本發(fā)明涉及組織工程仿生技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人工再生骨的制備方法。

背景技術(shù)：

創(chuàng)傷、腫瘤、慢性炎癥等疾病都會(huì)造成人體骨缺損，對(duì)于較大的骨缺損在臨床治療時(shí)需要進(jìn)行替代物植入，目前臨床所用的植入物主要為自體骨，自體骨移植通常用于修復(fù)小面積的骨缺損，被業(yè)界認(rèn)為是一種安全可靠、骨融合率較高的方法，但是術(shù)后供骨位置創(chuàng)傷、有限取骨量等弊端限制其在較大面積骨缺損方面的應(yīng)用。因此，目前對(duì)于大段骨缺損超過(guò)30％的病患進(jìn)行臨床上治療仍然是一大難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可對(duì)人體或動(dòng)物體上的大段骨缺損進(jìn)行治療，且安全可靠、骨融合率較高的人工再生骨的制備方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：一種人工再生骨的制備方法，其具體制備過(guò)程為：新鮮骨塊脫細(xì)胞處理→制備透明質(zhì)酸水凝膠→制備濃縮骨髓→制備人工再生骨，其中：

所述的新鮮骨塊脫細(xì)胞處理的具體過(guò)程為：

(1)、從剛?cè)ナ赖氖w上取新鮮骨塊，并剔除血污和骨膜，然后用PBS溶液沖去新鮮骨塊中的骨髓，再將新鮮骨塊放入PBS溶液中浸泡將血污清洗干凈；

(2)、將上述干凈骨塊放入體積濃度為75％的酒精中浸洗1～2次，每次浸洗時(shí)間為1～3min，然后用PBS溶液將骨塊漂洗2～4次，再將骨塊浸入含有曲拉通X-100的PBS溶液中浸泡震蕩，其中：曲拉通X-100在PBS溶液中的質(zhì)量濃度為1～3％，骨塊與曲拉通X-100/PBS混合溶液的體積比為1：1～3，每6～8小時(shí)換液一次，共換液2～4次，然后將骨塊從曲拉通X-100/PBS混合溶液中取出，用PBS溶液漂洗1～2次；

(3)、將骨塊浸泡在含有胰脂酶的PBS溶液中，其中：胰脂酶在PBS溶液中的含量為500～5000U/L，骨塊與胰脂酶/PBS混合溶液的體積比為1：1～3，并控制胰脂酶/PBS混合溶液的溫度為30～40℃，對(duì)骨塊處理10～20小時(shí)，然后將骨塊從胰脂酶/PBS混合溶液中取出，并用PBS溶液漂洗1～2次，再將骨塊浸泡在含有DNA酶和RNA酶的PBS溶液中，其中：DNA酶和RNA酶在PBS溶液中的含量均為1000～3000U/L，骨塊與DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的體積比為1：1～3，控制DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的溫度為30～40℃，對(duì)骨塊處理5～10小時(shí)，然后將骨塊從DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液中取出，最后將骨塊放入含有青霉素與鏈霉素的PBS溶液中震蕩漂洗，其中：青霉素與鏈霉素在PBS溶液中的含量均為100～300U/L，每12小時(shí)換液一次，共換液兩次，漂洗結(jié)束后將脫細(xì)胞的骨塊取出置于PBS溶液中，并在4℃的溫度下保存待用；

所述的制備透明質(zhì)酸水凝膠的具體過(guò)程為：將平均分子量為1200000～1800000道爾頓的透明質(zhì)酸溶于水，得到質(zhì)量濃度為2～10％的透明質(zhì)酸水溶液，然后用1mol/L的鹽酸將透明質(zhì)酸水溶液的pH值調(diào)到1～3，再將透明質(zhì)酸水溶液放入冰箱在-20℃的條件下冷凍3～5天，最后在20～30℃的水浴中解凍一天，并用無(wú)菌水浸泡清洗去除多余的鹽酸，得到透明質(zhì)酸水凝膠，并在4℃的溫度下保存待用；

所述的制備濃縮骨髓的具體過(guò)程為：從剛?cè)ナ赖氖w上抽取骨髓，置于肝素抗凝管內(nèi)，并在1000～2000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10～20min，然后去除上層血漿，得到濃縮骨髓；

所述的制備人工再生骨的具體過(guò)程為：在無(wú)菌條件下，將脫細(xì)胞骨塊加工成所需尺寸和形狀的骨條，并將透明質(zhì)酸水凝膠注入骨條網(wǎng)格內(nèi)直至注滿，再將濃縮骨髓多點(diǎn)注入凝膠-骨條內(nèi)，以透明質(zhì)酸水凝膠不溢出骨條為限，得到人工再生骨。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)本方法加工得到的人工再生骨可對(duì)人體或動(dòng)物體上的大段骨缺損進(jìn)行治療，且操作簡(jiǎn)便，安全可靠；由于本方法中采用了患病動(dòng)物的同類或患者的同類的骨髓，同時(shí)透明質(zhì)酸水凝膠又很好地保護(hù)并限制了骨髓流失，且透明質(zhì)酸水凝膠的存在為其中所含的可以促進(jìn)骨生長(zhǎng)的干細(xì)胞提供合適的生長(zhǎng)環(huán)境，因此，透明質(zhì)酸水凝膠/骨髓/異體骨的三元體系可以很好地促進(jìn)缺損骨骼的再生，顯著提高骨融合率。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)施例一：一種人工再生骨的制備方法，其具體制備過(guò)程為：

(1)、從剛?cè)ナ赖娜说氖w上取新鮮骨塊，并剔除血污和骨膜，然后用PBS溶液沖去新鮮骨塊中的骨髓，再將新鮮骨塊放入PBS溶液中浸泡將血污等雜質(zhì)清洗干凈；

(2)、將上述干凈骨塊放入體積濃度為75％的酒精中浸洗2次，每次浸洗時(shí)間為3min，然后用PBS溶液將骨塊漂洗4次，再將骨塊浸入含有曲拉通X-100的PBS溶液中浸泡震蕩，其中：曲拉通X-100在PBS溶液中的質(zhì)量濃度為1％，骨塊與曲拉通X-100/PBS混合溶液的體積比為1：3，每6小時(shí)換液一次，共換液4次，然后將骨塊從曲拉通X-100/PBS混合溶液中取出，用PBS溶液漂洗2次；

(3)、將骨塊浸泡在含有胰脂酶的PBS溶液中，其中：胰脂酶在PBS溶液中的含量為5000U/L，骨塊與胰脂酶/PBS混合溶液的體積比為1：1，并控制胰脂酶/PBS混合溶液的溫度為30℃，對(duì)骨塊處理15小時(shí)，然后將骨塊從胰脂酶/PBS混合溶液中取出，并用PBS溶液漂洗2次，再將骨塊浸泡在含有DNA酶和RNA酶的PBS溶液中，其中：DNA酶和RNA酶在PBS溶液中的含量均為1000U/L，骨塊與DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的體積比為1：3，控制DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的溫度為40℃，對(duì)骨塊處理5小時(shí)，然后將骨塊從DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液中取出，最后將骨塊放入含有青霉素與鏈霉素的PBS溶液中震蕩漂洗，其中：青霉素與鏈霉素在PBS溶液中的含量均為100U/L，每12小時(shí)換液一次，共換液兩次，漂洗結(jié)束后將脫細(xì)胞的骨塊取出置于PBS溶液中，并在4℃的溫度下保存待用；

(4)、將平均分子量為1200000道爾頓的透明質(zhì)酸溶于水，得到質(zhì)量濃度為10％的透明質(zhì)酸水溶液，然后用1mol/L的鹽酸將透明質(zhì)酸水溶液的pH值調(diào)到1，再將透明質(zhì)酸水溶液放入冰箱在-20℃的條件下冷凍3天，最后在26℃的水浴中解凍一天，并用無(wú)菌水浸泡清洗去除多余的鹽酸，得到透明質(zhì)酸水凝膠，并在4℃的溫度下保存待用；

(5)、從剛?cè)ナ赖娜说氖w上抽取骨髓，置于肝素抗凝管內(nèi)，并在2000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，然后去除上層血漿，得到濃縮骨髓；

(6)、在無(wú)菌條件下，將脫細(xì)胞骨塊加工成所需尺寸和形狀的骨條，并將透明質(zhì)酸水凝膠注入骨條網(wǎng)格內(nèi)直至注滿，再將濃縮骨髓多點(diǎn)注入凝膠-骨條內(nèi)，以透明質(zhì)酸水凝膠不溢出骨條為限，得到人工再生骨。

實(shí)施例二：一種人工再生骨的制備方法，其具體制備過(guò)程為：

(1)、從剛?cè)ナ赖耐米拥氖w上取新鮮骨塊，并剔除血污和骨膜，然后用PBS溶液沖去新鮮骨塊中的骨髓，再將新鮮骨塊放入PBS溶液中浸泡將血污等雜質(zhì)清洗干凈；

(2)、將上述干凈骨塊放入體積濃度為75％的酒精中浸洗1次，每次浸洗時(shí)間為1min，然后用PBS溶液將骨塊漂洗2次，再將骨塊浸入含有曲拉通X-100的PBS溶液中浸泡震蕩，其中：曲拉通X-100在PBS溶液中的質(zhì)量濃度為3％，骨塊與曲拉通X-100/PBS混合溶液的體積比為1：1，每8小時(shí)換液一次，共換液2次，然后將骨塊從曲拉通X-100/PBS混合溶液中取出，用PBS溶液漂洗2次；

(3)、將骨塊浸泡在含有胰脂酶的PBS溶液中，其中：胰脂酶在PBS溶液中的含量為3000U/L，骨塊與胰脂酶/PBS混合溶液的體積比為1：2，并控制胰脂酶/PBS混合溶液的溫度為40℃，對(duì)骨塊處理10小時(shí)，然后將骨塊從胰脂酶/PBS混合溶液中取出，并用PBS溶液漂洗2次，再將骨塊浸泡在含有DNA酶和RNA酶的PBS溶液中，其中：DNA酶和RNA酶在PBS溶液中的含量均為3000U/L，骨塊與DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的體積比為1：1，控制DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的溫度為30℃，對(duì)骨塊處理10小時(shí)，然后將骨塊從DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液中取出，最后將骨塊放入含有青霉素與鏈霉素的PBS溶液中震蕩漂洗，其中：青霉素與鏈霉素在PBS溶液中的含量均為200U/L，每12小時(shí)換液一次，共換液兩次，漂洗結(jié)束后將脫細(xì)胞的骨塊取出置于PBS溶液中，并在4℃的溫度下保存待用；

(4)、將平均分子量為1800000道爾頓的透明質(zhì)酸溶于水，得到質(zhì)量濃度為3％的透明質(zhì)酸水溶液，然后用1mol/L的鹽酸將透明質(zhì)酸水溶液的pH值調(diào)到3，再將透明質(zhì)酸水溶液放入冰箱在-20℃的條件下冷凍5天，最后在20℃的水浴中解凍一天，并用無(wú)菌水浸泡清洗去除多余的鹽酸，得到透明質(zhì)酸水凝膠，并在4℃的溫度下保存待用；

(5)、從剛?cè)ナ赖耐米拥氖w上抽取骨髓，置于肝素抗凝管內(nèi)，并在1000r/min的轉(zhuǎn)速下離心20min，然后去除上層血漿，得到濃縮骨髓；

(6)、在無(wú)菌條件下，將脫細(xì)胞骨塊加工成所需尺寸和形狀的骨條，并將透明質(zhì)酸水凝膠注入骨條網(wǎng)格內(nèi)直至注滿，再將濃縮骨髓多點(diǎn)注入凝膠-骨條內(nèi)，以透明質(zhì)酸水凝膠不溢出骨條為限，得到人工再生骨。

實(shí)施例三：一種人工再生骨的制備方法，其具體制備過(guò)程為：

(1)、從剛?cè)ナ赖墓返氖w上取新鮮骨塊，并剔除血污和骨膜，然后用PBS溶液沖去新鮮骨塊中的骨髓，再將新鮮骨塊放入PBS溶液中浸泡將血污等雜質(zhì)清洗干凈；

(2)、將上述干凈骨塊放入體積濃度為75％的酒精中浸洗2次，每次浸洗時(shí)間為2min，然后用PBS溶液將骨塊漂洗3次，再將骨塊浸入含有曲拉通X-100的PBS溶液中浸泡震蕩，其中：曲拉通X-100在PBS溶液中的質(zhì)量濃度為2％，骨塊與曲拉通X-100/PBS混合溶液的體積比為1：2，每7小時(shí)換液一次，共換液3次，然后將骨塊從曲拉通X-100/PBS混合溶液中取出，用PBS溶液漂洗1次；

(3)、將骨塊浸泡在含有胰脂酶的PBS溶液中，其中：胰脂酶在PBS溶液中的含量為1000U/L，骨塊與胰脂酶/PBS混合溶液的體積比為1：3，并控制胰脂酶/PBS混合溶液的溫度為35℃，對(duì)骨塊處理20小時(shí)，然后將骨塊從胰脂酶/PBS混合溶液中取出，并用PBS溶液漂洗1次，再將骨塊浸泡在含有DNA酶和RNA酶的PBS溶液中，其中：DNA酶和RNA酶在PBS溶液中的含量均為2000U/L，骨塊與DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的體積比為1：2，控制DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液的溫度為35℃，對(duì)骨塊處理8小時(shí)，然后將骨塊從DNA酶、RNA酶/PBS混合溶液中取出，最后將骨塊放入含有青霉素與鏈霉素的PBS溶液中震蕩漂洗，其中：青霉素與鏈霉素在PBS溶液中的含量均為300U/L，每12小時(shí)換液一次，共換液兩次，漂洗結(jié)束后將脫細(xì)胞的骨塊取出置于PBS溶液中，并在4℃的溫度下保存待用；

(4)、將平均分子量為1500000道爾頓的透明質(zhì)酸溶于水，得到質(zhì)量濃度為8％的透明質(zhì)酸水溶液，然后用1mol/L的鹽酸將透明質(zhì)酸水溶液的pH值調(diào)到2，再將透明質(zhì)酸水溶液放入冰箱在-20℃的條件下冷凍4天，最后在30℃的水浴中解凍一天，并用無(wú)菌水浸泡清洗去除多余的鹽酸，得到透明質(zhì)酸水凝膠，并在4℃的溫度下保存待用；

(5)、從剛?cè)ナ赖墓返氖w上抽取骨髓，置于肝素抗凝管內(nèi)，并在1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min，然后去除上層血漿，得到濃縮骨髓；

(6)、在無(wú)菌條件下，將脫細(xì)胞骨塊加工成所需尺寸和形狀的骨條，并將透明質(zhì)酸水凝膠注入骨條網(wǎng)格內(nèi)直至注滿，再將濃縮骨髓多點(diǎn)注入凝膠-骨條內(nèi)，以透明質(zhì)酸水凝膠不溢出骨條為限，得到人工再生骨。

上述實(shí)施例中，剛?cè)ナ赖氖w可以為豬、狗、兔子、鼠等動(dòng)物的尸體，也可以為人的尸體。