本發(fā)明涉及動(dòng)物生物制品領(lǐng)域，具體而言，涉及一種豬瘟粘膜免疫活疫苗組合物及該疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
豬瘟是由豬瘟病毒引起的一種世界性的高度接觸性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列入OIE疾病目錄。在我國(guó)，豬瘟是威脅養(yǎng)豬業(yè)的重大病毒性傳染病之一。我國(guó)于1954年成功研制出豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)也稱豬瘟C株，推廣應(yīng)用至今，取得了顯著成效，豬瘟發(fā)病率和感染率逐年下降，但仍在我國(guó)幾乎所有的養(yǎng)豬地區(qū)成地方流行性。我國(guó)科學(xué)家研制的HCLV弱毒疫苗是世界上最有效、應(yīng)用范圍最廣的豬瘟疫苗。以此疫苗免疫為基礎(chǔ)，歐美發(fā)達(dá)國(guó)家使用HCLV毒株成功根除了豬瘟病毒。我國(guó)于1956年提出了消滅豬瘟的規(guī)劃，然而到現(xiàn)在60年過(guò)去了，豬瘟仍在我國(guó)不間斷地流行，消滅豬瘟仍然還有一段路要走。
在臨床上，豬瘟疫苗廣泛運(yùn)用，規(guī)?；i場(chǎng)種豬豬瘟免疫覆蓋率基本達(dá)到100％，因此初生仔豬通過(guò)初乳可以獲得被動(dòng)免疫，其被動(dòng)免疫持續(xù)時(shí)間與種豬免疫狀態(tài)密切相關(guān)。種豬抗體效價(jià)較高的子代小豬母源抗體可以持續(xù)到10周甚至更長(zhǎng)時(shí)間。被動(dòng)免疫力的存在雖然在一定程度上保護(hù)力仔豬免受豬瘟野毒的感染，但是也給豬瘟免疫帶來(lái)了干擾。當(dāng)仔豬母源抗體效價(jià)較高時(shí)使用疫苗免疫，進(jìn)入體內(nèi)的疫苗可快速被母源抗體中和而導(dǎo)致免疫失敗?；谠撛?，在臨床上要獲得比較好的免疫效果，需要對(duì)仔豬進(jìn)行母源抗體的監(jiān)測(cè)以指定符合特定豬場(chǎng)的免疫程序。但即便如此，由于仔豬個(gè)體差異也會(huì)造成仔豬的母源抗體的極大差異，因此使用該種方法免疫后依然有部分仔豬無(wú)法得到較好的免疫效果。
除此之外，由于豬瘟弱毒疫苗免疫后抗體產(chǎn)生慢，在免疫后有一段時(shí)間的免疫空窗期(即抗體陰性時(shí)間)，由于免疫空窗期的存在，加劇了豬瘟感染野毒的風(fēng)險(xiǎn)。
因此，提供一種能杜絕母源抗體對(duì)仔豬豬瘟病毒免疫的影響、且無(wú)免疫空窗期的存在的新型豬瘟疫苗勢(shì)在必行。
有鑒于此，特提出本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一目的在于提供一種豬瘟粘膜免疫活疫苗組合物，以解決上述問(wèn)題。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
一種豬瘟粘膜免疫活疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗由豬瘟粘膜免疫活疫苗和疫苗稀釋液組成；
所述豬瘟粘膜免疫活疫苗每頭份的量為750～30000RID。
優(yōu)選的，如上所述的豬瘟粘膜免疫活疫苗，所述疫苗稀釋液包括以下組份：
卡波姆0.1～10g/L以及左旋咪唑0.1～20g/L；
所用溶劑為含有如下組份的磷酸鹽緩沖液：
130～140mM氯化鈉、2～3mM氯化鉀、1～30mM磷酸氫二鈉以及1～5mM磷酸二氫鉀。
本發(fā)明采用的疫苗稀釋液中的主要成分為卡波姆和左旋咪唑，其中左旋咪唑具有增強(qiáng)免疫的作用，卡波姆是一種多聚物，在水溶液中形成凝膠，具有緩釋的功能，該物質(zhì)還可以與疫苗形成復(fù)合物阻止動(dòng)物體液內(nèi)的抗體中和疫苗的作用。
一種豬瘟粘膜免疫活疫苗的制備方法，包括如下步驟：
向豬源傳代細(xì)胞系中接種豬瘟種毒進(jìn)行培養(yǎng)得到病毒液，收獲病毒液并測(cè)定病毒液效價(jià)后，按照750～30000RID每頭份的量將所述病毒液添加到耐熱凍干保護(hù)劑中凍干即得成品；
優(yōu)選的，所述豬源傳代細(xì)胞系包括豬腎傳代細(xì)胞或豬睪丸傳代細(xì)胞。
本申請(qǐng)所用豬源傳代細(xì)胞系是豬腎細(xì)胞或豬睪丸細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)保存。
本發(fā)明創(chuàng)制出一種豬瘟的粘膜免疫疫苗，使用該疫苗可以通過(guò)滴鼻或口服的方式進(jìn)行免疫，對(duì)高母源抗體仔豬滴鼻免疫后可以刺激仔豬產(chǎn)生特異性的抗體，且在整個(gè)檢測(cè)時(shí)期內(nèi)豬瘟抗體均為陽(yáng)性，杜絕了母源抗體對(duì)仔豬豬瘟病毒免疫的影響，且無(wú)免疫空窗期的存在，是一種值得推廣的新型豬瘟疫苗。
優(yōu)選的，如上所述的豬瘟粘膜免疫活疫苗的制備方法，所述向豬源傳代細(xì)胞系中接種豬瘟種毒時(shí)的比例為：每100ml培養(yǎng)液接種0.1ml～1.5ml種毒。
所述種毒為豬瘟兔化弱毒株，保藏號(hào)為：CVCC AV1412，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，滴度為105RID/ml。
優(yōu)選的，如上所述的豬瘟粘膜免疫活疫苗的制備方法，所述向豬源傳代細(xì)胞系中接種豬瘟種毒進(jìn)行培養(yǎng)得到病毒液的操作包括：
1)、向豬源傳代細(xì)胞系中接種豬瘟種毒，34℃～37℃培養(yǎng)44h～52h；
2)、換液，34℃～37℃培養(yǎng)48h～96h后收獲病毒液。
進(jìn)一步優(yōu)選的，在步驟1)中，培養(yǎng)時(shí)所用的培養(yǎng)液為含3％～10％豬瘟專用血清的MEM培養(yǎng)基。
進(jìn)一步優(yōu)選的，在步驟2)中，培養(yǎng)時(shí)所用的培養(yǎng)液為含1％～3％豬瘟專用血清的MEM培養(yǎng)基。
豬瘟專用血清購(gòu)自呼和浩特市草原綠野生物工程材料有限公司；MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Thermo Fisher Scientific。
優(yōu)選的，如上所述的豬瘟粘膜免疫活疫苗的制備方法，重復(fù)步驟2)多次；
更優(yōu)選的，重復(fù)步驟2)8～12次。
優(yōu)選的，如上所述的豬瘟粘膜免疫活疫苗的制備方法，將每次收獲病毒液分別編號(hào)后置于-15℃～-25℃保存。
優(yōu)選的，如上所述的豬瘟粘膜免疫活疫苗的制備方法，病毒液效價(jià)大于5×105RID/mL。
上述多次收獲病毒液后，將得到的病毒液混合取樣后再進(jìn)行病毒液效價(jià)的測(cè)定。
兔體感染量(RID)測(cè)定法將疫苗稀釋后經(jīng)耳緣靜脈注射試驗(yàn)兔，通過(guò)測(cè)定兔體溫變化判定疫苗效價(jià)，是我國(guó)使用最為廣泛的豬瘟活疫苗效檢方法。該方法可直接檢測(cè)豬瘟疫苗中的活病毒含量。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
使用本發(fā)明提供的疫苗可以通過(guò)滴鼻或口服的方式進(jìn)行免疫，對(duì)高母源抗體仔豬滴鼻免疫后可以刺激仔豬產(chǎn)生特異性的抗體，且在整個(gè)檢測(cè)時(shí)期內(nèi)豬瘟抗體均為陽(yáng)性，杜絕了母源抗體對(duì)仔豬豬瘟病毒免疫的影響，且無(wú)免疫空窗期的存在，是一種值得推廣的新型豬瘟疫苗。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例1
1、按照常規(guī)方法復(fù)蘇、傳代豬睪丸細(xì)胞系(ST細(xì)胞)，將傳代后生長(zhǎng)良好的ST細(xì)胞使用細(xì)胞消化液(0.25％胰酶，5mM EDTA，pH7.2)進(jìn)行消化，使用含3％豬瘟專用血清的MEM培養(yǎng)基分散細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照適宜的濃度接種培養(yǎng)瓶或發(fā)酵罐。按照培養(yǎng)液體積的0.1％接種豬瘟種毒，34～37℃培養(yǎng)。
2、培養(yǎng)52小時(shí)后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，使用1％血清的MEM培養(yǎng)基代替；繼續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)后進(jìn)行第一次病毒液收獲，收獲后加入等量的1％血清的MEM培養(yǎng)基，連續(xù)收獲8次。將收獲的病毒液分別編號(hào)后置于-15℃～-25℃保存。
3、將8次收獲的病毒液混合取樣后按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄規(guī)定的方法進(jìn)行RID的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示混合樣大于5×105RID/ml。
4、耐熱保護(hù)劑的制備：將耐熱保護(hù)劑各組分，包括蔗糖、海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、明膠等按照一定比例配制后經(jīng)高壓滅菌備用。
5、配苗、凍干及分裝：在耐熱保護(hù)劑中按照10000RID每頭份的量加入一定量的豬瘟半成品，混勻后分裝為2ml/瓶，加蓋后置于凍干機(jī)內(nèi)，經(jīng)預(yù)凍、升華過(guò)程凍干疫苗形成成品。
6、成品檢驗(yàn)：按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄規(guī)定的方法對(duì)成品進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、霉菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)均合格，置于2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
7、稀釋液制備：每1L稀釋液含有：130mM氯化鈉、2mM氯化鉀、30mM磷酸氫二鈉、1mM磷酸二氫鉀、0.1g卡波姆、20g左旋咪唑。
該疫苗稀釋液的制備方法為：
將以上物質(zhì)溶解于注射用水中，按一定體積分裝后于106～121℃高壓滅菌25分鐘后備用。
實(shí)施例2
1、按照常規(guī)方法復(fù)蘇、傳代豬睪丸細(xì)胞系(ST細(xì)胞)，將傳代后生長(zhǎng)良好的ST細(xì)胞使用細(xì)胞消化液(0.25％胰酶，5mM EDTA，pH7.2)進(jìn)行消化，使用含10％豬瘟專用血清的MEM培養(yǎng)基分散細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照適宜的濃度接種培養(yǎng)瓶或發(fā)酵罐。按照培養(yǎng)液體積的1.5％接種豬瘟種毒，34～37℃培養(yǎng)。
2、培養(yǎng)44小時(shí)后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，使用3％血清的MEM培養(yǎng)基代替；繼續(xù)培養(yǎng)40小時(shí)后進(jìn)行第一次病毒液收獲，收獲后加入等量的3％血清的MEM培養(yǎng)基，連續(xù)收獲12次。將收獲的病毒液分別編號(hào)后置于-15℃～-25℃保存。
3、將12次收獲的病毒液混合取樣后按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄規(guī)定的方法進(jìn)行RID的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示混合樣大于5×105RID/ml。
4、耐熱保護(hù)劑的制備：將耐熱保護(hù)劑各組分，包括蔗糖、海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、明膠等按照一定比例配制后經(jīng)高壓滅菌備用。
5、配苗、凍干及分裝：在耐熱保護(hù)劑中按照10000RID每頭份的量加入一定量的豬瘟半成品，混勻后分裝為2ml/瓶，加蓋后置于凍干機(jī)內(nèi)，經(jīng)預(yù)凍、升華過(guò)程凍干疫苗形成成品。
6、成品檢驗(yàn)：按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄規(guī)定的方法對(duì)成品進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、霉菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)均合格，置于2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
7、稀釋液制備：每1L稀釋液含有：140mM氯化鈉、3mM氯化鉀、1mM磷酸氫二鈉、5M磷酸二氫鉀、10g卡波姆、0.1g左旋咪唑。
該疫苗稀釋液的制備方法為：
將以上物質(zhì)溶解于注射于水中，按一定體積分裝后于106～121℃高壓滅菌25分鐘后備用。
實(shí)施例3
1、按照常規(guī)方法復(fù)蘇、傳代豬睪丸細(xì)胞系(ST細(xì)胞)，將傳代后生長(zhǎng)良好的ST細(xì)胞使用細(xì)胞消化液(0.25％胰酶，5mM EDTA，pH7.2)進(jìn)行消化，使用含10％豬瘟專用血清的MEM培養(yǎng)基分散細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照適宜的濃度接種培養(yǎng)瓶或發(fā)酵罐。按照培養(yǎng)液體積的1％接種豬瘟種毒，34～37℃培養(yǎng)。
2、培養(yǎng)48小時(shí)后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，使用2％血清的MEM培養(yǎng)基代替；繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行第一次病毒液收獲，收獲后加入等量的2％血清的MEM培養(yǎng)基，連續(xù)收獲10次。將收獲的病毒液分別編號(hào)后置于-15℃～-25℃保存。
3、將10次收獲的病毒液混合取樣后按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄規(guī)定的方法進(jìn)行RID的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示混合樣大于5×105RID/ml。
4、耐熱保護(hù)劑的制備：將耐熱保護(hù)劑各組分，包括蔗糖、海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、明膠等按照一定比例配制后經(jīng)高壓滅菌備用。
5、配苗、凍干及分裝：在耐熱保護(hù)劑中按照10000RID每頭份的量加入一定量的豬瘟半成品，混勻后分裝為2ml/瓶，加蓋后置于凍干機(jī)內(nèi)，經(jīng)預(yù)凍、升華過(guò)程凍干疫苗形成成品。
6、成品檢驗(yàn)：按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄規(guī)定的方法對(duì)成品進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、霉菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)均合格，置于2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
7、稀釋液制備：每1L稀釋液含有：137mM氯化鈉、2.7mM氯化鉀、10mM磷酸氫二鈉、2mM磷酸二氫鉀、1g卡波姆、5g左旋咪唑。
該疫苗稀釋液的制備方法為：
將以上物質(zhì)溶解于注射于水中，按一定體積分裝后于106～121℃高壓滅菌25分鐘后備用。
實(shí)驗(yàn)例1疫苗對(duì)斷奶仔豬的安全性試驗(yàn)
對(duì)本發(fā)明三個(gè)實(shí)施例制備的疫苗進(jìn)行斷奶仔豬安全性試驗(yàn)。購(gòu)買無(wú)豬瘟抗體21日齡斷奶仔豬35頭，隨機(jī)分為7組，分別標(biāo)記為1～7組，其中第1、2、3組分別接種單劑量的實(shí)施例1，實(shí)施例2和實(shí)施例3疫苗(10000RID，2ml)，4、5、6組分別接種5倍劑量的實(shí)施例1，實(shí)施例2和實(shí)施例3疫苗(50000RID，10ml)，7組接種稀釋液2ml。所有組均采用頸部肌肉注射的方法接種疫苗。接種后每天觀察仔豬采食并測(cè)定體溫。
結(jié)果表明使用單計(jì)量和5倍劑量的疫苗接種后各組動(dòng)物體溫正常，采食正常，接種后接種部位無(wú)肉眼可見(jiàn)變化，接種后2周觸摸無(wú)硬物感，由此表明該疫苗對(duì)斷奶仔豬非常安全。
實(shí)驗(yàn)例2疫苗對(duì)初生仔豬的安全性試驗(yàn)
對(duì)本發(fā)明三個(gè)實(shí)施例制備的3個(gè)批次的疫苗進(jìn)行安全性試驗(yàn)。購(gòu)買3日齡仔豬35頭，隨機(jī)分為7組，分別標(biāo)記為1～7組，其中第1、2、3組分別接種單劑量的實(shí)施例1，實(shí)施例2和實(shí)施例3疫苗(10000RID，2ml)，4、5、6組分別接種2倍劑量的HC2015001，HC2015002和HC2015003疫苗(20000RID，2ml)，7組接種稀釋液2ml。所有組均采用滴鼻接種，每只鼻孔接種1ml。接種后每天觀察仔豬吃乳并測(cè)定體溫。
結(jié)果表明使用單計(jì)量和2倍劑量的疫苗接種后各組動(dòng)物體溫正常，吃乳正常。由此表明該疫苗對(duì)斷奶仔豬非常安全。
實(shí)驗(yàn)例3疫苗的免疫效力實(shí)驗(yàn)
對(duì)本發(fā)明三個(gè)實(shí)施例制備的3個(gè)批次的疫苗進(jìn)行免疫效力實(shí)驗(yàn)。購(gòu)買3日齡豬瘟母源抗體陽(yáng)性仔豬20頭，隨機(jī)分為4組，每組5頭，分別編號(hào)1～4組，其中1、2、3組接種實(shí)施例1，實(shí)施例2和實(shí)施例3疫苗(10000RID，2ml)三個(gè)批次的疫苗各1頭份，4組接種疫苗稀釋液。均為滴鼻接種，每只豬每個(gè)鼻孔接種1ml。接種后28天(32日齡)所有豬肌肉注射豬瘟檢驗(yàn)用強(qiáng)毒石門血毒，1ml/頭，豬瘟攻毒后連續(xù)觀察14天并記錄各組發(fā)病和死亡情況。
結(jié)果表明，攻毒后實(shí)施例1、2、3組仔豬精神狀態(tài)、體溫、采食正常，免疫對(duì)照組發(fā)病率和死亡率均為0/5，保護(hù)率為5/5，而對(duì)照發(fā)病率組為5/5，死亡率為5/5，保護(hù)率為0/5。
實(shí)驗(yàn)例4疫苗的免疫持續(xù)期實(shí)驗(yàn)
對(duì)本發(fā)明三個(gè)實(shí)施例制備的3個(gè)批次的疫苗進(jìn)行免疫持續(xù)期的測(cè)定，購(gòu)買3日齡豬瘟母源抗體陽(yáng)性仔豬25頭，隨機(jī)分為5組，每組5頭，分別編號(hào)G1～G5組，其中G1、G2、G3組接種實(shí)施例1，實(shí)施例2和實(shí)施例3疫苗(10000RID，2ml)三個(gè)批次的疫苗各一頭份，G4組接種疫苗稀釋液。均為滴鼻接種，每只豬每個(gè)鼻孔接種1ml。接種后35天進(jìn)行第二次接種，分別肌肉注射接種對(duì)應(yīng)批次的疫苗1頭份(10000RID，2ml)，對(duì)照組接種同等劑量的稀釋液。G5組免疫實(shí)施例1批次的疫苗，第一次免疫時(shí)與第一組免疫方式一樣，第二次免疫時(shí)該組不免疫。分別在3、15、28、56、70、90、120、150、180日齡采集血清，使用豬瘟阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(美國(guó)IDEXX生物科技有限公司)按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行抗體測(cè)定。
結(jié)果表明，免疫組在3～180日齡豬瘟抗體均為陽(yáng)性，而對(duì)照組G4在3日齡、15全部為陽(yáng)性，28日齡部分仔豬為陰性，56日齡及此后對(duì)照組所有實(shí)驗(yàn)豬抗體均為陰性。根據(jù)以上結(jié)果，使用本發(fā)明制備的疫苗進(jìn)行單次免疫或2次免疫抗體持續(xù)期至少為180天即6個(gè)月。各組抗體陽(yáng)性率變化趨勢(shì)見(jiàn)表1所示。
表1免疫后豬瘟抗體陽(yáng)性率變化趨勢(shì)
最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。