本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

致病菌的擴散及其耐藥性的增強嚴重威脅著人類的健康和生命，抗菌藥物已作為常規(guī)用藥廣泛用于艾滋病、器官移植以及慢性消耗性疾病(如癌癥、糖尿病、尿毒癥等)的治療，雖然目前臨床上使用的抗菌藥劑(如酮康唑、阿米卡星、慶大霉素、活力康唑、伊曲康唑、特比萘芬、二性霉素、氟康唑等)對皮膚及淺表部位感染的療效較好，但這些抗菌藥物的蓄積毒性較強，常常引起肝腎損傷、消化道刺激、頭暈、過敏等，所以尋找作用機理獨特的新型抗菌藥物成為當今藥物研發(fā)的熱點之一。

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種革蘭氏陰性螺旋狀細菌。研究顯示，幽門螺桿菌是急、慢性胃炎以及胃、十二指腸潰瘍的主要致病原因,并可能與胃癌和胃粘膜相關(guān)性淋巴樣組織(MALT)惡性淋巴瘤發(fā)病有關(guān)。最近，世界衛(wèi)生組織將Hp歸為I類致癌物，它在胃癌發(fā)展中起主導作用。目前流行的治療Hp感染的方案是同時服用質(zhì)子泵抑制劑(PPI)加兩種抗生素(克拉霉素，阿莫西林、四環(huán)素、甲硝唑等選二種)的三聯(lián)療法。影響三聯(lián)療法的最主要因素被認為是Hp對抗菌劑的耐藥性；另一嚴重問題是質(zhì)子泵抑制劑會誘發(fā)消化不良，大量抗菌劑則導致消化道內(nèi)菌群的嚴重毀滅。因此，尋找高效、安全的抗Hp活性一類新藥物成為一個重要和迫切的任務。

近年來全球結(jié)核病的發(fā)病呈增高趨勢，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，目前全球受結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染的人口占世界人口的三分之一，其中5～10％的感染者成為結(jié)核病患者。我國每年出現(xiàn)活動性肺結(jié)核病人130萬例，其中傳染性肺結(jié)核約60萬例，其中傳染性肺結(jié)核約60萬例，是全球結(jié)核病高負擔國家之一。

自抗結(jié)核藥物相繼問世，使結(jié)核病的治療起到劃時代的變化。然而由于結(jié)核病患者的治療管理尚不十分規(guī)范，不規(guī)則化療，濫用抗結(jié)核藥物，使結(jié)核病耐藥情況日益嚴重，且耐藥性的變化更趨向于多種藥物同時耐藥，這給結(jié)核病的防治工作造成極大困難。因此尋找新的抗結(jié)核藥物，尤其是抗多藥耐藥性的抗結(jié)核藥物對保護人民身體健康，具有重要意義。

從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導化合物并進行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價值。

本發(fā)明涉及的化合物I是一個2009年發(fā)表(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的化合物，我們對化合物I進行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗菌活性進行了評價，其具有抗菌活性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分數(shù)分別為75％和25％。

本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。

藥效學實驗表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗菌作用。本發(fā)明的藥學上可接受的鹽具有同樣的藥效。

進一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗人體真菌活性，因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗人體真菌藥物。

進一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗幽門螺旋桿菌活性，說明對于與幽門螺旋桿菌密切相關(guān)的急、慢性胃炎、胃、十二脂腸潰瘍等疾病來講，組合物是一個極具開發(fā)潛力的化合物。它可直接用于相應疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備。

進一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抑制大腸桿菌、熒光假單孢菌、金黃色葡萄球、變形桿菌、新生隱球菌的作用，所以組合物可作為具有抗細菌作用的化合物，并有望在制備抗細菌藥物中得到應用。

進一步的，根據(jù)初步試驗的結(jié)果，本發(fā)明用固體培養(yǎng)基稀釋法測定了組合物對卡介苗、結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv株和耐多藥結(jié)核分枝桿菌(MDR MTB)三種結(jié)核菌的最小抑菌濃度，實驗結(jié)果證實組合物具有很強的抗結(jié)核菌和抗耐藥性結(jié)核菌活性，可作為治療結(jié)核菌感染疾病的先導化合物，也可用于制備治療結(jié)核病藥物。

以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。

具體實施方式

實施例1化合物Harrisotone A的制備

化合物Harrisotone A(I)的制備方法參照Sheng Yin等人發(fā)表的文獻(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的方法。

實施例2 Harrisotone A的O-溴乙基衍生物(II)的合成

將化合物I(472mg，1.00mmol)溶于15mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌3h。3h之后將反應液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然后對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌2次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(602mg，76％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ5.18(s,2H),4.56(s,2H),3.93(d,J＝16.7Hz,4H),3.79(s,2H),3.62(d,J＝0.9Hz,4H),3.15(s,2H),2.48(s,2H),2.41(d,J＝9.4Hz,4H),2.27(s,1H),1.95(s,1H),1.88–1.80(m,8H),1.77(d,J＝15.5Hz,7H),1.68(s,1H),1.61(s,1H),1.51(s,1H),1.25(d,J＝58.1Hz,1H),1.15–0.75(m,6H).¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.46(s),198.24(s),195.44(s),190.27(s),135.27(s),120.09(s),115.02(s),84.45(s),76.58(s),74.12(s),63.67(s),62.76(s),60.36(s),50.96(s),45.22(s),39.69(s),36.61(s),34.40(s),32.63(s),30.81(d,J＝8.9Hz),28.77(s),25.30(s),24.09(d,J＝19.2Hz),22.77(s),18.20(s).

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for C₃₄H₅₀Br₃O₆:793.1137；found 793.1134.

實施例3 Harrisotone A的O-(二乙氨基)乙基衍生物(III)的合成

將化合物II(396mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和二乙胺(2920mg，40mmol)，混合物加熱回流3h。反應結(jié)束后將反應液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物III的淡黃色固體(246.1mg,64％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.13(s,2H),4.19(s,2H),3.52(d,J＝5.3Hz,4H),3.21(s,2H),3.04(s,2H),2.85(s,12H),2.64(d,J＝13.5Hz,4H),2.33(s,3H),2.18(s,1H),2.11(s,2H),2.04(s,1H),1.98(s,1H),1.88(s,1H),1.77(d,J＝5.0Hz,7H),1.70(d,J＝15.5Hz,7H),1.61(s,1H),1.54(s,1H),1.44(s,1H),1.37(s,1H),1.10(s,24H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.30(s),198.04(s),195.18(s),190.07(s),135.11(s),119.89(s),114.86(s),84.15(s),76.42(s),66.70(s),62.58(s),60.18(s),59.97(s),52.53(s),51.93(s),50.76(s),47.69(s),45.04(s),39.51(s),36.43(s),30.63(d,J＝8.9Hz),28.61(s),25.10(s),23.93(d,J＝19.2Hz),22.57(s),18.04(s),12.27(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₄₆H₈₀N₃O₆:770.6047；found:770.6044。

實施例4 Harrisotone A的O-(哌嗪基)乙基衍生物的合成

將化合物II(396mg，0.5mmol)溶于16mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和無水哌嗪(6892mg，80mmol)，混合物加熱回流1h。反應結(jié)束后將反應液倒入15mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集淡棕色集中洗脫帶即得到化合物IV的淡棕色固體(286.9mg,71％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.14(s,2H),4.21(s,2H),3.53(d,J＝6.2Hz,4H),3.09(s,2H),3.05(s,2H),2.66(s,12H),2.57–2.53(m,4H),2.33(d,J＝15.0Hz,15H),2.24(s,1H),2.14(s,2H),2.10(s,1H),2.00(s,1H),1.88(d,J＝10.5Hz,3H),1.79(d,J＝5.0Hz,7H),1.71(d,J＝15.5Hz,7H),1.63(s,1H),1.55(s,1H),1.46(s,1H),1.15–1.05(m,8H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.30(s),198.04(s),195.28(s),190.07(s),135.11(s),119.89(s),114.86(s),84.25(s),76.42(s),66.70(s),62.58(s),60.18(s),59.97(s),54.35(s),54.16(s),53.66(s),50.78(s),45.24(s),45.06(s),39.49(s),36.45(s),30.61(d,J＝8.9Hz),28.61(s),25.10(s),23.93(d,J＝19.2Hz),22.58(s),18.04(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₄₆H₇₇N₆O₆:809.5905；found:809.5901。

實施例5組合物抗人體真菌活性

組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的75mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網(wǎng)的25mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。

抗人體真菌活性實驗是采用濃度稀釋的方法，每次測定重復三次，測試的病原菌有紅色毛癬菌、羊毛狀小孢子菌和斷發(fā)癬菌，菌液濃度為10⁵個/mL。藥物的起始濃度為50.00μg/mL(5％二甲基亞砜DMSO)，梯度稀釋至0.10μg/mL，等量體積的菌液和測試樣品混合培養(yǎng)在96孔板中(形成的最終濃度有：25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10和0.05μg/mL)，人體真菌培養(yǎng)溫度分別為28℃，培養(yǎng)時間24h后觀察，若發(fā)現(xiàn)沒有菌落形成的處理孔中最低的那個濃度為樣品最低抗菌濃度，即MIC值。該實驗陽性對照為酮康唑，組合物抗人體真菌結(jié)果見表1。

表1組合物抗人體真菌MIC值(μg/mL)

結(jié)論：組合物具有很強的抗人體真菌活性，因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗人體真菌藥物。化合物III和化合物IV無抗人體真菌活性，因此不能用于制備新型抗人體真菌藥物。

實施例6組合物抗幽門螺桿菌活性

1)供試菌株

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)標準菌株ATCC 43504購于美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)。13株Hp臨床菌株采自南京市鼓樓醫(yī)院胃鏡室接受胃鏡檢查的患者；在連續(xù)胃鏡檢查中對消化性潰瘍、十二指腸球炎或疣狀胃炎的患者，先經(jīng)快速尿素酶實驗確定為Hp陽性者，再取胃竇黏膜1-2塊，切碎后接種于含8％馬血清、三甲氧芐氨嘧啶(trimethropin,TMP)1.25g/L、多粘菌素(polymyxin)B2500U/L、萬古霉素(vancomycin)10mg/L的Columbia選擇性瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃在微氧環(huán)境下(5％O₂,10％CO₂和85％N₂)培養(yǎng)72小時。收集細菌，經(jīng)涂片革蘭氏染色，氧化酶、觸酶和尿素酶鑒定為陽性后，傳代純培養(yǎng)，所得菌株作為實驗菌株。

2)菌株培養(yǎng)

我們采用微需氧袋(購自上海醫(yī)科大學)進行HP的菌株培養(yǎng)，它可通過化學反應產(chǎn)生Hp所需要的微需氧環(huán)境。

3)生物活性測定

采用紙片法(Microbiological paper method)測定藥物對幽門螺桿菌的抑制作用，用瓊脂稀釋法來測定供試樣品的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)。

I.紙片法實驗

(A)準備培養(yǎng)基將配制好的Columbia培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，冷卻至50-60℃，加8％馬血清或綿羊血，混勻傾注于已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿中，每皿7-10ml，培養(yǎng)基厚度為1.5mm(無菌操作)。

(B)轉(zhuǎn)接實驗菌(涂菌)用微量取樣器取稀釋好的10⁸CFU/ml(1OD₆₆₀＝10⁸CFU/ml)Hp的菌懸液0.1ml均勻地涂抹在適宜的培養(yǎng)皿表面。倒置于37℃烘干箱中15min后取出，目的使瓊脂表面干燥，備用。

(C)貼樣品紙片用微量取樣器取6μl待測樣品(質(zhì)量濃度2mg/ml)注入已經(jīng)滅菌的圓濾紙片上。用無菌鑷子鑷取含樣品的紙片和對照空白紙片，按無菌操作分別紙片緊貼于含菌瓊脂表面，每隔一定距離貼一張紙片。每種菌做3皿，所得結(jié)果求其平均值。

(D)培養(yǎng)將各平皿置于微需氧袋中，封口，打開氣體發(fā)生器，再置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

(E)測抑菌圈直徑取出平板后，分別測量各紙片周圍抑菌圈直徑的大小。參照對照組的結(jié)果，可得出待測樣品敏感實驗的結(jié)果。重復三次。

II.瓊脂稀釋法測定MIC

(A)藥物平板的制備首先將測試的藥物用二甲基亞砜(DMSO)溶液配制成0.5mg/ml的母液，再用無菌水稀釋，最終配成100.0，80.0，60.0，45.0，40.0，35.0，30.0，25.0，20.0，15.0，10.0，5.0和2.5μg/ml的濃度系列，DMSO在介質(zhì)中的濃度小于1％。將1ml配制好的測試藥物溶液與保溫于50℃的8ml哥倫比亞培養(yǎng)基，另加1ml保溫于50℃的馬血清充分混勻，澆制入培養(yǎng)皿中冷卻即成(培養(yǎng)皿中藥物的終濃度為10.0，8.0，6.0，4.5，4.0，3.5，3.0，2.5，2.0，1.5，1.0，0.5和0.25μg/ml，如果有抑菌作用，則MIC值即這些值當中的一個)。

(B)轉(zhuǎn)接實驗菌(涂菌)用微量取樣器吸取稀釋好的1×10⁸CFU/ml Hp的菌懸液0.1ml均勻地涂抹在培養(yǎng)皿表面，倒置于37℃烘干箱中15min后取出，目的使瓊脂表面干燥，備用。

(C)確定MIC將待測培養(yǎng)皿在微需氧袋(含：85％N₂,10％CO₂和5％O₂)中，保溫37℃培養(yǎng)72小時，觀察Hp生長情況，與空白組相對照，以完全沒有菌生長的樣品最低濃度為最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)值。陽性對照為氨芐西林(Ampicillin)。

實驗結(jié)果

體外實驗表明，組合物具有很強的抗幽門螺旋桿菌活性，紙片法顯示其抑菌圈直徑為30mm(ATCC43504)。用瓊脂稀釋法顯示它能完全抑制5個隨機的臨床菌株和1個標準菌株(ATCC43504)的生長，最小抑菌濃度(MIC)均為2.0μg/ml。用氨芐西林作陽性對照，其對6株測試菌完全抑制的最小濃度(MIC)為1.5μg/ml。化合物III和化合物IV無抗幽門螺旋桿菌活性。

結(jié)論：組合物具有較強的抑制幽門螺旋桿菌活性，說明對于與幽門螺旋桿菌密切相關(guān)的急、慢性胃炎、胃、十二脂腸潰瘍等疾病來講，組合物是一個極具開發(fā)潛力的藥物。它可直接用于相應疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備?；衔颕II和化合物IV無抗幽門螺旋桿菌活性，不可以用于相應疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備。

實施例7組合物抗細菌活性

抗菌活性實驗是采用濃度稀釋的方法，每次測定重復三次，測試病原菌有大腸桿菌、熒光假單孢菌、金黃色葡萄球、變形桿菌、新生隱球菌，菌液濃度為10⁵個/mL。藥物起始濃度為50.00μg/mL(5％二甲基亞砜DMSO)，梯度稀釋至0.10μg/mL，等量體積的菌液和測試樣品混合培養(yǎng)在96孔板中(形成的最終濃度有：25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10和0.05μg/mL)，細菌培養(yǎng)溫度分別為37℃，培養(yǎng)時間24h后觀察，若發(fā)現(xiàn)沒有菌落形成的處理孔中最低的那個濃度為樣品最低抗菌濃度，即MIC值。組合物抗菌結(jié)果見表2。

表2組合物抗細菌MIC值(μg/mL)

結(jié)論：組合物具有很強的抗細菌活性，因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗細菌藥物?；衔颕II和化合物IV無抗細菌活性，不能被用于制備新型抗細菌藥物。

實施例8組合物抗結(jié)核菌活性

(1)固體培養(yǎng)基稀釋法測定組合物抗卡介苗(BCG)絕對濃度

從斜面上刮取卡介苗培養(yǎng)物，加入到3ml Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動研磨，與標準麥氏比濁管(MacFarland No.1)比濁，即配成1mg/ml的卡介苗(BCG)菌懸液。

將藥物用DMSO配成高濃度的原液，用含5％的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的藥物按所需劑量加入到4ml Middlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基已經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50～55℃)，混勻，制成含藥物，濃度分別為6.0ug/ml，4.0ug/ml，3.0ug/ml，2.0ug/ml，1.5ug/ml，1.0ug/ml，0.75ug/ml，0.5ug/ml等濃度的斜面培養(yǎng)基。

將濃度為1mg/ml的卡介苗(BCG)菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含各個藥物系列濃度的培養(yǎng)基和空白對照培養(yǎng)基斜面上，置于37℃培養(yǎng)4～8周，觀察實驗結(jié)果，結(jié)果如表3所示。

本實施例中所用Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基和Middlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員進行結(jié)核菌培養(yǎng)時的常用培養(yǎng)基，其配方采用常規(guī)配方即可。

(2)固體培養(yǎng)基稀釋法測定組合物抗結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv株絕對濃度

從斜面上刮取結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv株培養(yǎng)物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動研磨，與標準麥氏比濁管(MacFarland No.1)比濁，即配成1mg/ml的H37Rv株菌懸液。

將藥物分別用DMSO配成高濃度的原液，用含5％的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的藥物按所需劑量加入到4ml Middlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基已經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50～55℃)，混勻，制成含藥物，濃度分別為6.0ug/ml，4.0ug/ml，3.0ug/ml，2.0ug/ml，1.5ug/ml，1.0ug/ml，0.75ug/ml，0.5ug/ml等濃度的斜面培養(yǎng)基。

將濃度為1mg/ml的H37Rv株菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含藥物系列濃度的培養(yǎng)基和空白對照培養(yǎng)基斜面上，置于37℃培養(yǎng)4～8周，觀察實驗結(jié)果，結(jié)果如表3所示。

(3)固體培養(yǎng)基稀釋法測定藥物抗結(jié)核分支桿菌臨床分離耐ISRE MTB株絕對濃度

從斜面上刮取結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISRE MTB株(耐異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇結(jié)核分枝桿菌臨床分離柱)培養(yǎng)物，加入到3ml Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動研磨，與標準麥氏比濁管(MacFarland No.1)比濁，即配成1mg/ml的菌懸液。

將藥物分別用DMSO配成高濃度的原液，用含5％的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至所需濃度，將稀釋好的藥物按所需劑量加入到4ml Middlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基已經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50～55℃)，混勻，制成含藥物，濃度分別為6.0ug/ml，4.0ug/ml，3.0ug/ml，2.0ug/ml，1.5ug/ml，1.0ug/ml，0.75ug/ml，0.5ug/ml等濃度的斜面培養(yǎng)基。

將濃度為1mg/ml的結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISRE MTB株菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含各個藥物系列濃度的培養(yǎng)基和空白對照培養(yǎng)基斜面上，置于37℃培養(yǎng)4～8周，觀察實驗結(jié)果，結(jié)果如表3所示。

表3固體培養(yǎng)基稀釋法測定組合物抗結(jié)核菌絕對濃度結(jié)果

表4固體培養(yǎng)基稀釋法測定化合物III抗結(jié)核菌絕對濃度結(jié)果

表5固體培養(yǎng)基稀釋法測定化合物IV抗結(jié)核菌絕對濃度結(jié)果

結(jié)論：組合物具有很強的抗結(jié)核菌和抗耐藥性結(jié)核菌活性，可作為治療結(jié)核菌感染疾病的先導化合物，也可用于制備治療結(jié)核病藥物?；衔颕II和化合物IV無抗結(jié)核菌和抗耐藥性結(jié)核菌活性，不能作為治療結(jié)核菌感染疾病的先導化合物，也不能用于制備治療結(jié)核病藥物。

實施例9本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備

取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機制成100片。

實施例10本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備

取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。