本發(fā)明涉及疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水包油包水型疫苗佐劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
疫苗是具有免疫原性又不至于導(dǎo)致機(jī)體患病的預(yù)防性生物制品。疫苗的抗原物質(zhì)多取自致病微生物的滅活產(chǎn)物或減毒產(chǎn)物，滅活抗原單獨(dú)免疫動(dòng)物時(shí)，不足以產(chǎn)生免疫原性，特別是免疫原性低、分子量小的抗原。因此需要用不同種類的佐劑來增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。
研究證實(shí)，在疫苗的制備過程中，佐劑作為能同抗原一起或預(yù)先注射到機(jī)體內(nèi)能增強(qiáng)免疫原性或改變免疫反應(yīng)類型的物質(zhì)，受到研究者在新型、高效疫苗復(fù)合物的研發(fā)中的重視。佐劑又稱非特異性免疫增強(qiáng)劑，本身不具抗原性，是一類先于抗原或與抗原同時(shí)作用，能非特異性地改變或增強(qiáng)免疫原性或改變免疫反應(yīng)類型。免疫佐劑的主要生物作用包括以下幾個(gè)方面：抗原物質(zhì)混合佐劑注入機(jī)體后，改變了抗原的物理性狀，可使抗原物質(zhì)緩慢地釋放，延長了抗原的作用時(shí)間；佐劑吸附了抗原后，增加了抗原的表面積，使抗原易于被抗原呈遞細(xì)胞吞噬；佐劑能刺激抗原呈遞細(xì)胞對(duì)抗原的處理；佐劑可促進(jìn)淋巴細(xì)胞之間的接觸，增強(qiáng)輔助T細(xì)胞的作用；可刺激致敏淋巴細(xì)胞的分裂和漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體。
疫苗佐劑根據(jù)劑型分為三類，分別為油包水型，水包油型和水包油包水型。油包水型油疫苗佐劑是由抗原液、穩(wěn)定劑及白油混合后，在高剪切力作用下制備而成。其免疫機(jī)理是在接種部位貯存一段時(shí)間，局部產(chǎn)生肉芽腫和炎癥反應(yīng)，吸引巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等聚集以識(shí)別抗原，產(chǎn)生抗體。同時(shí)，緩慢擴(kuò)散的油佐劑使抗原輸送到二級(jí)淋巴器官的時(shí)間延長，不斷刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而產(chǎn)生續(xù)期長、抗體水平高的免疫效力。雖然國內(nèi)外疫苗生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)工藝不斷改進(jìn)，用油質(zhì)量也不斷提高、但由于這種制劑的聯(lián)系油相在注射部位有駐留的傾向，注射阻力大，不易吸收，容易產(chǎn)生大量無菌膿腫和肉芽腫，保護(hù)性抗體產(chǎn)生速度慢、易對(duì)動(dòng)物胴體品質(zhì)造成不良影響，并且在接種期間可能引起劇烈的疼痛；水包油型具有注射部位顯現(xiàn)局部反應(yīng)小且穩(wěn)定性高的優(yōu)勢(shì)，然而包含或者暴露在連續(xù)相中的抗原很快在注射部位分散好被體液酶分解，難易提供長期的保護(hù)性抗體，常常需要特殊的免疫刺激劑和多次加強(qiáng)免疫，制備成本高，不被廣泛使用。
迄今為止，水包油包水型獸用疫苗佐劑的開發(fā)鮮有報(bào)道，這與其開發(fā)工藝的難度是密切相關(guān)的，現(xiàn)有技術(shù)的水包油包水型佐劑由于配方成分、制備工藝不夠合理，因此在使用環(huán)節(jié)仍存在注射困難、免疫效力較低的缺陷。在這種情況下，如果能研制出一種高效佐劑，進(jìn)而提高獸用疫苗的效力和免疫時(shí)間，將會(huì)為家畜養(yǎng)殖業(yè)預(yù)防疾病帶來很廣闊的市場(chǎng)前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種水包油包水型疫苗佐劑及其應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)的疫苗佐劑所制備的疫苗存在注射困難的技術(shù)問題。
本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的疫苗佐劑對(duì)疫苗的免疫促進(jìn)作用較低。
本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的疫苗佐劑容易對(duì)機(jī)體產(chǎn)生刺激作用。
本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的疫苗佐劑成本較高。
本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是如何進(jìn)一步提升上述水包油包水型疫苗佐劑的免疫促進(jìn)效果。
本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是在利用本發(fā)明佐劑制備疫苗的過程中如何保證成品苗的使用性能。
為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種水包油包水型疫苗佐劑，包括以下重量百分比的成分：親水復(fù)合表面活性劑0.7～1.2％、親油復(fù)合表面活性劑0.9～1.5％、礦物油55～75％；同時(shí)，所述水包油包水型疫苗佐劑還包括以下濃度的成分：穩(wěn)定劑6～9g/L、添加劑2～5g/L。
作為優(yōu)選，所述親水復(fù)合表面活性劑選自以下成分的一種或幾種：月桂基葡糖苷、聚乙烯吡咯烷酮PVP-K30、聚乙二醇單油酸酯。
作為優(yōu)選，所述親油復(fù)合表面活性劑選自以下成分的一種或幾種：脂肪酸甲酯、單硬脂酸甘油酯、聚乙二醇雙油酸酯。
作為優(yōu)選，所述親水復(fù)合表面活性劑與親油表面活性劑的質(zhì)量百分比為6:4。
作為優(yōu)選，所述礦物油是白油。
作為優(yōu)選，所述白油在水包油包水型疫苗佐劑中所占的質(zhì)量百分比為83～90％。
作為優(yōu)選，所述穩(wěn)定劑是1,2-丙二醇。
作為優(yōu)選，所述水包油包水型疫苗佐劑還包括濃度為0.2～0.3g/mL的黃氏多糖注射液或濃度為0.2～0.3g/mL的黃氏多糖粉水溶液。
作為優(yōu)選，所述添加劑是葡萄糖甘氨酸。
同時(shí)，本發(fā)明提供了上述水包油包水型疫苗佐劑用于制備疫苗的應(yīng)用。
作為優(yōu)選，所述應(yīng)用包括以下步驟：在低速攪拌條件下，將滅活的抗原液滴加到所述水包油包水型疫苗佐劑中，滴加結(jié)束后低速攪拌30min，而后以5000rpm的剪切速度乳化3～5min。即得到所述疫苗；其中所述抗原液是新城疫病毒液、傳染性法氏囊病毒液、豬圓環(huán)病毒液或豬乙型腦炎病毒液。
作為優(yōu)選，以上操作步驟在無菌環(huán)境下操作，制備所用原料也均為無菌原料。
本發(fā)明提供了一種水包油包水型疫苗佐劑及其應(yīng)用，該技術(shù)方案優(yōu)選符合大生產(chǎn)需求、具有免疫增強(qiáng)作用的成分，根據(jù)水包油包水型微球的控釋原理設(shè)計(jì)添加方式，使其更有效的直接作用于免疫細(xì)胞，達(dá)到作用持久、生物利用度最大的效果。
本發(fā)明水包油包水型疫苗佐劑與傳統(tǒng)佐劑相比，更易注射，可以同時(shí)誘導(dǎo)短期免疫和長期免疫，提高免疫效力和細(xì)胞免疫水平，免疫持續(xù)期長，不易引起刺激，減少現(xiàn)有滅活疫苗的用油量，本發(fā)明優(yōu)選符合大生產(chǎn)需求的原材料，大大降低了制備成本。與此同時(shí)，本發(fā)明匹配了應(yīng)用其制備疫苗的方法，該方法經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，各組分成份的量變及操作步驟順序的改變均會(huì)影響復(fù)乳的包被效果、成品苗的粘度、穩(wěn)定性、免疫效果及注射后吸收情況等。
本發(fā)明制備的疫苗佐劑具有合理的控釋、靶向和隔離特性，注射免疫家禽后，水包油包水微球適時(shí)代謝破裂，全面刺激家禽淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。水相重的免疫增強(qiáng)劑能持久緩慢釋放在后期免疫細(xì)胞浸潤過程中，使其生物利用度達(dá)到最大化，表現(xiàn)為注射部位吸收良好、被注射動(dòng)物快速產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。
具體實(shí)施方式
以下將對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
以下實(shí)施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，“大約”表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十(10％)的范圍內(nèi)變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在“大約第一數(shù)值到第二數(shù)值”的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近似性語言可能與測(cè)量儀器的精度有關(guān)。
除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。
以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值；以下實(shí)施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
以下實(shí)施例及實(shí)驗(yàn)中所述的白油采用天津佐沐生物科技有限公司的產(chǎn)品，型號(hào)為VACCUTE-L；所述的新城疫病毒和傳染性法氏囊病毒均屬于常規(guī)毒株。
實(shí)施例1
一種水包油包水型疫苗佐劑，由以下成分組成：月桂基葡萄糖苷3.5g，聚乙二醇單油酸酯3.7g，脂肪酸甲酯2.0g，單硬脂酸甘油酯2.8g，白油VACCUTE-L88g，1,2-丙二醇1g，葡萄糖甘氨酸1g。
上述各成分按順序依次混勻，制備得到穩(wěn)定的水包油包水型疫苗佐劑。將上述佐劑平均分為5份，分別制備得到水包油包水型新城疫滅活疫苗、水包油包水型傳染性法氏囊病毒滅活疫苗、水包油包水型豬圓環(huán)病毒滅活疫苗、水包油包水型豬乙型腦炎病毒滅活疫苗。
以上5類疫苗均為乳白色穩(wěn)定乳劑，37℃保存35天，6000rpm離心15min，無水相析出；取清潔吸管吸取少許疫苗滴于清潔冷水表面，液滴呈云霧狀擴(kuò)散；
水包油包水型新城疫病毒滅活疫苗注射21日齡SPF雞，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型傳染性法氏囊病毒滅活疫苗注射1日齡SPF雞，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型豬圓環(huán)病毒滅活疫苗免疫4周齡仔豬，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型豬乙型腦炎病毒滅活疫苗免疫6-7月齡種豬，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
實(shí)施例2
一種水包油包水型疫苗佐劑，由以下成分組成：月桂基葡萄糖苷4.0g，聚乙二醇單油酸酯3.92g，脂肪酸甲酯3.0g，單硬脂酸甘油酯2.28g，白油VACCUTE-L 85g，1,2-丙二醇0.5g，司班80 1.3g。
上述各成分按順序依次混勻，制備得到穩(wěn)定的水包油包水型疫苗佐劑。將上述佐劑平均分為5份，分別制備得到水包油包水型新城疫滅活疫苗、水包油包水型傳染性法氏囊病毒滅活疫苗、水包油包水型豬圓環(huán)病毒滅活疫苗、水包油包水型豬乙型腦炎病毒滅活疫苗。
以上5類疫苗均為乳白色穩(wěn)定乳劑，37℃保存35天，6000rpm離心15min，無水相析出；取清潔吸管吸取少許疫苗滴于清潔冷水表面，液滴呈云霧狀擴(kuò)散；
水包油保水型新城疫病毒滅活疫苗注射21日齡SPF雞，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型傳染性法氏囊病毒滅活疫苗注射1日齡SPF雞，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型豬圓環(huán)病毒滅活疫苗免疫4周齡仔豬，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型豬乙型腦炎病毒滅活疫苗免疫6-7月齡種豬，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
實(shí)施例3
一種水包油包水型疫苗佐劑，由以下成分組成：聚乙烯吡咯烷酮2.8g，聚乙二醇單油酸酯3.2g，單硬脂酸甘油酯2.1g，聚乙二醇雙油酸酯3.9g，白油VACCUTE-L 89g，1,2-丙二醇0.5g，葡萄糖甘氨酸0.5g。
上述各成分按順序依次混勻，制備得到穩(wěn)定的水包油包水型疫苗佐劑。將上述佐劑平均分為5份，分別制備得到水包油包水型新城疫滅活疫苗、水包油包水型傳染性法氏囊病毒滅活疫苗、水包油包水型豬圓環(huán)病毒滅活疫苗、水包油包水型豬乙型腦炎病毒滅活疫苗。
以上5類疫苗均為乳白色穩(wěn)定乳劑，37℃保存35天，6000rpm離心15min，無水相析出；取清潔吸管吸取少許疫苗滴于清潔冷水表面，液滴呈云霧狀擴(kuò)散；
水包油保水型新城疫病毒滅活疫苗注射21日齡SPF雞，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型傳染性法氏囊病毒滅活疫苗注射1日齡SPF雞，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型豬圓環(huán)病毒滅活疫苗免疫4周齡仔豬，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型豬乙型腦炎病毒滅活疫苗免疫6-7月齡種豬，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
實(shí)施例4
一種水包油包水型疫苗佐劑，由以下成分組成：聚乙烯吡咯烷酮4.5g，聚乙二醇單油酸酯4.8g，單硬脂酸甘油酯3.3g，聚乙二醇雙油酸酯2.9g，白油VACCUTE-L 83g，1,2-丙二醇0.7g，司班80 0.8g。
上述各成分按順序依次混勻，制備得到穩(wěn)定的水包油包水型疫苗佐劑。將上述佐劑平均分為5份，分別制備得到水包油包水型新城疫滅活疫苗、水包油包水型傳染性法氏囊病毒滅活疫苗、水包油包水型豬圓環(huán)病毒滅活疫苗、水包油包水型豬乙型腦炎病毒滅活疫苗。
以上5類疫苗均為乳白色穩(wěn)定乳劑，37℃保存35天，6000rpm離心15min，無水相析出；取清潔吸管吸取少許疫苗滴于清潔冷水表面，液滴呈云霧狀擴(kuò)散；
水包油保水型新城疫病毒滅活疫苗注射21日齡SPF雞，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型傳染性法氏囊病毒滅活疫苗注射1日齡SPF雞，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型豬圓環(huán)病毒滅活疫苗免疫4周齡仔豬，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型豬乙型腦炎病毒滅活疫苗免疫6-7月齡種豬，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
實(shí)施例5
一種水包油包水型疫苗佐劑，由以下成分組成：聚乙烯吡咯烷酮2.94g，聚乙二醇單油酸酯3.6g，單硬脂酸甘油酯2.03g，聚乙二醇雙油酸酯2.33g，白油VACCUTE-L 87g，1,2-丙二醇0.9g，葡萄糖甘氨酸1.2g。
上述各成分按順序依次混勻，制備得到穩(wěn)定的水包油包水型疫苗佐劑。將上述佐劑平均分為5份，分別制備得到水包油包水型新城疫滅活疫苗、水包油包水型傳染性法氏囊病毒滅活疫苗、水包油包水型豬圓環(huán)病毒滅活疫苗、水包油包水型豬乙型腦炎病毒滅活疫苗。
以上5類疫苗均為乳白色穩(wěn)定乳劑，37℃保存35天，6000rpm離心15min，無水相析出；取清潔吸管吸取少許疫苗滴于清潔冷水表面，液滴呈云霧狀擴(kuò)散；
水包油保水型新城疫病毒滅活疫苗注射21日齡SPF雞，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型傳染性法氏囊病毒滅活疫苗注射1日齡SPF雞，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型豬圓環(huán)病毒滅活疫苗免疫4周齡仔豬，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
水包油包水型豬乙型腦炎病毒滅活疫苗免疫6-7月齡種豬，易注射，一周即可產(chǎn)生抗體，2-3周抗體達(dá)到高峰，免疫持續(xù)期長，不易產(chǎn)生副反應(yīng)，成本低廉。
實(shí)施例6
一種水包油包水型疫苗佐劑，由以下成分組成：親水復(fù)合表面活性劑0.7～1.2％、親油復(fù)合表面活性劑0.9～1.5％、礦物油55～75％；同時(shí)，所述水包油包水型疫苗佐劑還包括以下濃度的成分：穩(wěn)定劑6～9g/L、添加劑2～5g/L，水余量。
在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
所述親水復(fù)合表面活性劑選自以下成分的一種或幾種：月桂基葡糖苷、聚乙烯吡咯烷酮PVP-K30、聚乙二醇單油酸酯。
所述親油復(fù)合表面活性劑選自以下成分的一種或幾種：脂肪酸甲酯、單硬脂酸甘油酯、聚乙二醇雙油酸酯。
所述親水復(fù)合表面活性劑與親油表面活性劑的質(zhì)量百分比為6:4。
所述礦物油是白油。
所述白油在水包油包水型疫苗佐劑中所占的質(zhì)量百分比為83～90％。
所述穩(wěn)定劑是1,2-丙二醇。
所述水包油包水型疫苗佐劑還包括濃度為0.2～0.3g/mL的黃氏多糖注射液或濃度為0.2～0.3g/mL的黃氏多糖粉水溶液。
一種上述水包油包水型疫苗佐劑用于制備疫苗的應(yīng)用，具體包括以下步驟：將滅活的抗原液與所述水包油包水型疫苗佐劑混合，而后以16000～19000rpm的剪切速度乳化4～7min，即得到所述疫苗；其中所述抗原液是新城疫病毒液、傳染性法氏囊病毒液、豬圓環(huán)病毒液或豬乙型腦炎病毒液。
以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。