本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPARα）對肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1C（CPT1C）的直接調(diào)控作用在抗腫瘤中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1C（CPT1C）是一種催化脂肪酸進(jìn)行β-氧化初始階段的線粒體轉(zhuǎn)移酶，它在體內(nèi)的能量代謝，食物攝取，脂肪酸氧化功能等多方面發(fā)揮重要作用。近年來的新發(fā)現(xiàn)表明，CPT1C作為一個(gè)腫瘤細(xì)胞老化的新型調(diào)控因子，為腫瘤的診斷和治療提供了一個(gè)基于線粒體功能異常和細(xì)胞老化的潛在新靶點(diǎn)。

而過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPARα）是一種配體激活型轉(zhuǎn)錄因子，與人體內(nèi)的脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)與氧化過程的進(jìn)程密切相關(guān)。近年來相關(guān)PPARα與人類腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究日益增多，某些PPARα特異性配體被證明有抗腫瘤活性。但是關(guān)于PPARα是如何在抗腫瘤的過程中發(fā)揮作用的，還有待進(jìn)一步研究。

在現(xiàn)階段的研究中，有關(guān)PPARα和人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚未闡明，有報(bào)道顯示抑制PPARα的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腎癌細(xì)胞周期被阻止，促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡；PPARα激動(dòng)劑對胃癌細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。然而無論是通過分子生物學(xué)手段下調(diào)PPARα的表達(dá)或是使用其特異性抑制劑，都會(huì)使得腫瘤細(xì)胞的生長增殖受到抑制，并且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的衰老。那么究竟抑制PPARα是通過什么因子，如何產(chǎn)生的抗腫瘤效應(yīng)有待我們進(jìn)一步探索。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPARα）及肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1C（CPT1C）在抗腫瘤應(yīng)用中的缺陷和不足，提供PPARα對CPT1C的直接調(diào)控作用在抗腫瘤中的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的是用過以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明利用一系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工具，經(jīng)過大量的研究和探索，證明了PPARα對CPT1C的表達(dá)有著直接的調(diào)控作用，即PPARα可以通過直接結(jié)合在CPT1C的啟動(dòng)子區(qū)域激活其轉(zhuǎn)錄翻譯過程。

因此，以下應(yīng)用在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)：

過氧化物酶體增殖劑激活受體α在調(diào)控肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1C的表達(dá)方面的應(yīng)用。

過氧化物酶體增殖劑激活受體α在制備肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1C的表達(dá)調(diào)控制劑方面的應(yīng)用。

具體地，上述調(diào)控是指正調(diào)控。

另外，本發(fā)明進(jìn)一步利用BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、β-gal細(xì)胞衰老實(shí)驗(yàn)、腫瘤細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)等，證明了抑制PPARα的抗腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞老化作用是通過其對CPT1C的直接調(diào)控作用完成的。

綜上所述，結(jié)果表明抑制PPARα能通過其對CPT1C的調(diào)控作用起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞老化的作用，為臨床的抗腫瘤新靶點(diǎn)以及藥物研究提供了新的啟示，方法和手段。

因此，以下應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)：

過氧化物酶體增殖劑激活受體α或過氧化物酶體增殖劑激活受體α抑制劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1C或肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1C抑制劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

過氧化物酶體增殖劑激活受體α抑制劑和肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1C抑制劑聯(lián)用在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

其中，優(yōu)選地，所述腫瘤為人乳腺癌或人胰腺癌。

更優(yōu)選地，所述人乳腺癌為人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231。

更優(yōu)選地，所述人胰腺癌為人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：

（1）本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPARα）可以在mRNA和蛋白水平調(diào)控肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1C（CPT1C）的表達(dá)量，可以通過結(jié)合在CPT1C的啟動(dòng)子區(qū)域上直接激活其轉(zhuǎn)錄和翻譯；

（2）抑制PPARα進(jìn)而誘導(dǎo)肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1C（CPT1C）的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的衰老。

附圖說明

圖1為過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPARα）可以在mRNA和蛋白水平調(diào)控肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1C（CPT1C）的表達(dá)量；

圖2為過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPARα）可以通過結(jié)合在肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1C（CPT1C）的啟動(dòng)子區(qū)域上直接激活其轉(zhuǎn)錄和翻譯；

圖3為抑制過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPARα）表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力；

圖4為抑制過氧化物酶體增殖劑激活受體α（PPARα）表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的衰老；A～B為腫瘤細(xì)胞的集落能力，A中左圖為siControl，右圖為siRNA PPARα；B中左圖為pGST，右圖為pGST-PPARα；C～D為細(xì)胞β-gal活性，C為siControl，D為siRNA PPARα。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實(shí)施例1

1、實(shí)驗(yàn)材料

（1）實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1由廣州賽庫生物技術(shù)有限公司進(jìn)行細(xì)胞株品系鑒定。

（2）藥品和試劑：Pgst-PPARα表達(dá)質(zhì)粒（addgene），siRNA PPARα(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)，染色質(zhì)-免疫共沉淀ChIP試劑盒（Thermo），BrdU細(xì)胞增殖試劑盒（羅氏），β-gal細(xì)胞衰老染色試劑盒（碧云天），Trizol試劑、RT-PCR試劑盒、RT-qPCR試劑盒（Takara公司）；引物（上海Invitrogen 公司）；RIPA裂解液（上海博彩生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo公司）；PPARα一抗，CPT1C一抗，Ki67一抗、GAPDH一抗（abcam）和兔二抗（ Cell Signaling Technology 公司）；ECL發(fā)光液（北京英格恩生物科技公司）。

實(shí)驗(yàn)儀器：5417-R低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular device）；梯度PCR儀（德國Eppendorf公司）；7500 Real Time PCR System（美國Applied Biosystems公司），熒光倒置顯微鏡，雙熒光報(bào)告基因檢測系統(tǒng)，DNA-瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)。

2、實(shí)驗(yàn)方法

（1）細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)兩株腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行傳代。用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siRNA PPARα或Pgst-PPARα表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建低表達(dá)或者高表達(dá)PPARα的細(xì)胞株。

（2）按照Trizol試劑的說明書從培養(yǎng)細(xì)胞中得到總RNA；其次，按照RT-PCR試劑盒說明書得到cDNA；再按照RT-qPCR試劑盒說明書檢測PPARα，CPT1C的mRNA表達(dá)量。提取細(xì)胞總蛋白，western-blot檢測PPARα，CPT1C的蛋白表達(dá)量。

（3）構(gòu)建CPT1C不同長度啟動(dòng)子區(qū)域報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測PPARα對CPT1C是否有直接調(diào)控作用，并用染色質(zhì)-免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步確證。

（4）BrdU細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)證明PPARα的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞的增殖能力的影響。

（5）細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)和β-gal染色實(shí)驗(yàn)證明PPARα對腫瘤細(xì)胞的衰老進(jìn)程的影響。

（6）抑制PPARα進(jìn)而抑制CPT1C的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞增殖能力和腫瘤細(xì)胞的衰老進(jìn)程的影響。

3、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以mean±S.E.M.表示，采用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用unpaired Student’s t test進(jìn)行兩組間比較，P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）PPARα在mRNA和蛋白水平調(diào)控CPT1C的表達(dá)

如圖1所示，在上調(diào)或下調(diào)PPARα表達(dá)后，檢測CPT1C在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量，均會(huì)和PPARα表達(dá)呈現(xiàn)一致趨勢。

其中，圖A-D為上調(diào)或下調(diào)PPARα表達(dá)后，CPT1C mRNA水平的變化。圖E-H為為上調(diào)或下調(diào)PPARα表達(dá)后，CPT1C 蛋白水平的變化。（siRNA PPARα為小RNA干擾其表達(dá)，PGST-PPARα為其過表達(dá)質(zhì)粒，WY14643和GW6471 為特異性的PPARα誘導(dǎo)劑和抑制劑）

（2）PPARα直接調(diào)控CPT1C的轉(zhuǎn)錄活性

如圖2所示，PPARα可以激活不同長度CPT1C啟動(dòng)子區(qū)域的報(bào)告質(zhì)粒的熒光活性，說明PPARα對CPT1C有著轉(zhuǎn)錄水平的直接調(diào)控作用，即CPT1C是PPARα的下游靶基因之一。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了這一結(jié)果。

（3）抑制PPARα的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力

如圖3所示，BrdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)說明，下調(diào)PPARα表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的增殖能力降低，其細(xì)胞周期被阻滯。說明抑制PPARα的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力。

（4）抑制PPARα的表達(dá)有道腫瘤細(xì)胞衰老

如圖4所示，抑制PPARα表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的集落形成能力降低，β-gal活性升高，衰老分泌表型因子的表達(dá)升高。說明下調(diào)PPARα可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的衰老。