本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體來(lái)講涉及一種從美洲大蠊中連環(huán)提取得到兩種有效成分的方法。
背景技術(shù)：
：美洲大蠊為昆蟲(chóng)綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲(chóng)，俗稱(chēng)蟑螂，是蜚蠊科中體積最大的昆蟲(chóng)，原產(chǎn)于南美洲。美洲大蠊是傳統(tǒng)的中藥材入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,謂“味咸,寒。主血瘀、癥堅(jiān)、寒熱，破積聚，喉咽搏，內(nèi)寒，無(wú)子”，用以治療小兒疳積、疔瘡、癰腫、喉蛾、無(wú)名腫毒、梅毒以及毒蛇、蜈松咬傷等疾病。隨著現(xiàn)代科學(xué)的不斷發(fā)展，美洲大蠊的化學(xué)成分和藥理作用的研究愈加深入。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，美洲大蠊中含有蛋白質(zhì)、肽類(lèi)、氨基酸、甲殼素、粘糖氨酸、核苷、脂肪酸、烯醇、烯酸、烷烴、多元醇、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)，酶類(lèi)以及豐富的礦物質(zhì)和微量元素。通過(guò)國(guó)內(nèi)已有產(chǎn)品及相關(guān)藥理活性研究情況看，美洲大蠊體內(nèi)藥效成分的生物活性主要包括：對(duì)各種外傷創(chuàng)面及機(jī)體潰瘍具有良好的肌肉組織修復(fù)活性；具有強(qiáng)心升壓，改善血液循環(huán)的活性；具有抗菌抗病毒的活性；具有抗腫瘤，增強(qiáng)免疫功能活性。現(xiàn)有美洲大蠊提取分離的主要提取物有三種：治療肝病的提取物、抗腫瘤作用的提取物和全蟲(chóng)提取物。如CN102885858B，發(fā)明名稱(chēng)：治療乙型肝炎用的美洲大蠊提取物的制備方法，包括步驟：A、滅活粉碎；B、提??；C、一級(jí)濃縮；D、脫脂吸附；E、洗脫；F、二級(jí)濃縮；G、干燥粉碎。采用該發(fā)明所述方法制備治療乙型肝炎用的美洲大蠊提取物，可以有效控制對(duì)乙型肝炎產(chǎn)生抑制效果的有效成份的水解，提高乙型肝炎治愈率。本發(fā)明提取的藥物，對(duì)慢性乙肝患者和乙肝病毒攜帶者HBeAg轉(zhuǎn)陰率、HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率總有效率可達(dá)80～95％；對(duì)治療乙型肝炎用的特定有效成份提取得率可達(dá)3-5％；且可以提高最終提取物的抗腐性，避免因腐敗變質(zhì)造成浪費(fèi)；可以避免最終提取物含有蛋白質(zhì)，從而減少藥物中的有害過(guò)敏源。如CN101214262B，發(fā)明名稱(chēng)：大孔吸附樹(shù)脂制備的美洲大蠊抗腫瘤有效部位及用途，由蜚蠊科美洲大蠊(Periplanetaamericana)蟲(chóng)體鮮品或干品經(jīng)醇水提取、大孔吸附樹(shù)脂柱層析、醇溶劑洗脫精制而成。該發(fā)明得到的美洲大蠊提取物有效部位對(duì)口腔上皮癌(KB)細(xì)胞，低分化胃腺癌腫瘤(BGC-823)細(xì)胞，人慢性髓原細(xì)胞白血病癌(K562)細(xì)胞和人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞(HL-60)具有明顯的細(xì)胞毒性和體內(nèi)抗腫瘤功效，可以用于制備治療上述腫瘤的藥物或保健品。但是，該兩種方法無(wú)法充分利用美洲大蠊原藥材用途，造成經(jīng)濟(jì)上的浪費(fèi)和成本高，有待開(kāi)發(fā)新技術(shù)以克服成本上的缺陷。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種從美洲大蠊中連環(huán)提取得到兩種有效成分的制備方法，解決了現(xiàn)有提取方法無(wú)法充分利用美洲大蠊原藥材用途，造成經(jīng)濟(jì)上的浪費(fèi)和成本高等問(wèn)題。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案：一種從美洲大蠊中連環(huán)提取得到兩種有效成分的方法，包括以下步驟：(1)美洲大蠊流浸膏的制備：將美洲大蠊蟲(chóng)體經(jīng)粉碎、乙醇浸泡、乙醇回流提取、一級(jí)濃縮、脫脂和二級(jí)濃縮，得到比重為1.05～1.15的浸膏，即為美洲大蠊流浸膏；(2)第一種有效成分的制備：將步驟(1)得到的美洲大蠊流浸膏，經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱層析，水洗，然后50～90％乙醇-水洗脫,收集洗脫液，最后用無(wú)水乙醇洗脫；將得到的50～90％乙醇洗脫液減壓濃縮至無(wú)醇味，干燥，粉碎得第一種有效成分；(3)第二種有效成分的制備：將步驟(2)得到的水洗脫液與無(wú)水乙醇洗脫液合并，減壓濃縮至比重為1.05～1.15，得濃縮液；將所得濃縮液加入濃縮液重量7～10倍量的蒸餾水，經(jīng)濾紙過(guò)濾后，在所得濾液中加入濃縮液0.5～1.0倍量藥用活性炭在40～60℃溫度下攪拌30～60分鐘，使其充分吸附；將所得含活性炭藥液裝入層析柱中，放出藥液，先用藥用活性炭10～30倍量蒸餾水洗滌，水洗液棄去；再用藥用活性炭30～60倍量的洗脫劑洗脫，收集洗脫液，經(jīng)濾紙過(guò)濾，得洗脫濾液；將所得洗脫濾液在溫度50～60℃、真空度-0.05～-0.06MPa條件下減壓濃縮，濃縮至比重為1.20～1.30時(shí)，得美洲大蠊提取物浸膏；將所得美洲大蠊提取物浸膏在50℃～60℃溫度、真空度-0.04～-0.07MPa的條件下真空干燥，粉碎為細(xì)粉，即得到第二種有效成分。優(yōu)選地：所述的粉碎：將干燥的美洲大蠊蟲(chóng)體粉碎，過(guò)24目篩，制得美洲大蠊粗粉；所述的浸泡：將所得美洲大蠊粗粉用質(zhì)量濃度90～95％的乙醇浸泡，使乙醇液面高出所述美洲大蠊粗粉5～10cm密閉保存，制得粗粉混合液；所述的提?。簩⑺么址刍旌弦涸?5～80℃溫度下進(jìn)行3～5次回流提取，第一次提取時(shí)，加粗粉重量5～8倍量濃度90％～95％的乙醇，提取時(shí)間為4～6小時(shí)；第二次以后每次加粗粉重量3～6倍量濃度90％～95％的乙醇，提取時(shí)間為3～5小時(shí)；提取過(guò)程中，乙醇溫度均保持在75～80℃；提取完成后，合并提取液，過(guò)濾得乙醇提取液；所述的一級(jí)濃縮：將所得乙醇提取液在真空度-0.05～-0.06MPa、溫度50～60℃的條件下減壓濃縮，至比重為1.05～1.15時(shí)，得乙醇濃縮液；所述的脫脂：將所得乙醇濃縮液加入乙醇濃縮液重量7～10倍量的純化水，邊攪拌邊升溫至80～90℃后，攪拌10～60分鐘，攪拌速度為20～60轉(zhuǎn)/分，然后保溫靜置1～5小時(shí)使油水分層；所述的二級(jí)濃縮：將所得下層水液放出，經(jīng)濾紙過(guò)濾后，濾液在溫度60～80℃、真空度-0.05～-0.06MPa條件下減壓濃縮，濃縮至比重為1.05～1.15時(shí)，制得美洲大蠊流浸膏。優(yōu)選地：所述的大孔吸附樹(shù)脂指AB-8或D101。優(yōu)選地：所述步驟(3)中所用洗脫劑為濃度10％～20％、PH值2.0～3.0的醋酸乙醇液或濃度10％～20％醋酸的水飽和正丁醇溶液或苯酚濃度為10％～20％的苯酚乙醇液。優(yōu)選地：所述的提?。河脻舛葹?0％～95％的乙醇回流提取3次美洲大蠊粗粉：第一次提取時(shí)，加粗粉重量6倍量濃度90％～95％的乙醇，提取時(shí)間為5小時(shí)；第二次加粗粉重量4倍量濃度90％～95％的乙醇，提取時(shí)間為4小時(shí)；第三次加粗粉重量4倍量濃度90％～95％的乙醇，提取時(shí)間為4小時(shí)；提取過(guò)程中，乙醇溫度均保持在75～80℃,提取完成后，合并三次提取液，過(guò)濾得乙醇提取液。優(yōu)選地：所述的一級(jí)濃縮：將所得乙醇濃縮液加入乙醇濃縮液重量8倍量的蒸餾水，邊攪拌邊升溫至80～90℃后，攪拌40分鐘，攪拌速度為40轉(zhuǎn)/分，然后保溫靜置4小時(shí)使油水分層。優(yōu)選地：所述的減壓濃縮時(shí)的溫度不超過(guò)100℃，所述的干燥是指真空減壓干燥或冷凍干燥。優(yōu)選地：所述步驟3中將所得濃縮液加入濃縮液重量7～10倍量的蒸餾水，經(jīng)濾紙過(guò)濾后，在所得濾液中加入濃縮液0.8倍量藥用活性炭在50℃溫度下攪拌45分鐘，使其充分吸附。本發(fā)明的方法中所制得的第一種有效成分在制備防治腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明的方法中所制得的第二種有效成分在制備治療乙型肝炎的用途。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明所述方法致力于由純中藥應(yīng)用向特定疾病、特定有效成份應(yīng)用方向發(fā)展，所采用的工藝路線(xiàn)可使美洲大蠊中分別用于治療腫瘤和乙型肝炎的兩種特定有效成份聚集，從而提高單純美洲大蠊提取物對(duì)治療上述兩類(lèi)疾病的治療效果。具體技術(shù)具有的有益效果如下：1、采用本發(fā)明所述方法制備美洲大蠊抗腫瘤有效成分，能夠在體外抑制多種腫瘤細(xì)胞，包括口腔上皮癌(KB)細(xì)胞，低分化胃腺癌腫瘤(BGC-823)細(xì)胞，人慢性髓原細(xì)胞白血病癌(K562)細(xì)胞和人原髓細(xì)胞白血病(HL-60)細(xì)胞等等，抗腫瘤活性明顯強(qiáng)于美洲大蠊粗提物的相應(yīng)活性2、采用本發(fā)明所述方法制備治療乙型肝炎用的美洲大蠊有效成分，可以有效控制對(duì)乙型肝炎產(chǎn)生抑制效果的有效成份的水解，提高乙型肝炎治愈率，對(duì)慢性乙肝患者HBeAg轉(zhuǎn)陰率可達(dá)40～70％，HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率可達(dá)35～60％；對(duì)乙肝病毒攜帶者HBeAg轉(zhuǎn)陰率可達(dá)20～40％，HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率可達(dá)20～40％。總有效率可達(dá)80～95％。3、采用本方法進(jìn)行制備，對(duì)治療腫瘤的特定有效成分提取得率可達(dá)1～3％，治療乙型肝炎用的特定有效成份提取得率可達(dá)3～5％。4、本發(fā)明克服成本上的缺陷，充分利用美洲大蠊原藥材各用途，從美洲大蠊中連環(huán)提取得到兩種有效成分，大大降低了成本，可操作性強(qiáng)，具有經(jīng)濟(jì)合理的優(yōu)點(diǎn)。5、可以避免最終提取物含有蛋白質(zhì)，從而減少藥物中的有害過(guò)敏源。6、采用蒸餾水進(jìn)行除脂，相比于石油醚和氯仿脫脂，不僅成本更低，而且安全性更高。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例1一種從美洲大蠊中連環(huán)提取得到兩種有效成分的方法，包括以下步驟：(1)美洲大蠊流浸膏的制備：A)粉碎：將干燥的美洲大蠊蟲(chóng)體粉碎，過(guò)24目篩，制得美洲大蠊粗粉；B)浸泡：將步驟A)所得美洲大蠊粗粉用質(zhì)量濃度95％的乙醇浸泡，使乙醇液面高出所述美洲大蠊粗粉5～10cm密閉保存，制得粗粉混合液；C)提取：將步驟B)所得粗粉混合液在75～80℃的溫度下進(jìn)行3次回流提取，對(duì)粗粉混合液進(jìn)行第一次提取時(shí)，加粗粉重量6倍量質(zhì)量濃度92％的乙醇，提取5小時(shí)；第二次加粗粉重量4倍量質(zhì)量濃度92％的乙醇，提取4小時(shí)；第三次加粗粉重量4倍量質(zhì)量濃度92％的乙醇，提取4小時(shí)；合并三次提取液，過(guò)濾得乙醇提取液；D)一級(jí)濃縮：將步驟C)所得乙醇提取液在真空度-0.05～-0.06MPa、溫度60℃的條件下減壓濃縮，至比重為1.05時(shí)，得乙醇濃縮液；E)脫脂：將步驟D)所得乙醇濃縮液加入乙醇濃縮液重量8倍量的蒸餾水，邊攪拌邊升溫至80～90℃后，攪拌40分鐘，攪拌速度為40轉(zhuǎn)/分，然后保溫靜置4小時(shí)使油水分層；F)二級(jí)濃縮：將步驟E)所得下層水液放出，經(jīng)濾紙過(guò)濾后，濾液在溫度60℃、真空度-0.05～-0.06MPa條件下減壓濃縮，濃縮至比重為1.15時(shí)，制得美洲大蠊流浸膏。取10g美洲大蠊流浸膏在該條件下繼續(xù)濃縮到比重為1.23，可得美洲大蠊干浸膏約7g。(2)第一種有效成分的制備：G)將實(shí)施例1得到的流浸膏，經(jīng)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱層析，水洗，然后80％乙醇-水洗脫,最后用無(wú)水乙醇洗脫，分別收集洗脫液。H)將上一步得到的80％乙醇洗脫液在60℃減壓濃縮至無(wú)醇味，真空減壓干燥，粉碎得第一種有效成分。(3)第二種有效成分的制備：I)將實(shí)施例1得到的水洗脫液與無(wú)水乙醇洗脫液合并，減壓濃縮至比重為1.10，得濃縮液。J)將步驟I所得濃縮液加入濃縮液重量8倍量的蒸餾水，經(jīng)濾紙過(guò)濾后，在所得濾液中加入濃縮液0.8倍量藥用活性炭在50℃溫度下攪拌45分鐘，使其充分吸附；K)洗脫：將步驟J所得含活性炭藥液裝入層析柱中，放出藥液，先用藥用活性炭20倍量蒸餾水洗滌，水洗液棄去；再用藥用活性炭30倍量的洗脫劑洗脫，收集洗脫液，經(jīng)濾紙過(guò)濾，得洗脫濾液；其中，所用洗脫劑為濃度10％醋酸的水飽和正丁醇溶液。L)二級(jí)濃縮：將步驟K所得洗脫濾液在溫度50～60℃、真空度-0.05～-0.06MPa條件下減壓濃縮，濃縮至比重為1.28時(shí)，得治療乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏；M)干燥粉碎：將步驟L所得治療乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏在50～60℃溫度、真空度-0.04～-0.07MPa的條件下真空干燥，粉碎為細(xì)粉，即得到第二種有效成分。本實(shí)施例對(duì)第一種有效成分的提取得率為3％，第二種有效成分的提取得率為5％實(shí)施例2一種從美洲大蠊中連環(huán)提取得到兩種有效成分的方法，包括以下步驟：(1)美洲大蠊流浸膏的制備：A)粉碎：將干燥的美洲大蠊蟲(chóng)體粉碎，過(guò)24目篩，制得美洲大蠊粗粉；B)浸泡：將步驟A)所得美洲大蠊粗粉用質(zhì)量濃度90％的乙醇浸泡，使乙醇液面高出所述美洲大蠊粗粉5～10cm密閉保存，制得粗粉混合液；C)提?。簩⒉襟EB)所得粗粉混合液在75～80℃的溫度下進(jìn)行4次回流提取，對(duì)粗粉混合液進(jìn)行第一次提取時(shí)，加粗粉重量5倍量質(zhì)量濃度90％的乙醇，提取3小時(shí)；第二次加粗粉重量3倍量質(zhì)量濃度95％的乙醇，提取3小時(shí)；第三次加粗粉重量3倍量質(zhì)量濃度95％的乙醇，提取3小時(shí),第四次加粗粉重量3倍量質(zhì)量濃度95％的乙醇，提取3小時(shí),；合并四次提取液，過(guò)濾得乙醇提取液；D)一級(jí)濃縮：將步驟C)所得乙醇提取液在真空度-0.05～-0.06MPa、溫度60℃的條件下減壓濃縮，至比重為1.15時(shí)，得乙醇濃縮液；E)脫脂：將步驟D)所得乙醇濃縮液加入乙醇濃縮液重量7倍量的蒸餾水，邊攪拌邊升溫至80～90℃后，攪拌60分鐘，攪拌速度為20轉(zhuǎn)/分，然后保溫靜置5小時(shí)使油水分層；F)二級(jí)濃縮：將步驟E)所得下層水液放出，經(jīng)濾紙過(guò)濾后，濾液在溫度60℃、真空度-0.05～-0.06MPa條件下減壓濃縮，濃縮至比重為1.10時(shí)，制得美洲大蠊流浸膏。取10g美洲大蠊流浸膏在該條件下繼續(xù)濃縮到比重為1.23，可得美洲大蠊干浸膏約7g。(2)第一種有效成分的制備：G)將實(shí)施例1得到的流浸膏，經(jīng)AB-8型大孔吸附樹(shù)脂柱層析，水洗，然后90％乙醇-水洗脫,最后用無(wú)水乙醇洗脫，分別收集洗脫液。H)將上一步得到的90％乙醇洗脫液在60℃減壓濃縮至無(wú)醇味，真空減壓干燥，粉碎得第一種有效成分。(3)第二種有效成分的制備：I)將實(shí)施例1得到的水洗脫液與無(wú)水乙醇洗脫液合并，減壓濃縮至比重為1.15，得濃縮液。J)將步驟I所得濃縮液加入濃縮液重量8倍量的蒸餾水，經(jīng)濾紙過(guò)濾后，在所得濾液中加入濃縮液0.5倍量藥用活性炭在40℃溫度下攪拌60分鐘，使其充分吸附；K)洗脫：將步驟J所得含活性炭藥液裝入層析柱中，放出藥液，先用藥用活性炭30倍量蒸餾水洗滌，水洗液棄去；再用藥用活性炭40倍量的洗脫劑洗脫，收集洗脫液，經(jīng)濾紙過(guò)濾，得洗脫濾液；其中，所用洗脫劑為濃度20％醋酸的水飽和正丁醇溶液。L)二級(jí)濃縮：將步驟K所得洗脫濾液在溫度50～60℃、真空度-0.05～-0.06MPa條件下減壓濃縮，濃縮至比重為1.30時(shí)，得治療乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏；M)干燥粉碎：將步驟L所得治療乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏在50～60℃溫度、真空度-0.04～-0.07MPa的條件下真空干燥，粉碎為細(xì)粉，即得到第二種有效成分。本實(shí)施例對(duì)第一種有效成分的提取得率為2％，第二種有效成分的提取得率為4％實(shí)施例3一種從美洲大蠊中連環(huán)提取得到兩種有效成分的方法，包括以下步驟：(1)美洲大蠊流浸膏的制備：A)粉碎：將干燥的美洲大蠊蟲(chóng)體粉碎，過(guò)24目篩，制得美洲大蠊粗粉；B)浸泡：將步驟A)所得美洲大蠊粗粉用質(zhì)量濃度92％的乙醇浸泡，使乙醇液面高出所述美洲大蠊粗粉5～10cm密閉保存，制得粗粉混合液；C)提?。簩⒉襟EB)所得粗粉混合液在75～80℃的溫度下進(jìn)行5次回流提取，對(duì)粗粉混合液進(jìn)行第一次提取時(shí)，加粗粉重量6倍量質(zhì)量濃度90％的乙醇，提取6小時(shí)；第二次加粗粉重量4倍量質(zhì)量濃度92％的乙醇，提取4小時(shí)；第三次加粗粉重量4倍量質(zhì)量濃度92％的乙醇，提取4小時(shí)，第四次加粗粉重量4倍量質(zhì)量濃度92％的乙醇，提取4小時(shí)，第五次加粗粉重量4倍量質(zhì)量濃度92％的乙醇，提取4小時(shí)；合并五次提取液，過(guò)濾得乙醇提取液；D)一級(jí)濃縮：將步驟C)所得乙醇提取液在真空度-0.05～-0.06MPa、溫度60℃的條件下減壓濃縮，至比重為1.10時(shí)，得乙醇濃縮液；E)脫脂：將步驟D)所得乙醇濃縮液加入乙醇濃縮液重量10倍量的蒸餾水，邊攪拌邊升溫至80～90℃后，攪拌10分鐘，攪拌速度為60轉(zhuǎn)/分，然后保溫靜置1小時(shí)使油水分層；F)二級(jí)濃縮：將步驟E)所得下層水液放出，經(jīng)濾紙過(guò)濾后，濾液在溫度60℃、真空度-0.05～-0.06MPa條件下減壓濃縮，濃縮至比重為1.05時(shí)，制得美洲大蠊流浸膏。取10g美洲大蠊流浸膏在該條件下繼續(xù)濃縮到比重為1.23，可得美洲大蠊干浸膏約7g。(2)第一種有效成分的制備：G)將實(shí)施例1得到的流浸膏，經(jīng)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱層析，水洗，然后60％乙醇-水洗脫,最后用無(wú)水乙醇洗脫，分別收集洗脫液。H)將上一步得到的60％乙醇洗脫液在60℃減壓濃縮至無(wú)醇味，真空減壓干燥，粉碎得第一種有效成分。(3)第二種有效成分的制備：I)將實(shí)施例2得到的水洗脫液與無(wú)水乙醇洗脫液合并，減壓濃縮至比重為1.05，得濃縮液。J)將步驟I所得濃縮液加入濃縮液重量8倍量的蒸餾水，經(jīng)濾紙過(guò)濾后，在所得濾液中加入濃縮液1.0倍量藥用活性炭在60℃溫度下攪拌40分鐘，使其充分吸附；K)洗脫：將步驟J所得含活性炭藥液裝入層析柱中，放出藥液，先用藥用活性炭10倍量蒸餾水洗滌，水洗液棄去；再用藥用活性炭60倍量的洗脫劑洗脫，收集洗脫液，經(jīng)濾紙過(guò)濾，得洗脫濾液；其中，所用洗脫劑為苯酚濃度為15％的苯酚乙醇液。L)二級(jí)濃縮：將步驟K所得洗脫濾液在溫度50～60℃、真空度-0.05～-0.06MPa條件下減壓濃縮，濃縮至比重為1.20時(shí)，得治療乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏；M)干燥粉碎：將步驟L所得治療乙型肝炎用的美洲大蠊提取物浸膏在50～60℃溫度、真空度-0.04～-0.07MPa的條件下真空干燥，粉碎為細(xì)粉，即得到第二種有效成分。本實(shí)施例對(duì)第一種有效成分的提取得率為1％，第二種有效成分的提取得率為3％實(shí)施例4實(shí)施例1所得第一種有效成分對(duì)人口腔上皮癌(KB)細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗(yàn)1)測(cè)試樣品：測(cè)試樣品為實(shí)施例1中所述美洲大蠊干浸膏和第一種有效成分，以順鉑和阿霉素為陽(yáng)性對(duì)照。2)第一種有效成分的細(xì)胞毒性試驗(yàn)：KB細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％的胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升的鏈霉素。細(xì)胞以每孔5×103的濃度加入到96孔板中，在37℃含5％二氧化碳潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞存活率的測(cè)定用改良MTT法。細(xì)胞經(jīng)過(guò)24小時(shí)的孵育后，分別將新配的第一種有效成分的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中第一種有效成分最終濃度分別為200，66.7，22.2和7.4微克/毫升。72小時(shí)后，加入10微升MTT(5毫克/毫升)的磷酸鹽緩沖液，再繼續(xù)在37℃培養(yǎng)4小時(shí)后，離心5分鐘除去未轉(zhuǎn)化的MTT，每孔中加入200微升二甲亞砜，以溶解還原的MTT晶體甲臜(formazan)，所形成的formazan用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下比色，細(xì)胞存活率由樣品相對(duì)于對(duì)照品的比值計(jì)算。其中第一種有效成分對(duì)KB細(xì)胞半抑制濃度(IC50)由劑量效應(yīng)曲線(xiàn)得到。3)結(jié)果：如表1所示，第一種有效成分對(duì)口腔上皮癌細(xì)胞具有較強(qiáng)細(xì)胞毒活性，且其抑制口腔上皮癌細(xì)胞增值活性大大超過(guò)美洲大蠊干浸膏。4)實(shí)驗(yàn)結(jié)論：KB細(xì)胞是測(cè)試化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的有效工具和評(píng)價(jià)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)表明第一種有效成分對(duì)KB細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，有可能發(fā)展成為新的具有抗腫瘤作用的藥物。表1對(duì)口腔上皮癌細(xì)胞(KB)的細(xì)胞毒試驗(yàn)測(cè)試樣品IC50(微克/毫升)美洲大蠊干浸膏106.2提取物I3.09陽(yáng)性對(duì)照順鉑(DDP)0.47陽(yáng)性對(duì)照阿霉素(ADR)0.18實(shí)施例5第二種有效成分制備的藥物及治療病例：取實(shí)施例1中制備的第二種有效成分細(xì)粉500g，加淀粉200g、微晶纖維素300g、硬脂酸鎂2g混合均勻，得藥粉1000g，按每粒0.3g填充硬膠囊。70例慢性乙型肝炎及乙肝病毒攜帶者，證屬肝郁脾虛兼血瘀，隨機(jī)分為甲組42例(男24例、女18例，平均年齡26歲，20例輕度、9例中度、13例攜帶者)，乙組40例(男23例、女17例，平均年齡28歲，19例輕度、7例中度、14例攜帶者)。甲組口服給藥上述膠囊，每次2粒，每日兩次；乙組口服給藥拉米夫定片，每次2片，每日3次。兩組均給藥90天。檢查體溫、呼吸、脈率、血壓、血常規(guī)、大小便常規(guī)及隱血、總膽紅素、直接膽紅素、ALT、TTT、BUN、CRN、A/G、血K+Na+、Cl-等項(xiàng)目。治療結(jié)果：(1)對(duì)HBV感染標(biāo)志物陰轉(zhuǎn)影響對(duì)于慢性乙肝患者，甲組29例，HBeAg轉(zhuǎn)陰13例(轉(zhuǎn)陰率44.8％)，治療前后差異有顯著性(P＜0.05)，HBV-DNA轉(zhuǎn)陰11例(轉(zhuǎn)陰率37.9％)，治療前后差異有顯著性(P＜0.05)。乙組26例，HBeAg轉(zhuǎn)陰7例(轉(zhuǎn)陰率26.9％)，治療前后差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，HBV-DNA轉(zhuǎn)陰6例(轉(zhuǎn)陰率23.1％)，治療前后差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。但兩組間比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。提示甲組對(duì)HBeAg轉(zhuǎn)陰療效有優(yōu)于乙組的趨勢(shì)。對(duì)于乙肝病毒攜帶者，甲組13例，HBeAg轉(zhuǎn)陰4例(轉(zhuǎn)陰率30.8％)，治療前后差異有顯著性(P＜0.05)，HBV-DNA轉(zhuǎn)陰3例(轉(zhuǎn)陰率23.1％)，治療前后差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。乙組14例，HBeAg轉(zhuǎn)陰1例(轉(zhuǎn)陰率7.1％)，治療前后差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，HBV-DNA轉(zhuǎn)陰1例(轉(zhuǎn)陰率7.1％)，治療前后差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。但兩組間比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。提示甲組對(duì)HBeAg轉(zhuǎn)陰療效有優(yōu)于乙組的趨勢(shì)。(2)對(duì)肝功能的影響在復(fù)常影響方面，TBiL指標(biāo)，甲組治前異常5例，治后復(fù)常5例，復(fù)常率100％，治療前后差異有顯著性(P＜0.05)；乙組治前異常4例，治后復(fù)常1例，復(fù)常率25.0％，治療前后差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，組間比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，提示甲組治療TBiL復(fù)常有效且有優(yōu)于乙組的趨勢(shì)。ALT指標(biāo)，甲組治前異常13例，治后復(fù)常8例，復(fù)常率61.5％，治療前后差異有顯著性(P＜0.05)；乙組治前異常11例，治后復(fù)常6例，復(fù)常率54.5％，治療前后差異有顯著性(P＜0.05)，組間比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，提示甲乙兩組治療ALT復(fù)常均有效且療效相當(dāng)。AST指標(biāo)，甲組治前異常9例，治后復(fù)常5例，復(fù)常率55.60％，治療前后差異無(wú)顯著性(P＞0.05)；乙組治前異常3例，治后復(fù)常1例，復(fù)常率33.3％，組間比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，提示甲乙兩組治療AST復(fù)常均欠佳。A/G指標(biāo)，甲組治前異常15例治后復(fù)常9例，復(fù)常率60％，治療前后差異有顯著性(P＜0.05)；乙組治前異常6例，治后復(fù)常4例，復(fù)常率66.7％，治療前后差異有顯著性(P＜0.05)，組間比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，提示甲乙兩組治療A/G復(fù)常均有效且療效相當(dāng)。SP指標(biāo)，甲組治前異常16例，治后復(fù)常8例，復(fù)常率50.0％，治療前后差異無(wú)顯著性(P＞0.05)；乙組治前異常13例，治后復(fù)常10例，復(fù)常率76.9％，治療前后差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，組間比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，提示甲乙兩組治療SP復(fù)常療效欠佳。對(duì)肝功能療效相當(dāng)，僅TBiL療效甲組優(yōu)于乙組(P＜0.05)。(3)中醫(yī)證候療效甲組38例，臨床控制9例，顯效15例，有效8例，無(wú)效6例，總有效率84.2％，總顯效率63.2％；乙組37例，臨床控制2例，顯效10例，有效6例，無(wú)效19例，總有效率48.6％，總顯效率32.4％，兩組間差異有顯著性(P＜0.05)，提示甲組對(duì)中醫(yī)證候療效優(yōu)于乙組。在改善癥狀程度上，甲組脅肋疼痛、腹脹、食欲不振治療前后差異有顯著性(P＜0.05)，提示甲組能改善脅肋疼痛、腹脹、食欲不振，但甲乙兩組間比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，提示甲組有優(yōu)于乙組的趨勢(shì)。(4)舌、脈象情況舌象，甲組正常8例，治前異常而治后正常24例、治后異常10例；乙組正常6例，治前異常而治后正常13例、治后異常19例。脈象，甲組正常7例，治前異常而治后正常21例，治后異常14例；乙組正常8例，治前異常而治后正常14例，治后異常18例。(5)對(duì)凝血酶原活動(dòng)度的影響兩組凝血酶原治療前后比較差異均無(wú)顯著性，兩組間亦無(wú)差異顯著性，提示兩組對(duì)凝血酶原影響較小。(6)體征變化情況兩組內(nèi)及兩組間治療前后心率、收縮壓、舒張壓、肝脾B超比較差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)。(7)安全性觀(guān)察血常規(guī)正常33例，甲組治前異常而治后正常1例，治后異常1例；乙組治前異常而治后正常2例。尿常規(guī)、糞常規(guī)、BUN、Cr、ECG兩組各35例治療前后全正常。提示該藥服用安全。血常規(guī)，甲組正常40例，治前異常而治后異常1例、乙組正常39例；尿常規(guī)，甲組正常39例，治前異常而治后正常3例、乙組正常40例；ECG，甲組正常32例，治前異常而治后正常4例，治后異常6例、乙組正常35例，治前異常而治后異常5例；糞常規(guī)、BUN、Cr兩組共82例治療前后全正常。提示該藥服用安全。(8)不良反應(yīng)觀(guān)測(cè)82例病人服藥觀(guān)察期間，未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等效物界定。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3