本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種聚合物膠束及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

透皮給藥系統(tǒng)(transdermal therapeutic system，TTS)是指在皮膚表面給藥，藥物以恒定速度依次穿透角質(zhì)層、表皮層、真皮層，最終進(jìn)入體循環(huán)，產(chǎn)生全身或局部治療作用的新興制劑。透皮給藥有以下4個(gè)優(yōu)勢：

(1)透皮給藥系統(tǒng)可避免肝臟的首過效應(yīng)和藥物在胃腸道的滅活，藥物的吸收不受胃腸道因素的影響.減少用藥的個(gè)體差異。

(2)維持恒定有效血藥濃度或生理效應(yīng)，避免口服給藥引起的血藥濃度峰谷現(xiàn)象，降低毒副反應(yīng)。

(3)減少給藥次數(shù)，提高治療效能，延長作用時(shí)間，避免多劑量給藥，使大多數(shù)病人易于接受。

(4)使用方便，患者可以自主用藥，也可以隨時(shí)撤銷用藥。

皮膚是人體的天然屏障，能夠阻礙藥物進(jìn)入體內(nèi)；大多數(shù)藥物，即使是劑量低、療效高的一些藥物，透皮速率也難以滿足治療需要，這成為研究開發(fā)TTS的最大障礙。如何保證足夠量的藥物透過皮膚進(jìn)入體內(nèi)達(dá)到治療劑量，是TTS研究的重點(diǎn)，高新技術(shù)及方法的應(yīng)用是解決問題的重要途徑。

目前，用于促進(jìn)皮膚滲透的技術(shù)可分為化學(xué)法和物理法。

化學(xué)法包括月桂氮卓酮、有機(jī)酸及其酯類化合物、吡咯烷酮類衍生物等化學(xué)試劑，其作用機(jī)理為溶解皮膚脂質(zhì)或使皮膚蛋白變性，增加類脂質(zhì)骨架的無序性，從而促進(jìn)藥物在角質(zhì)層擴(kuò)散，增加藥物在皮膚中的溶解度，使藥物透皮吸收增加。

物理方法包括離子電滲促透方法、超聲波促透方法、電致孔促透方法等，主要是通過電磁場、超聲波、激光等物理手段來促進(jìn)藥物的透皮吸收，物理促透技術(shù)最適宜于蛋白質(zhì)、肽類和某些大分子藥物的透皮吸收。

但是，上述兩種方法都有它們的局限性，化學(xué)法由于會(huì)破壞皮膚的表面結(jié)構(gòu)，所以會(huì)導(dǎo)致一些皮膚的刺激性反應(yīng)；而物理法主要依賴外界的作用，一般需要一些特殊的設(shè)備，所以限制了這類方法的應(yīng)用。

近年來，納米藥物載體在經(jīng)皮給藥領(lǐng)域的研究迅速增加。一些納米藥物制劑已進(jìn)入臨床研究階段，部分制劑產(chǎn)品如肝素脂質(zhì)體、雙氯芬酸脂質(zhì)體、聚維酮碘脂質(zhì)體、雌二醇納米乳、吲哚美辛納米乳等已上市應(yīng)用。納米藥物載體可有效促進(jìn)小分子藥物的透皮吸收，而在大分子藥物經(jīng)皮給藥研究方面也展現(xiàn)了良好的前景。

膠束材料作為一種納米級(jí)別的結(jié)構(gòu)，其表面的可修飾性，生物相容性使其成為了一種倍受關(guān)注的藥物載體，被廣泛運(yùn)用在藥物遞送，抗腫瘤和靶向治療等方面，但是目前為止，膠束的設(shè)計(jì)基本是基于腫瘤微環(huán)境，而將膠束運(yùn)用在透皮方面還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述不足，本發(fā)明提供了一種聚合物膠束及其應(yīng)用，該聚合物膠束能夠攜載藥物，促進(jìn)藥物進(jìn)入皮膚真皮層，且在皮膚的酸性pH環(huán)境具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，可以結(jié)合藥物進(jìn)行皮膚的局部靶向給藥。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：一種聚合物膠束，為核-殼結(jié)構(gòu)，由兩親性的嵌段共聚物在水中自組裝形成，所述嵌段共聚物的結(jié)構(gòu)通式如式(I)所示，

其中，R₁為聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚乳酸、聚苯乙烯、聚氨基酯、聚氧基丙烯酸烷酯或它們的衍生物；R₂為透皮肽，其氨基酸序列為ACTGSTQHQCG、RRRRRRR、ACSSSPSKHCG、ACKTGSHNQCG或HIITDPNMAEYL；m、n、z均為大于2的整數(shù)。

上述聚合物膠束中，R₁部分為疏水段；透明質(zhì)酸和R₂部分為親水段；m是指聚合物膠束中連接有R₁的透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元的單元數(shù)；n是指聚合物膠束中連接有的透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元的單元數(shù)；z是指未連接R₁和R₂的透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元的單元數(shù)。

R₁接枝率的高低以及R₁的分子量大小對藥物的靶向性均有影響，作為優(yōu)選，所述R₁在所在單體中的接枝率為1～20％。

作為優(yōu)選，聚合物膠束中，所述R₁的總分子量為1000～50000。

R₂接枝率的高低對整個(gè)聚合物膠束的透皮效果有影響，作為優(yōu)選，所述R₂在所在單體中的接枝率為1～20％。

作為優(yōu)選，所述R₁為聚氨基酯，R₂的氨基酸序列為ACTGSTQHQCG，m:n＝1:1，該方案不僅藥物靶向性好，透皮效果也最佳，能夠更好地發(fā)揮藥物的作用。

本發(fā)明還提供了所述的聚合物膠束在作為皮膚藥物載體中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種攜載藥物的聚合物膠束復(fù)合物，包括藥物和載體，所述載體為所述的聚合物膠束。

具體地，所述藥物為DNA、siRNA、miRNA或疏水類化學(xué)藥物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明以透明質(zhì)酸為主鏈，通過在主鏈上連接疏水的聚合物R₁和親水的多肽R₂制備獲得具有載藥功能的聚合物膠束，能夠促進(jìn)藥物進(jìn)入皮膚真皮層，且在皮膚的酸性pH環(huán)境下，具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，可以結(jié)合基因藥物進(jìn)行皮膚的局部靶向給藥。

(2)本發(fā)明聚合物膠束能夠高效攜載基因藥物，并作用于皮膚，實(shí)現(xiàn)皮膚的局部靶向給藥。

附圖說明

圖1為聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物中透明質(zhì)酸的¹H-NMR圖譜(溶劑為D₂O)；

圖2為聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物中透皮肽(ACTGSTQHQCG)的¹H-NMR圖譜(溶劑為D₂O)；

圖3為聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物中聚合物R₁的¹H-NMR圖譜(溶劑為CDCL₃)；

圖4為聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物中透明質(zhì)酸-多肽的¹H-NMR圖譜(溶劑為D₂O)；

圖5為聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物的¹H-NMR圖譜(溶劑為D₂O)；

圖6為聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物的TEM電鏡圖；

圖7為聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物的DLS粒徑測量結(jié)果示意圖；

圖8為聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物攜載基因后的TEM電鏡圖；

圖9為聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物攜載基因FITC-DNA后的入胞圖；圖中A為膠束/FITC-DNA組；B為裸FITC-DNA組；

圖10為聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物攜載基因FITC-DNA后在激光共聚焦下的透皮效果圖；圖中A為膠束/FITC-DNA；B為裸FITC-DNA組；

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例中透明質(zhì)酸來源于山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)，合成后的多肽經(jīng)純化，其純度為95％，取5mg透明質(zhì)酸或多肽樣品，溶解于D2O中，使用核磁共振儀(瑞士布魯克公司)進(jìn)行分析，兩者的13H NMR圖譜如圖1、圖2所示。

實(shí)施例1

聚合物膠束和聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物的制備：

1、高分子聚合物R₁(聚氨基酯)的合成

取3.73g三氨基丙醇和10g二丙烯酸-1,4-丁二酯，置于90℃下攪拌并加熱回流，進(jìn)行均聚反應(yīng)3小時(shí)；反應(yīng)完畢后，將產(chǎn)物溶解于20ml三氯甲烷中，加入10倍體積的經(jīng)過預(yù)冷的乙醚溶液，使產(chǎn)物沉淀；重復(fù)過濾沉淀的產(chǎn)物三次，將過濾后的產(chǎn)物真空干燥24小時(shí)，得到純度較高的聚合物聚氨基酯，核磁共振結(jié)果如圖3所示。

2、透明質(zhì)酸-多肽的合成

取100mg透明質(zhì)酸(MW＝17000)，置于20ml超純水中攪拌溶解，向其中加入15mg NHS和20mg EDC，活化透明質(zhì)酸1小時(shí)后，加入1mg透皮肽(ACTGSTQHQCG)，繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)～5小時(shí)至反應(yīng)完全進(jìn)行；將反應(yīng)后的反應(yīng)液裝入分子量為3500的透析袋中，透析24小時(shí)，除去未反應(yīng)上的雜質(zhì)和多肽，再加入凍干保護(hù)劑進(jìn)行凍干24小時(shí)，得到干燥的透明質(zhì)酸-多肽固體，核磁共振結(jié)果如圖4所示。

3、聚合物膠束的合成方法

將50mg透明質(zhì)酸-多肽溶于20ml水中，攪拌溶解后加入5mg NHS和10mg EDC，攪拌1h使透明質(zhì)酸上剩余的部分羧基活化。

取0.1g聚合物R₁，溶于10ml三氯甲烷中，加入100μl丙二胺，攪拌12h后，倒入預(yù)冷過的乙醚溶液中，取出沉淀將其置于室溫下的真空干燥箱中，得到經(jīng)過氨基修飾的聚合物R₁。

將0.1g經(jīng)過修飾的聚合物R₁溶于pH＝3的水中，隨后加入活化后的透明質(zhì)酸-多肽溶液，繼續(xù)攪拌6小時(shí)，將終產(chǎn)物透析24小時(shí)，除去雜質(zhì)和未反應(yīng)的原料；再加入凍干保護(hù)劑，并凍干24小時(shí)，得到干燥的最終產(chǎn)物聚合物膠束，核磁共振結(jié)果如圖5所示。

4、聚合物膠束負(fù)載基因的方法

取10mg聚合物膠束，溶解于1ml水中，調(diào)節(jié)pH至3，使聚合物膠束完全溶解于水中。取2μg FITC-DNA，向其中加入10μl的聚合物膠束溶液，隨后稀釋至30μl，在37℃下孵育15分鐘制得聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物。

實(shí)施例2

聚合物膠束和聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物的制備：

1、高分子聚合物R₁(聚氨基酯)的合成

取3.73g三氨基丙醇和10g二丙烯酸-1,4-丁二酯，置于90℃下攪拌并加熱回流，進(jìn)行均聚反應(yīng)3小時(shí)；反應(yīng)完畢后，將產(chǎn)物溶解于20ml三氯甲烷中，加入10倍體積的經(jīng)過預(yù)冷的乙醚溶液，使產(chǎn)物沉淀；重復(fù)過濾沉淀的產(chǎn)物三次，將過濾后的產(chǎn)物真空干燥24小時(shí)，得到純度較高的聚合物聚氨基酯，核磁共振結(jié)果如圖3所示。

2、透明質(zhì)酸-多肽的合成

取100mg透明質(zhì)酸(MW＝17000)，置于20ml超純水中攪拌溶解，向其中加入15mg NHS和20mg EDC，活化透明質(zhì)酸1小時(shí)后，加入50mg透皮肽(ACTGSTQHQCG)，繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)～5小時(shí)至反應(yīng)完全進(jìn)行；將反應(yīng)后的反應(yīng)液裝入分子量為3500的透析袋中，透析24小時(shí)，除去未反應(yīng)上的雜質(zhì)和多肽，再加入凍干保護(hù)劑進(jìn)行凍干24小時(shí)，得到干燥的透明質(zhì)酸-多肽固體，核磁共振結(jié)果如圖4所示。

3、聚合物膠束的合成方法

將50mg透明質(zhì)酸-多肽溶于20ml水中，攪拌溶解后加入5mg NHS和10mg EDC，攪拌1h使透明質(zhì)酸上剩余的部分羧基活化。

取1g聚合物R₁，溶于10ml三氯甲烷中，加入100μl丙二胺，攪拌12h后，倒入預(yù)冷過的乙醚溶液中，取出沉淀將其置于室溫下的真空干燥箱中，得到經(jīng)過氨基修飾的聚合物R₁。

將1g經(jīng)過修飾的聚合物R₁溶于pH＝3的水中，隨后加入活化后的透明質(zhì)酸-多肽溶液，繼續(xù)攪拌6小時(shí)，將終產(chǎn)物透析24小時(shí)，除去雜質(zhì)和未反應(yīng)的原料；再加入凍干保護(hù)劑，并凍干24小時(shí)，得到干燥的最終產(chǎn)物聚合物膠束，核磁共振結(jié)果如圖5所示。

4、聚合物膠束負(fù)載基因的方法

取10mg聚合物膠束，溶解于1ml水中，調(diào)節(jié)pH至3，使聚合物膠束完全溶解于水中。取2μg FITC-DNA，向其中加入10μl的聚合物膠束溶液，隨后稀釋至30μl，在37℃下孵育15分鐘制得聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物。

實(shí)施例3

取100mg透明質(zhì)酸(MW＝17000)，置于20ml超純水中攪拌溶解，向其中加入15mg NHS和20mg EDC，活化透明質(zhì)酸1小時(shí)后，加入10mg透皮肽(ACTGSTQHQCG)，繼續(xù)攪拌4小時(shí)至反應(yīng)完全進(jìn)行；將反應(yīng)后的反應(yīng)液裝入分子量為3500的透析袋中，透析24小時(shí)，除去未反應(yīng)上的雜質(zhì)和多肽，再加入凍干保護(hù)劑進(jìn)行凍干24小時(shí)，得到干燥的透明質(zhì)酸-多肽固體。

將50mg透明質(zhì)酸-多肽溶于20ml水中，攪拌溶解后加入5mg NHS和10mg EDC，攪拌1h使透明質(zhì)酸上剩余的部分羧基活化。

取0.5g聚合物R₁，溶于10ml三氯甲烷中，加入100μl丙二胺，攪拌12h后，倒入預(yù)冷過的乙醚溶液中，取出沉淀將其置于室溫下的真空干燥箱中，得到經(jīng)過氨基修飾的聚合物R₁。

將0.5g經(jīng)過修飾的聚合物R₁溶于pH＝3的水中，隨后加入活化后的透明質(zhì)酸-多肽溶液，繼續(xù)攪拌6小時(shí)，將終產(chǎn)物透析24小時(shí)，除去雜質(zhì)和未反應(yīng)的原料；再加入凍干保護(hù)劑，并凍干24小時(shí)，得到干燥的最終產(chǎn)物聚合物膠束，此產(chǎn)物即為最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下所得的膠束。

聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物的驗(yàn)證：

(1)對空載的聚合物膠束和攜載DNA后的聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物進(jìn)行形態(tài)觀察

取空載的聚合物膠束和攜載DNA后的聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物，分別加在專用銅網(wǎng)上，直接在透射電鏡下觀察粒子的大小和形態(tài)，結(jié)果如圖6和圖8所示。

(2)聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物在黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)的攝取實(shí)驗(yàn)

將B16F10細(xì)胞(1×10⁵/孔)接種于12孔板，過夜培養(yǎng)，分別加入聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物和空白FITC-DNA溶液，在孵箱中培養(yǎng)3h之后，使用PBS(PH＝7.4)洗細(xì)胞三次，終止細(xì)胞對加入復(fù)合物或溶液的攝取，收集細(xì)胞，并將細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀中檢測細(xì)胞的陽性率，結(jié)果如圖9所示。

結(jié)果顯示，通過膠束攜載FITC-DNA后可以明顯提高復(fù)合物的入胞效率，僅3小時(shí)后就可以將膠束/FITC-DNA復(fù)合物進(jìn)入接近80％的細(xì)胞內(nèi)，而單獨(dú)的裸FITC-DNA幾乎無法進(jìn)入細(xì)胞。

(3)聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物

取大鼠皮，脫脂棉小心去除皮膚的皮下組織和脂肪，用生理鹽水洗凈皮膚，將皮膚固定在Franz透皮擴(kuò)散池的供給室和接受室之間，角質(zhì)層朝上，接受室注滿PBS溶液(PH＝7.4)，供給室加入1ml制備好的含有聚合物膠束和FITC-DNA的混合溶液，用封口膜封口，避免供給室液體蒸發(fā)。擴(kuò)散池放在32℃恒溫水浴中持續(xù)攪拌，轉(zhuǎn)速為300rmp，經(jīng)過24小時(shí)后停止實(shí)驗(yàn)，拆除擴(kuò)散池裝置，用棉簽輕輕將皮膚擦拭干凈，置于載玻片上，立刻置于共聚焦顯微鏡下觀察聚合物膠束/FITC-DNA復(fù)合物在皮膚內(nèi)的分布。

以垂直皮膚角質(zhì)層為z軸，以皮膚角質(zhì)層為掃描起點(diǎn)，沿著z軸進(jìn)行皮膚的逐層掃描，每間隔10μm掃描一次。以488為FITC激發(fā)波長，以空白的FITC-DNA溶液為對照組，觀察皮膚內(nèi)熒光，結(jié)果如圖10所示。