1.一種基于3D生物打印修復(fù)人關(guān)節(jié)軟骨的方法,其特征在于:包括以下步驟:
PEG與甲基丙烯酰氯過(guò)夜反應(yīng)制備PEGDMA并純化;
采用全骨髓貼壁法分離人間充質(zhì)干細(xì)胞;
將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人間充質(zhì)干細(xì)胞傳代并調(diào)整密度,待細(xì)胞貼壁后更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng);
清洗新鮮牛股骨,在骨軟骨栓塞的中心位置用無(wú)菌活體穿孔器做出全層軟骨缺損,將骨軟骨栓塞置于DMEM中培養(yǎng)成3D生物紙;
將純化的PEGDMA溶解,加入光引發(fā)劑2959,將步驟c)誘導(dǎo)所得軟骨細(xì)胞重懸在過(guò)濾除菌的PEGDMA溶液中制成生物墨水;
將生物打印機(jī)消毒滅菌后加入生物墨水,按照設(shè)計(jì)的形狀和大小在3D生物紙上層層打印出3D軟骨,將3D軟骨置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種基于3D生物打印修復(fù)人關(guān)節(jié)軟骨的方法,其特征在于:步驟a)中采用3kDa的PEG與甲基丙烯酰氯在氮?dú)鈼l件下過(guò)夜反應(yīng),再通過(guò)乙醚析出和過(guò)夜凍干的方法進(jìn)行純化,使合成的PEGDMA大分子單體純度大于95%。
3.如權(quán)利要求1所述的一種基于3D生物打印修復(fù)人關(guān)節(jié)軟骨的方法,其特征在于:步驟b)中分離人間充質(zhì)干細(xì)胞包括在無(wú)菌條件下取健康成人骨髓液,用PBS漂洗并計(jì)數(shù),將處理后的細(xì)胞培養(yǎng)在含20%(v/v)胎牛血清和1%(v/v)青霉素-鏈霉素-慶大霉素的α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,置于37℃、5%(v/v)CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),48小時(shí)后換液,之后每隔3天換液。
4.如權(quán)利要求1所述的一種基于3D生物打印修復(fù)人關(guān)節(jié)軟骨的方法,其特征在于:步驟c)中人間充質(zhì)干細(xì)胞密度調(diào)整至5×103個(gè)/cm2,所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基含1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-丙酮酸鈉,0.1mmol/L抗壞血酸磷酸鹽, 1.25mg/mL 人血清白蛋白, 10-7mol/L地塞米松, 1%(v/v)青霉素-鏈霉素-慶大霉素, 10 ng/mL TGF-b1,將所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于37℃、5%(v/v)CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱,每3天更換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基,培養(yǎng)2-6周。
5.如權(quán)利要求1所述的一種基于3D生物打印修復(fù)人關(guān)節(jié)軟骨的方法,其特征在于:步驟d)中無(wú)菌活體穿孔器直徑為4mm,缺損的深度為2-5mm,所述DMEM含有10%(v/v)小牛血清和1%(v/v)青霉素-鏈霉素-慶大霉素,培養(yǎng)溫度37℃,將DMEM置于5%(v/v)CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。
6.如權(quán)利要求1所述的一種基于3D生物打印修復(fù)人關(guān)節(jié)軟骨的方法,其特征在于:步驟e)中PEGDMA溶解在PBS或去離子水中,濃度為10 %(w/v)和20 %(w/v) ,光引發(fā)劑2959的加入量為0.05 %(w/v),所述生物墨水中每毫升溶液含5×106個(gè)細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1所述的一種基于3D生物打印修復(fù)人關(guān)節(jié)軟骨的方法,其特征在于:步驟f)中生物打印機(jī)用紫外照射滅菌,打印筆用70%(v/v)乙醇消毒,打印時(shí)將UV強(qiáng)度為4.5 mW/cm2的長(zhǎng)波紫外燈置于打印平臺(tái)上方25cm處,打印筆中加滿步驟e)制得的生物墨水并用鋁箔覆蓋以防止紫外照射,打印出的出3D軟骨在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2、4、6周,每3天更換一次培養(yǎng)基。