)將目的基因?qū)敕N子細(xì)胞，使其在植入部位持續(xù)表達(dá)，達(dá)到治療的目的。阿倫磷酸鈉(Alendronate Aln)是臨床常用抗骨質(zhì)疏松藥，其抗骨質(zhì)疏松主要作用機(jī)制是抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向骨骼表面游走和募集，并可抑制它們繼續(xù)向多核細(xì)胞分化。同時(shí)使成熟的破骨細(xì)胞形態(tài)改變、功能喪失，并促進(jìn)破骨細(xì)胞的凋亡。阿侖磷酸納除抑制破骨細(xì)胞引起的骨吸收外，對(duì)成骨細(xì)胞也有促進(jìn)作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有來源豐富、易于取材，具有強(qiáng)大的增殖及多細(xì)胞分化潛能，并且低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用，已廣泛作為基因治療的載體細(xì)胞。

目前在BMP-9基因轉(zhuǎn)染結(jié)合Aln治療對(duì)骨質(zhì)疏松狀態(tài)下金屬骨內(nèi)植物穩(wěn)定性作用的影響上還沒有相關(guān)資料進(jìn)行報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種BMP-9基因結(jié)合Aln對(duì)增強(qiáng)骨質(zhì)疏松內(nèi)固定的模型，旨在評(píng)估BMP-9基因轉(zhuǎn)染結(jié)合Aln治療對(duì)骨質(zhì)疏松狀態(tài)下金屬骨內(nèi)植物穩(wěn)定性作用的影響問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，BMP-9基因結(jié)合Aln對(duì)骨質(zhì)疏松內(nèi)固定的模型為6月齡Sprague-Dawley雌性大鼠64只，體重275±25g，SPF級(jí)；管理飼養(yǎng)，12h更替黑夜和白晝，環(huán)境溫度22℃，自由攝食飲水，喂養(yǎng)嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料，每籠4只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；大鼠按完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為：單純螺釘固定組、阿倫磷酸鈉組、BMP-9轉(zhuǎn)染組、BMP-9轉(zhuǎn)染+阿倫磷酸鈉組，每組16只，在螺釘植入后4w、8w每組各處死8只大鼠，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述BMP-9基因結(jié)合Aln對(duì)骨質(zhì)疏松內(nèi)固定的模型的建立方法，所述建立方法包括以下步驟：

大鼠稱重后，用3.5％水合氯醛按1ml/100g體重腹腔內(nèi)注射麻醉，待麻醉顯效后，手術(shù)區(qū)備皮，取俯臥位，將大鼠四肢固定在手術(shù)臺(tái)上，以碘伏消毒手術(shù)區(qū)，鋪無菌單；

以大鼠背側(cè)骶前橫突最長處近端1cm為中心，延正中線作長約1.0cm—1.5cm的縱向皮膚切口，先將皮膚切口向右側(cè)牽拉，顯露腹肌在背側(cè)止點(diǎn)，延其止點(diǎn)用眼科剪剪開，于骶脊肌外側(cè)緣可見腹膜內(nèi)一乳白色發(fā)亮脂肪團(tuán)，用血管鉗將脂肪團(tuán)輕輕夾出切口，在脂肪團(tuán)內(nèi)可見一綠豆大小棕黃色卵巢及相連輸卵管，有時(shí)可見卵巢表面黃色卵泡，用止血鉗夾住卵巢，用0號(hào)絲線距卵巢約0.5cm處結(jié)扎輸卵管，切除卵巢，將余下部分回納入腹腔，縫合肌肉附著點(diǎn)。將皮膚切口牽向左側(cè)，用同樣方法切除左側(cè)卵巢；

縫合皮膚，碘伏再次消毒切口。將所切除的卵巢組織用4％的多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，行顯微鏡觀察，確定所切組織為卵巢。術(shù)后放入籠中，常規(guī)喂養(yǎng)三個(gè)月。

進(jìn)一步，所述建立方法還包括螺釘植入模型建立方法，具體包括：

3.5％水合氯醛麻醉，顯效后，雙側(cè)膝內(nèi)外側(cè)區(qū)備皮，將大鼠取仰臥位，四肢固定于自制操作臺(tái)上，術(shù)區(qū)碘伏消毒鋪巾；

于右側(cè)膝下內(nèi)側(cè)切開皮膚，長1cm，顯露脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)，用尖刀剝離表面骨膜，辨清平臺(tái)上緣及脛骨前后緣，于距平臺(tái)上緣3mm，前后緣中點(diǎn)處以Φ1.2mm空針頭開口，以Φ1.2mm鉆頭鉆深約4mm，放入明膠海綿，植入Φ1.5mm*4mm鈦螺釘，縫合皮膚。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述BMP-9基因結(jié)合Aln對(duì)骨質(zhì)疏松內(nèi)固定的模型的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括：

利用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增獲取高滴度的重組腺病毒BMP-9，不同滴度轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，當(dāng)MOI值為100時(shí)，Ad-BMP-9腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，BMP-9穩(wěn)定表達(dá)，Ad-BMP-9腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs的轉(zhuǎn)染效率為80％～90％，細(xì)胞的增殖不受轉(zhuǎn)染影響；

64只6月齡SD大鼠隨機(jī)分成4組，每組16只：單純螺釘固定組、阿倫磷酸鈉組、BMP-9轉(zhuǎn)染組、BMP-9轉(zhuǎn)染+阿倫磷酸鈉組；雙側(cè)卵巢切除后3月制作骨質(zhì)疏松模型，分別于雙側(cè)脛骨近心端植入螺釘，BMP-9組和BMP-9+Aln組同時(shí)植入轉(zhuǎn)染有BMP-9的BMSCs；

在螺釘植入后即刻，Aln組和BMP-9+Aln組分別以1ml/kg皮下注射Aln，每周2次；其余組分別皮下注射等量生理鹽水。在螺釘植入后4w、8w每組各處死8只大鼠，進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)定、Micro-CT掃描、硬組織切片V-G染色、脫鈣骨BMP-9免疫組化染色。

本發(fā)明提供的BMP-9基因結(jié)合Aln對(duì)骨質(zhì)疏松內(nèi)固定的模型，Aln與BMP-9聯(lián)合使用具有協(xié)同促進(jìn)成骨的作用，并且Aln能抑制BMP-9對(duì)破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)的正面作用，抑制BMP-9誘導(dǎo)BMSc向破骨樣細(xì)胞分化。因此，本部分研究主要是通過建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，在體內(nèi)研究BMP-9結(jié)合二磷酸鹽治療對(duì)內(nèi)植物固定作用的影響。4w、8w時(shí)BMP-9+Aln組螺釘拔出力比Control組提高1倍多，比單純BMP-9組和Aln組也有顯著升高(P<0.01)；Micro-CT結(jié)果顯示BMP-9+Aln組BV/TV、TB.TH、Tb.N升高分別是Control組的4倍、1倍、2倍左右，但Tb.Sp不到Control組的一半(P<0.01)，Aln組和BMP-9組BV/TV、TB.TH、Tb.N也明顯增加，但效果較BMP-9+Aln組差，Tb.Sp降低也差于BMP-9+Aln組。硬組織切片V-G染色顯示4w時(shí)，BMP-9+Aln組螺釘螺紋間可見大量骨組織長入，周圍也有較多骨質(zhì)形成，其螺釘與骨的接觸率比Control組多近2倍(P<0.01)，Aln組和BMP-9組螺紋間也有部分骨質(zhì)長入，BMP-9顯著多于Aln組(P<0.01)，但螺釘周圍骨組織量要少于Aln組；8w時(shí)，與Control組相比，各組間均有較多骨組織形成，螺紋間骨質(zhì)長入增多，以BMP-9+Aln組最明顯，其螺釘與骨的接觸率比Control組多近1倍(P<0.01)，BMP-9螺紋間骨長入增多，骨接觸率明顯高于Aln組，但周圍骨組織少于Aln組。BMP-9免疫組化染色顯示4w時(shí)BMP-9組和BMP-9+Aln組可間成骨細(xì)胞和成熟骨細(xì)胞的胞漿內(nèi)BMP-9陽性表達(dá)，8w時(shí)表達(dá)減弱，而Control組和Aln組一直未見BMP-9明顯陽性表達(dá)。

轉(zhuǎn)染有BMP-9基因的BMSCs細(xì)胞植入體內(nèi)后，可在骨形成過程中持續(xù)表達(dá)BMP-9，Aln能顯著提高螺釘周圍的骨量，提高螺釘?shù)目拱纬瞿芰?，相?duì)于Aln，BMP-9改善螺釘固定主要是通過提高螺紋間的骨長入，提高骨與螺釘?shù)慕佑|率，當(dāng)BMP-9基因轉(zhuǎn)染結(jié)合Aln治療時(shí)能顯著提高骨質(zhì)疏松癥內(nèi)植物在骨內(nèi)的穩(wěn)定，在增加內(nèi)植物周圍骨組織量，增加與骨的接觸方面具有交互作用。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的BMP-9基因結(jié)合Aln對(duì)骨質(zhì)疏松內(nèi)固定的模型流程圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的BMP-9基因結(jié)合Aln對(duì)骨質(zhì)疏松內(nèi)固定的模型的構(gòu)建方法包括以下步驟：

S101：大鼠稱重后，用3.5％水合氯醛按1ml/100g體重腹腔內(nèi)注射麻醉，待麻醉顯效后，手術(shù)區(qū)備皮，取俯臥位，將大鼠四肢固定在手術(shù)臺(tái)上，以碘伏消毒手術(shù)區(qū)，鋪無菌單；

S102：以大鼠背側(cè)骶前橫突最長處近端1cm為中心，延正中線作長約1.0cm—1.5cm的縱向皮膚切口，先將皮膚切口向右側(cè)牽拉，顯露腹肌在背側(cè)止點(diǎn)，延其止點(diǎn)用眼科剪剪開，于骶脊肌外側(cè)緣可見腹膜內(nèi)一乳白色發(fā)亮脂肪團(tuán)，用血管鉗將脂肪團(tuán)輕輕夾出切口，在脂肪團(tuán)內(nèi)可見一綠豆大小棕黃色卵巢及相連輸卵管，有時(shí)可見卵巢表面黃色卵泡，用止血鉗夾住卵巢，用0號(hào)絲線距卵巢約0.5cm處結(jié)扎輸卵管，切除卵巢，將余下部分回納入腹腔，縫合肌肉附著點(diǎn)。將皮膚切口牽向左側(cè)，用同樣方法切除左側(cè)卵巢；

S103：縫合皮膚，碘伏再次消毒切口。將所切除的卵巢組織用4％的多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，行顯微鏡觀察，確定所切組織為卵巢。術(shù)后放入籠中，常規(guī)喂養(yǎng)三個(gè)月。

下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要實(shí)驗(yàn)儀器

其它耗材及儀器同實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)二

及實(shí)驗(yàn)三

1.1.2主要試劑配置

(1)骨標(biāo)本浸液I：甲基丙烯酸甲酯75ml、鄰苯二甲酸二丁酯25ml，磁力攪拌混勻3h，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)骨標(biāo)本浸液II：甲基丙烯酸甲酯75ml、鄰苯二甲酸二丁酯25ml、過氧化苯甲酰1g，磁力攪拌混勻4h，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)骨標(biāo)本浸液III：甲基丙烯酸甲酯75ml、鄰苯二甲酸二丁酯25ml、過氧化苯甲酰2.5g，攪拌混勻6h，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)10％的EDTA溶液配制：100gEDTA溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)1000ml中，用HCL調(diào)節(jié)PH為PH6.4－6.8，高溫消毒后常溫放置備用。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

6月齡Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠64只，體重275±25g，SPF級(jí)，購自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：CQLA—2012－0512。大鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(SPF實(shí)驗(yàn)室)管理飼養(yǎng)，12h更替黑夜和白晝，環(huán)境溫度22℃，自由攝食飲水，喂養(yǎng)嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料，每籠4只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

大鼠按完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為：單純螺釘固定組(Control組)、阿倫磷酸鈉組(Aln組)、BMP-9轉(zhuǎn)染組(BMP-9組)、BMP-9轉(zhuǎn)染+阿倫磷酸鈉組(BMP-9+Aln組)，每組16只。在螺釘植入后4w、8w每組各處死8只大鼠，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2方法

1.2.1骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型建立

①大鼠稱重后，用3.5％水合氯醛按1ml/100g體重腹腔內(nèi)注射麻醉，待麻醉顯效后，手術(shù)區(qū)備皮，取俯臥位，將大鼠四肢固定在自制手術(shù)臺(tái)上，以碘伏消毒手術(shù)區(qū)，鋪無菌單；

②以大鼠背側(cè)骶前橫突最長處近端約1cm為中心，延正中線作長約1.0cm—1.5cm的縱向皮膚切口，先將皮膚切口向右側(cè)牽拉，顯露腹肌在背側(cè)止點(diǎn)，延其止點(diǎn)用眼科剪剪開，于骶脊肌外側(cè)緣可見腹膜內(nèi)一乳白色發(fā)亮脂肪團(tuán)，用血管鉗將脂肪團(tuán)輕輕夾出切口，在脂肪團(tuán)內(nèi)可見一綠豆大小棕黃色卵巢及相連輸卵管)，有時(shí)可見卵巢表面黃色卵泡，用止血鉗夾住卵巢，用0號(hào)絲線距卵巢約0.5cm處結(jié)扎輸卵管，切除卵巢，將余下部分回納入腹腔，縫合肌肉附著點(diǎn)。將皮膚切口牽向左側(cè)，用同樣方法切除左側(cè)卵巢。

③縫合皮膚，碘伏再次消毒切口。將所切除的卵巢組織用4％的多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，行顯微鏡觀察，確定所切組織為卵巢。術(shù)后放入籠中，常規(guī)喂養(yǎng)三個(gè)月。

1.2.2骨密度(Bone mineral density，BMD)測(cè)量

術(shù)前和術(shù)后3個(gè)月，隨機(jī)從行雙側(cè)卵巢切除的大鼠中抽取12只，經(jīng)用3.5％水合氯醛按1ml/100g麻醉后，四肢展開，俯臥于雙能X線吸收測(cè)量儀平臺(tái)上，通過小動(dòng)物軟件測(cè)量量腰4、5椎體BMD值，采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)其BMD值進(jìn)行分析。

1.2.3MSCs與可吸收明膠海綿復(fù)合培養(yǎng)

利用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增獲取高滴度的重組腺病毒BMP-9，不同滴度轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，當(dāng)MOI值為100時(shí)，Ad-BMP-9腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，BMP-9穩(wěn)定表達(dá)，Ad-BMP-9腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs的轉(zhuǎn)染效率為80％～90％，MTT法測(cè)定細(xì)胞生長曲線，細(xì)胞的增殖不受轉(zhuǎn)染影響，細(xì)胞的增殖不受轉(zhuǎn)染影響，符合實(shí)驗(yàn)要求。

Ad-BMP9轉(zhuǎn)染細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞于轉(zhuǎn)染后72h，0.25％胰酶消化收集，每塊可吸收明膠海綿按1×10⁶個(gè)BMSc接種。為使細(xì)胞盡量多地進(jìn)入材料內(nèi)部，對(duì)可吸收明膠海綿進(jìn)行預(yù)處理：將明膠海綿在無菌條件下剪成3mm×3mm大小塊狀，加入含20％胎牛血清的L-DMEM完全培養(yǎng)液置入37℃、5％CO₂飽和濕度孵箱中過夜后于熒光顯微鏡下觀察。手術(shù)時(shí)，Control組和Aln組植入培養(yǎng)有BMSc的可吸收明膠海綿，BMP-9組和BMP-9+Aln組植入培養(yǎng)有轉(zhuǎn)染BMP-9細(xì)胞的可吸收明膠海綿。

1.2.4螺釘植入模型建立

鈦螺釘及手術(shù)器械均于術(shù)前一日高溫高壓消毒滅菌，手術(shù)遵循手術(shù)無菌操作原則。

①3.5％水合氯醛(1ml/100g)麻醉，顯效后，雙側(cè)膝內(nèi)外側(cè)區(qū)備皮，將大鼠取仰臥位，四肢固定于自制操作臺(tái)上，術(shù)區(qū)碘伏消毒鋪巾；

②于右側(cè)膝下內(nèi)側(cè)切開皮膚，長約1cm，顯露脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)，用尖刀剝離表面骨膜，辨清平臺(tái)上緣及脛骨前后緣，于距平臺(tái)上緣3mm，前后緣中點(diǎn)處以Φ1.2mm空針頭開口，以Φ1.2mm鉆頭鉆深約4mm，放入明膠海綿(大小為2mm×2mm，利用取出鉆頭的負(fù)壓將明膠海綿吸入)，植入Φ1.5mm*4mm鈦螺釘，縫合皮膚；

③手術(shù)操作左側(cè)同右側(cè)；

1.2.5給藥方式

將Aln純粉由生理鹽水配成50μg/ml混懸液備用，用前搖勻。在螺釘植入后即刻，Aln組和BMP-9+Aln組以1ml/kg皮下注射Aln，每周2次；其余組分別皮下注射等量生理鹽水。

1.2.6生物力學(xué)測(cè)定

螺釘植入后4w、8w，每組各處死8只大鼠，取植入鈦螺釘?shù)淖髠?cè)脛骨，采用BOSE 3330動(dòng)態(tài)疲勞試驗(yàn)機(jī)，將骨端置于試驗(yàn)機(jī)下端夾具的夾曹內(nèi)，螺釘帽部分植入上端自制夾具內(nèi)，初始載荷為0.1N，以1N/0.01s速度遞增，掃描間隔為0.001s，當(dāng)螺釘完全拔出后停止受力。

1.2.7Micro-CT掃描

螺釘植入后4w、8w，每組各處死8只大鼠，取右側(cè)脛骨，以4％的多聚甲醛固定。為避免金屬螺釘對(duì)掃描結(jié)果的影響，MicroCT掃描前，小心取出鈦螺釘，將樣本置于Micro-CT系統(tǒng)的檢測(cè)試管內(nèi)，垂直于標(biāo)本長軸方向掃描，圖像分辨率2048×2048，素點(diǎn)為20×20μm，層間距20μm。電壓55KV，145mA，整合時(shí)間為380ms掃描完成后用Microview V2.1.2分析軟件進(jìn)行三維重建分析。CT值高于270定為骨組織，設(shè)出興趣區(qū)域(range of interests，ROI)為從皮質(zhì)骨下20層開始，以螺釘為中心，半徑為2.5mm的圓面積，連續(xù)掃描80層，檢驗(yàn)參數(shù)包括：(1)骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction，BVF):骨小梁的體積(bone volume，BV)/樣本的體積(total volume，TV)與，即BV/TV；(2)骨小梁間隙(trabecular spacing，Tb.Sp)；(3)骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)；(4)骨小梁數(shù)目(trabecular number，Tb.N)

1.2.8硬組織切片觀察

在行Micro-CT掃描后，將4枚標(biāo)本進(jìn)行硬組織切片，觀察骨接觸情況。

硬組織切片制備

(1)骨組織包埋方法；

①固定和脫水：待4％多聚甲醛中固定2天后，分別于70％乙醇—95％乙醇—100％乙醇行梯度脫水，依次各1d，脫水后用二甲苯透明脫脂8h。

②浸透：骨標(biāo)本按浸液I—浸液II—漫液III的順序，依次各浸透2d。

③包埋：將已浸透的標(biāo)本放入15ml大小的玻璃瓶內(nèi)，倒入現(xiàn)配的浸液III中(每個(gè)標(biāo)本10m1)，瓶蓋蓋好后插上針頭排氣，置入4℃冰箱中5d，然后放于室溫下繼續(xù)固化。

④固化后，將其放于40℃烘箱內(nèi)直至完全硬化(用針頭刺其表面，不能刺入為準(zhǔn))，切片前砸碎玻璃。

(2)骨標(biāo)本切片：

于修塊機(jī)上將包塊修整，使之能牢固固定在切片機(jī)上，且使刀片切割方向與螺釘長軸方向垂直，即延失狀面切割，切片厚度約為150μm。切割后超聲清洗切片10s，ddH₂O沖洗2min，常溫晾干，用粘合劑將切片粘合至硬組織切片專用有機(jī)玻片上，并使用5kg砝碼壓片24h。

手工膜片：先在磨砂玻璃上膜片，然后分別用P300、P800、P1200砂紙磨片，將切片磨成厚度約50μm，再對(duì)磨片進(jìn)行拋光，最終切片厚度約30～40μm

(3)V-G染色法(VAN GIESON染色—苦味酸品紅染色)

①超聲洗片2min，ddH₂O沖洗2min；

②將切片放于0.1％甲酸3min后，用流水沖洗2min；

③將切片放于20％甲醇2min，流水沖洗2min；

④在60℃恒溫箱中用Stevenol藍(lán)染色15min后，流水沖洗2min，并擦干；

⑤室溫下將切片進(jìn)行V-G染染色8min，水洗后晾干與顯微鏡下觀察。

(4)新生骨接觸情況觀察

用Olympus光學(xué)顯微鏡(BX51，Olympus，Jappan)觀察切片，并用Image-proplus(xmage-PrPlusR，Mediaeyberneties，silver springs，Mn，usA)自動(dòng)圖像處理軟件進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)的測(cè)量。

螺釘-骨接觸率＝(螺釘與骨接觸的長度/螺釘在骨內(nèi)的總長度)X100％

1.2.9免疫組化染色

在行Micro-CT掃描后，將4枚標(biāo)本進(jìn)行脫鈣，用于BMP-9免疫組化染色。

(1)骨組織脫鈣：

①將標(biāo)本固定24～48h后，用PBS沖洗3次，每次20min；

②將標(biāo)本移植10％EDTA脫鈣液中，每標(biāo)本脫鈣液約10ml，常溫下保存；

③每日搖動(dòng)脫鈣液，讓標(biāo)本與脫鈣用充分接觸，4～5d時(shí)更換脫鈣液；

④4w～5w時(shí)用針頭刺骨組織，如能輕松刺入說明脫鈣成功；

⑤脫鈣成功后，H₂O沖洗60min，進(jìn)行石蠟包埋切片。

(2)免疫組化染色

①石蠟切片脫蠟脫水:將標(biāo)本放入二甲苯I、II中各10min。

②梯度酒精脫水:100％酒精，2min—95％酒精，2min—80％酒精，2min—70％酒精，2min。

③脫水后，用dH₂O洗2次，各5min；

④用過氧化氫避光封閉內(nèi)源性過氧化物酶10min；

⑤dH₂O洗2次各5min；

⑥抗原修復(fù):將標(biāo)本置于塑料切片架，放入耐溫玻璃容器內(nèi)，用構(gòu)椽酸鈉緩沖液淹沒切片，放入微波爐內(nèi)，選擇中高檔，5min；取出并補(bǔ)充已預(yù)熱的構(gòu)椽酸鈉緩沖液；再選擇中高檔，5min。

⑦PBS沖洗2次，各5min。

⑧血清封閉:擦凈切片周圍的水份(保持組織呈濕潤狀態(tài))，滴加二抗血清，37℃孵育30min。

⑨滴加一抗:用濾紙吸去血清，滴加一抗，37℃孵育2h。

⑩PBS小心沖洗2次，每次5min。

滴加生物素化的二抗，37℃，40min。

用PBS沖洗2次，每次5min。

滴加三抗(SAB復(fù)合物)，37℃，40min。

再用PBS沖洗2次，每次5min后看，用DAB顯色，鏡下觀察，適時(shí)自來水沖洗終止。

蘇木素復(fù)染，于室溫下放置30s后自來水沖洗；

梯度酒精脫水后，用二甲苯透明:I，11(二甲苯)各5min

用樹膠封片后鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)的兩兩比較采用多個(gè)樣本q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為a＝0.05，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠腰椎BMD測(cè)量

大鼠卵巢切除術(shù)(OVX)術(shù)前BMD結(jié)果為1.366±0.043g/cm²，OVX術(shù)后3月BMD均值低于術(shù)前均值的-3SD。按照WHO骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)中T<-2.5，ovx術(shù)后3月滿足骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后3月腰椎BMD值為1.056±0.049g/cm²。

2.2生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)

4W時(shí)Aln組和BMP-9組螺釘拔出力均較Control組明顯升高(P<0.01)，但Aln組升高較BMP-9組明顯(P<0.01)，到8W時(shí)，Aln組拔出力仍高于BMP-9組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(P>0.01)。4W、8W時(shí)BMP-9+Aln組螺釘拔出力均明顯高于單獨(dú)Aln和BMP-9組(P<0.01)。

2.3Micro-CT結(jié)果

Micro-CT結(jié)果顯示，4w、8w時(shí)聯(lián)合應(yīng)用Aln和BMP-9，BV/TV增高是Control組的4倍多(P<0.01)，Aln組和BMP-9組也明顯增加(P>0.01)，與單獨(dú)使用BMP-9、Aln相比，聯(lián)合運(yùn)用升高明顯(P<0.01)。

4w時(shí)，Aln組和BMP-9+Aln組TB.TH升高是Control組的1倍(P<0.01)，到第8w時(shí)，也有明顯升高(P<0.01)，但BMP-9+Aln組好于Aln組。BMP-9組比Control組升高20％～30％，但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(P>0.01)。

4w、8w時(shí)Tb.N結(jié)果顯示BMP-9+Aln組比Control組增高近2倍(P<0.01)，單獨(dú)使用BMP-9、Aln也有升高(P<0.01)，但低于BMP-9+Aln組。

4w、8w時(shí)結(jié)果顯示BMP-9+Aln組Tb.Sp不到Control組的一半(P<0.01)，Aln組和BMP-9組也有降低，但少于BMP-9+Aln組

2.4骨與螺釘接觸情況

4w時(shí)，BMP-9+Aln組螺釘螺紋間可見大量骨組織長入，周圍也有較多骨質(zhì)形成，其螺釘與骨的接觸率比Control組多近2倍(P<0.01)，Aln組和BMP-9組螺紋間也有部分骨質(zhì)長入，BMP-9顯著多于Aln組(P<0.01)，但螺釘周圍骨組織量要少于Aln組。

8w時(shí)，與Control組相比，各組間均有較多骨組織形成，螺紋間骨質(zhì)長入增多，以BMP-9+Aln組組最明顯，其螺釘與骨的接觸率比Control組多近1倍(P<0.01)，BMP-9螺紋間骨長入增多，骨接觸率明顯高于Aln組，但周圍骨組織少于Aln組。

2.5免疫組化染色結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，4w時(shí)BMP-9組和BMP-9+Aln組可間成骨細(xì)胞和成熟骨細(xì)胞的胞漿內(nèi)BMP-9陽性表達(dá)，8w時(shí)表達(dá)減弱，而Control組和Aln組一直未見BMP-9明顯陽性表達(dá)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。