本發(fā)明涉及一種水溶性銀杏外種皮提取物及其制劑的制備方法，屬于中藥制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
銀杏是我國(guó)的珍貴樹(shù)種，也是江蘇省農(nóng)業(yè)創(chuàng)匯的重要植物資源。為了更好地開(kāi)發(fā)利用銀杏資源，我們課題組最早從銀杏的外種皮中提取具有抗腫瘤作用及用途的多糖類(lèi)提取物，已經(jīng)取得了一系列研究成果。然而，由于水溶性的問(wèn)題，使銀杏外種皮提取物的劑型選擇受到了一定限制。我們?cè)趥鹘y(tǒng)工藝（ZL00134363.7）的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后的工藝（ZL201010251068.9）雖然水溶性提高了，但工藝繁瑣，制備時(shí)間較長(zhǎng)，增加了成本。以改進(jìn)水溶性為主要目標(biāo)的工藝優(yōu)化一直是本課題組的研究重點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種水溶性銀杏外種皮提取物及其制劑的制備方法。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種水溶性銀杏外種皮提取物的制備方法，包括以下步驟：
將被乙醇浸泡過(guò)的銀杏外種皮置于煮提鍋中常規(guī)加水煎煮 2 - 3 次并分別過(guò)濾，將濾液合并減壓濃縮至比重在1.21-1.30；按溶液與容器以0.05-0.15（V/V）的比例將濃縮液轉(zhuǎn)移至容器中，將容器置于磁力攪拌器的基座上，將乙醇緩慢滴加入濃縮液中，使乙醇終濃度在1.5-2.5h達(dá)到60-80%（V/V），在加入乙醇的同時(shí)開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，在20-30℃下以1400-1800rpm/min攪拌，靜置后將沉淀物再用高濃度乙醇洗滌數(shù)次后冷凍干燥或真空干燥，得到水溶性銀杏外種皮提取物。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種水溶性銀杏外種皮提取物制劑的制備方法，將上述方法制備的水溶性銀杏外種皮提取物加入賦型劑或矯味劑和防腐劑制成抗腫瘤膠囊制劑、片劑或口服液制劑。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明采用連續(xù)磁力攪拌的方式將乙醇與濃縮液充分混勻，避免了手動(dòng)攪拌混合不均的現(xiàn)象，從而得到粒徑小、水溶性好、有效部位含量和抗腫瘤效價(jià)強(qiáng)度皆較高的銀杏外種皮提取物。該方法設(shè)計(jì)科學(xué)可行，工序簡(jiǎn)單可控，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。所得水溶性銀杏外種皮提取物可制成膠囊、片劑和口服液制劑。
1、水溶性的測(cè)定
銀杏外種皮粗提物在1.5%（W/V）濃度下肉眼觀(guān)察完全溶解于水，而水溶性銀杏外種皮提取物在3.0%（W/V）濃度下肉眼觀(guān)察完全溶解于水，提示該方法制得的銀杏外種皮提取物水溶性提高。
2、肽多糖含量的測(cè)定
采用苯酚硫酸法測(cè)多糖含量：精密稱(chēng)取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，用蒸餾水配成1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，再進(jìn)一步稀釋為不同濃度。精密量取濃度為30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、180μg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5ml于6支10ml具塞試管中，加入50mg/ml的重蒸酚溶液1ml，混合均勻后，加入5ml濃硫酸，混合均勻，沸水浴15min，冷水浴30min。用紫外分光光度計(jì)于490nm處測(cè)定吸光度，對(duì)葡萄糖溶液濃度和吸光度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，建立回歸方程。取供試品溶液0.5ml，按上述操作測(cè)吸光度值，代入回歸方程，計(jì)算出多糖含量。
采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量：精密稱(chēng)取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品適量，用蒸餾水配成100μg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，再進(jìn)一步稀釋為不同濃度。精密量取濃度為20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5ml分別于5支10ml具塞試管，再加入2.5ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻后，放置5～10min，待其充分反應(yīng)后，用紫外分光光度計(jì)于595nm處測(cè)定吸光度，對(duì)牛血清白蛋白溶液濃度和吸光度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，建立回歸方程。取供試品溶液0.5ml，按上述操作測(cè)吸光度值，代入回歸方程，計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。
采用紅外光譜分析儀進(jìn)行定性分析。結(jié)果顯示銀杏外種皮提取物含酰胺鍵，提示為肽多糖。肽多糖含量%=(多糖含量+蛋白質(zhì)含量)%。
采用該方法制備的銀杏外種皮粗提物其多糖含量為36%、蛋白質(zhì)含量為28%，所以肽多糖含量為36%+28%=64%。而水溶性銀杏外種皮提取物其多糖含量為45%、蛋白質(zhì)含量為31%，所以肽多糖含量為45%+31%=76%，提示水溶性銀杏外種皮提取物抗腫瘤有效部位含量增加。
3、粒徑測(cè)定
精密稱(chēng)取銀杏外種皮粗提物和水溶性銀杏外種皮提取物各2.5mg，分別溶于蒸餾水，定容至50 ml，得到濃度為50 μg/mL的GBEP水溶液。取該水溶液置于具塞試管中，超聲20min后，采用馬爾文激光粒度儀，測(cè)定粒徑。結(jié)果顯示，銀杏外種皮粗提物的粒徑為1.5-2.0μm，而采用該方法制得的水溶性銀杏外種皮提取物粒徑為150-200nm。
4、ζ電位測(cè)定
精密稱(chēng)取銀杏外種皮粗提物和水溶性銀杏外種皮提取物各2.5mg，分別溶于蒸餾水，定容至50 ml，得到濃度為50 μg/mL的GBEP水溶液。取該水溶液置于具塞試管中，超聲20min后，采用馬爾文激光粒度儀，測(cè)定ζ電位。結(jié)果顯示，銀杏外種皮粗提物ζ電位為(-14)-(-11) mV，而采用該方法制得的水溶性銀杏外種皮提取物ζ電位為(-27)-(-25) mV，提示水溶性銀杏外種皮提取物水溶液更穩(wěn)定。
5、藥效研究
取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞，用胰蛋白酶消化、Hank’s液洗滌后，用含10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞至1×105/ml。向96孔培養(yǎng)板各孔中分別加入上述細(xì)胞懸液100μl，在5%CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入用含10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液配制的不同濃度的樣品各 100μl，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h加入MTT（終濃度5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液，加入酸化異丙醇，振蕩10min，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定各孔的OD值。按公式“抑制率=(1-藥物孔OD值/對(duì)照孔OD值)×100%”，計(jì)算體外對(duì)H22細(xì)胞增殖的抑制率。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 銀杏外種皮提取物對(duì)H22肝癌細(xì)胞的抑制作用
表1結(jié)果顯示，銀杏外種皮提取物在10-320μg/ml劑量下對(duì)肝癌細(xì)胞具有直接抑制作用，隨著劑量增加，其抑制作用也逐漸增強(qiáng)。而且，磁力攪拌所得水溶性銀杏外種皮提取物的半數(shù)抑制濃度IC50（μg/ml）顯著低于手動(dòng)攪拌所得的銀杏外種皮提取物，說(shuō)明效價(jià)強(qiáng)度更高。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
取被乙醇浸泡過(guò)的干銀杏外種皮50克，加水800克，置于煮提鍋中于98℃煎煮，每次1小時(shí)，共煎煮2次。將煎煮液合并，于70℃減壓濃縮至比重為1.21，按0.05V/V的比例將濃縮液轉(zhuǎn)移至容器中，將容器置于磁力攪拌器的基座上，將乙醇緩慢滴加入濃縮液中，使乙醇終濃度在1.5h達(dá)到80%（V/V），在加入乙醇的同時(shí)開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，在20℃下1800rpm/min攪拌，靜置12小時(shí)后將沉淀物離心甩干，再用高濃度乙醇（體積濃度98%以上）洗滌2次后冷凍干燥，得到水溶性銀杏外種皮提取物。制得的水溶性銀杏外種皮提取物在3.0%（W/V）濃度下肉眼觀(guān)察完全溶解于水，采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別檢測(cè)其多糖及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果分別為45%及31%，肽多糖總含量為76%，粒徑為121.4nm，ζ電位為-25.9mV。采用MTT法體外檢測(cè)對(duì)H22細(xì)胞增殖的影響，接種細(xì)胞24h后加入不同濃度的水溶性銀杏外種皮提取物，繼續(xù)培養(yǎng)48h檢測(cè)。結(jié)果顯示，水溶性銀杏外種皮提取物終濃度在320μg/ml，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制H22肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，且隨著劑量增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，抑制率（%）分別為78，73，61，48，36及23，半數(shù)抑制濃度IC50（μg/ml）為84.5。取水溶性銀杏外種皮提取物干粉100g，加入賦型劑50g，拌勻，按每粒150mg裝入空心膠囊，制成水溶性銀杏外種皮提取物膠囊制劑。
實(shí)施例2
取被乙醇浸泡過(guò)的干銀杏外種皮100克，加水2000克，置于煮提鍋中于95℃煎煮，每次1小時(shí)，共煎煮3次。將煎煮液合并，于70℃減壓濃縮至比重為1.26，按0.15V/V的比例將濃縮液轉(zhuǎn)移至容器中，將容器置于磁力攪拌器的基座上，將乙醇緩慢滴加入濃縮液中，使乙醇終濃度在2.5h達(dá)到60%（V/V），在加入乙醇的同時(shí)開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，在30℃下以1400rpm/min攪拌，靜置24小時(shí)后將沉淀物離心甩干，再用高濃度乙醇洗滌3次后冷凍干燥，得到水溶性銀杏外種皮提取物。制得的水溶性銀杏外種皮提取物在3.0%（W/V）濃度下肉眼觀(guān)察完全溶解于水，采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別檢測(cè)其多糖及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果分別為46%及23%，肽多糖總含量為69%，粒徑為143.6nm，ζ電位為-25.0mV。采用MTT法體外檢測(cè)對(duì)H22細(xì)胞增殖的影響，接種細(xì)胞24h后加入不同濃度的水溶性銀杏外種皮提取物，繼續(xù)培養(yǎng)48h檢測(cè)。結(jié)果顯示，水溶性銀杏外種皮提取物終濃度320μg/ml，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制H22肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，且隨著劑量增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，抑制率（%）分別為76，70，59，46，33及21，半數(shù)抑制濃度IC50（μg/ml）為99.6。取水溶性銀杏外種皮提取物干粉100g溶解于純凈水中，按藥物質(zhì)量要求加入適量矯味劑及防腐劑，搖勻，按10ml規(guī)格裝瓶，制成水溶性銀杏外種皮提取物口服液制劑。
實(shí)施例3
取被乙醇浸泡過(guò)的干銀杏外種皮80克，加水1500克，置于煮提鍋中于97℃煎煮，每次1小時(shí)，共煎煮2次。將煎煮液合并，于70℃減壓濃縮至比重為1.30，按0.11V/V的比例將濃縮液轉(zhuǎn)移至容器中，將容器置于磁力攪拌器的基座上，將乙醇緩慢滴加入濃縮液中，使乙醇終濃度在2.0h達(dá)到70%（V/V），在加入乙醇的同時(shí)開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，在25℃下以1600rpm/min攪拌，靜置16小時(shí)后將沉淀物離心甩干，再用高濃度乙醇洗滌2次后真空干燥，得到水溶性銀杏外種皮提取物。制得的水溶性銀杏外種皮提取物在3.0%（W/V）濃度下肉眼觀(guān)察完全溶解于水，采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別檢測(cè)其多糖及蛋白質(zhì)含量，結(jié)果分別為46%及25%，肽多糖總含量為71%，粒徑為133.4nm，ζ電位為-25.2mV。采用MTT法體外檢測(cè)對(duì)H22細(xì)胞增殖的影響，接種細(xì)胞24h后加入不同濃度的水溶性銀杏外種皮提取物，繼續(xù)培養(yǎng)48h檢測(cè)。結(jié)果顯示，水溶性銀杏外種皮提取物終濃度在320μg/ml，160μg/ml，80μg/ml，40μg/ml，20μg/ml，10μg/ml下可直接抑制H22肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，且隨著劑量增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，抑制率（%）分別為77，71，60，48，34及22，半數(shù)抑制濃度IC50（μg/ml）為92.0。取水溶性銀杏外種皮提取物干粉150g，加入賦型劑50克，拌勻，按每片 100mg 制成片劑，此即水溶性銀杏外種皮提取物片劑。