本發(fā)明屬于醫(yī)用鈦材料改性技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗植入機(jī)械破壞、力學(xué)性能可調(diào)的鈦種植體表面生物活性膜及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來(lái)各類生物醫(yī)學(xué)材料的研究應(yīng)用飛速發(fā)展。鈦及鈦合金憑借優(yōu)良的生物相容性能、耐腐蝕性等成為目前廣泛應(yīng)用于口腔科、骨科等專業(yè)領(lǐng)域的種植體材料。但是純鈦種植體存在生物惰性，骨結(jié)合能力仍有不足。進(jìn)行鈦種植體表面改性，優(yōu)化種植體表面性能，影響種植體周圍的生物學(xué)效應(yīng)，最終提升界面的骨結(jié)合能力，一直是近年來(lái)生物醫(yī)學(xué)材料的研究熱點(diǎn)之一。

鈦種植體表面改性涂層的構(gòu)建方法繁多，包括噴砂處理法、等離子噴涂法、微弧氧化法等。其中利用層層自組裝(layer-by-layer self assembly，LBL)技術(shù)制備聚電解質(zhì)多層膜(polyelectrolyte multilayer films,PEM)方法因簡(jiǎn)單易行、條件溫和、通用性強(qiáng)、組裝膜性能高度可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)獲得青睞。該技術(shù)利用聚電解質(zhì)分子間靜電相互作用，將基材于荷相反電荷的功能分子或納米粒子溶液中交替浸涂，即可實(shí)現(xiàn)構(gòu)建具有預(yù)期性能，如適宜表面化學(xué)、形貌、力學(xué)和降解性能、載治療藥物且具有預(yù)定釋放行為等的生物活性表面涂層。但在種植體的植入操作過(guò)程中，術(shù)者通常對(duì)種植體施加20～55Ncm扭矩，種植體表面與機(jī)體組織間存在機(jī)械摩擦力，易導(dǎo)致種植體表面涂層脫落。適宜的膜基結(jié)合強(qiáng)度是保證膜在植入時(shí)不受干擾或破壞，在植入后穩(wěn)定發(fā)揮功能的基本前提。目前膜-種植體間多通過(guò)離子鍵、氫鍵等連接，膜基結(jié)合力弱且不穩(wěn)定，需采用共價(jià)鍵或多重復(fù)合連接等來(lái)改善。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種抗植入機(jī)械破壞、力學(xué)性能可調(diào)的鈦種植體表面生物活性膜的制備方法，該制備方法工藝簡(jiǎn)潔，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

本發(fā)明的目的還在于提供利用上述制備方法獲得的抗植入機(jī)械破壞、力學(xué)性能可調(diào)的鈦種植體表面生物活性膜，該生物活性膜與鈦基底穩(wěn)定結(jié)合，抗植入機(jī)械破壞能力強(qiáng)，力學(xué)性能可調(diào)，能促骨結(jié)合。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供上述抗植入機(jī)械破壞、力學(xué)性能可調(diào)的鈦種植體表面生物活性膜在醫(yī)用鈦植入材料表面生物改性中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種抗植入機(jī)械破壞、力學(xué)性能可調(diào)的鈦種植體表面生物活性膜的制備方法，包括以下步驟：

(1)兒茶酚化脂多糖胺納米囊泡CNP制備

選取脂多糖胺溶于磷酸鹽緩沖液溶液中，配制脂多糖胺磷酸鹽納米囊泡NP溶液，在脂多糖胺磷酸鹽納米囊泡NP溶液中加入3,4-二羥基苯基丙酸和碳二亞胺，調(diào)節(jié)好反應(yīng)溶液的pH值進(jìn)行持續(xù)攪拌反應(yīng)，將反應(yīng)后溶液經(jīng)透析、凍干處理，獲得兒茶酚化脂多糖胺納米囊泡CNP固體；

(2)兒茶酚化透明質(zhì)酸CHA制備

避光條件下將透明質(zhì)酸溶于磷酸鹽緩沖液溶液中制得透明質(zhì)酸溶液，在透明質(zhì)酸溶液中加入碳二亞胺和多巴胺，調(diào)節(jié)好反應(yīng)溶液的pH值進(jìn)行持續(xù)攪拌反應(yīng)，將反應(yīng)后溶液經(jīng)透析、凍干處理，得兒茶酚化透明質(zhì)酸CHA固體；

(3)聚電解質(zhì)液配制

將步驟(1)中制得的兒茶酚化脂多糖胺納米囊泡CNP固體溶于Tris-HCl水溶液中，得兒茶酚化脂多糖胺納米囊泡CNP溶液，將步驟(2)中制得的兒茶酚化透明質(zhì)酸CHA固體溶于Tris-HCl水溶液中，得兒茶酚化透明質(zhì)酸CHA溶液，將脂多糖胺溶于氯化鈉水溶液中，得脂多糖胺納米囊泡NP溶液；

(4)聚電解質(zhì)膜的層層自組裝過(guò)程：

4.1引發(fā)層構(gòu)建：選取鈦種植體，完全浸入兒茶酚化脂多糖胺納米囊泡CNP溶液中浸泡后取出，再浸入Tris-HCl水溶液中浸泡后取出吹干，獲得Ti-CNP；

4.2陰離子層構(gòu)建：將步驟(4.1)獲得的Ti-CNP浸入兒茶酚化透明質(zhì)酸CHA溶液中浸泡后取出，再浸入Tris-HCl水溶液中浸泡后取出吹干，獲得Ti-CNP-CHA；

4.3陽(yáng)離子層構(gòu)建：將步驟(4.2)獲得的Ti-CNP-CHA完全浸入脂多糖胺納米囊泡NP溶液中浸泡后取出，再浸入氯化鈉水溶液中浸泡后取出吹干，獲得Ti-CNP-(CHA-NP)₁；

4.4鈦表面兒茶酚化聚電解質(zhì)膜的構(gòu)建：以步驟(4.2)和(4.3)步驟為一個(gè)循環(huán)，重復(fù)進(jìn)行多次，獲得抗植入機(jī)械破壞、力學(xué)性能可調(diào)的鈦種植體表面生物活性膜，該生物活性膜的結(jié)構(gòu)為Ti-CNP-(CHA/NP)_n，簡(jiǎn)稱為兒茶酚化聚電解質(zhì)多層膜cPEM，其中n為自然數(shù)。

本發(fā)明將生物活性PEM聚電解質(zhì)多層膜PEM兒茶酚化，利用兒茶酚基團(tuán)和鈦表面及膜內(nèi)形成配位鍵、氫鍵、共價(jià)鍵、離子鍵等各種連接，實(shí)現(xiàn)膜-鈦基表面的穩(wěn)定結(jié)合，調(diào)控膜的力學(xué)性能，最終達(dá)到促進(jìn)骨結(jié)合的目的。

在上述抗植入機(jī)械破壞、力學(xué)性能可調(diào)的鈦種植體表面生物活性膜的制備方法中：

步驟(1)中兒茶酚化脂多糖胺納米囊泡CNP，其中CNP是catechol functionalized lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes的簡(jiǎn)寫。

步驟(1)中脂多糖胺LPSA的來(lái)源，可參閱本發(fā)明申請(qǐng)人早期申報(bào)的專利一種脂多糖胺陽(yáng)離子聚合物及其制備方法和應(yīng)用，申請(qǐng)?zhí)枮?01210008056.2。

步驟(1)中和步驟(3)中的納米囊泡，其英文名稱為nanopolymersomes，可簡(jiǎn)稱NP。

步驟(1)中所述脂多糖胺和3,4-二羥基苯基丙酸的質(zhì)量比優(yōu)選為1:0.1～3，所述3,4-二羥基苯基丙酸和碳二亞胺的質(zhì)量比優(yōu)選為1:2～4。

步驟(1)中調(diào)節(jié)好反應(yīng)溶液的pH值持續(xù)攪拌反應(yīng)時(shí)，pH值優(yōu)選為4.5～7.5，反應(yīng)溫度優(yōu)選為4℃～室溫，反應(yīng)壓力優(yōu)選為常壓，持續(xù)攪拌反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為4～12h。

步驟(2)中兒茶酚化透明質(zhì)酸CHA，其中CHA是catechol functionalized hyaluronic acid的簡(jiǎn)稱。

步驟(2)中所述透明質(zhì)酸和碳二亞胺的質(zhì)量比優(yōu)選為2～4:1，所述透明質(zhì)酸和多巴胺的質(zhì)量比優(yōu)選為1:0.4～4。

步驟(2)中調(diào)節(jié)好反應(yīng)溶液的pH值持續(xù)攪拌反應(yīng)時(shí)，pH值優(yōu)選為4.5～7.5，反應(yīng)溫度優(yōu)選為4℃～室溫，反應(yīng)壓力優(yōu)選為常壓，持續(xù)攪拌反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為4～12h。

步驟(1)～(2)中透析采用透析袋，透析袋的截留分子量為3500Da，透析時(shí)間≥48h。

步驟(3)中兒茶酚化脂多糖胺納米囊泡CNP溶液、兒茶酚化透明質(zhì)酸CHA溶液和脂多糖胺納米囊泡溶液的濃度相同，其濃度范圍優(yōu)選為1～5mg/mL，更佳為1mg/mL。

步驟(4.1)中選取鈦種植體，完全浸入CNP溶液中浸泡5min以上(更佳為5～20min)后取出，再浸入Tris-HCl水溶液中浸泡5min以上(更佳為5～15min)后取出吹干。

步驟(4.2)中將步驟(1)獲得的Ti-CNP浸入CHA溶液中浸泡5min以上(更佳為5～20min)后取出，再浸入Tris-HCl水溶液中浸泡5min以上(更佳為5～15min)后取出吹干。

步驟(4.3)中將步驟(2)中獲得的Ti-CNP-CHA完全浸入脂多糖胺納米囊泡溶液中浸泡5min以上(更佳為5～20min)后取出，再浸入Tris-HCl水溶液中浸泡5min以上(更佳為5～15min)后取出吹干。

步驟(4.4)中以步驟(4.2)和(4.3)步驟為一個(gè)循環(huán)，重復(fù)進(jìn)行3次，獲得抗植入機(jī)械破壞、力學(xué)性能可調(diào)的鈦種植體表面生物活性膜，該生物活性膜的結(jié)構(gòu)為Ti-CNP-(CHA/NP)₃。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：采用上述制備方法制得的抗植入機(jī)械破壞、力學(xué)性能可調(diào)的鈦種植體表面生物活性膜。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：上述抗植入機(jī)械破壞、力學(xué)性能可調(diào)的鈦種植體表面生物活性膜在醫(yī)用鈦植入材料表面生物改性中的應(yīng)用。

本發(fā)明方法是通過(guò)氫鍵和配位鍵作用力在純鈦表面引入牢固結(jié)合的引發(fā)層—兒茶酚化脂多糖胺納米囊泡層。然后主要以靜電作用力、兒茶酚和氨基的化學(xué)反應(yīng)、氫鍵等為成膜驅(qū)動(dòng)力，通過(guò)陽(yáng)離子聚電解質(zhì)脂多糖胺納米囊泡和陰離子聚電解質(zhì)兒茶酚化透明質(zhì)酸的交替沉積制備兒茶酚化聚電解質(zhì)多層膜結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明對(duì)膜物理化學(xué)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行表征，模擬其在臨床種植體植入過(guò)程中抗機(jī)械破壞的能力及體外細(xì)胞生物學(xué)響應(yīng)。結(jié)果表明，該膜具有與鈦種植體結(jié)合穩(wěn)定(45mN)、模擬骨植入后鈦表面膜留存面積>80％、提升MSCs黏附增殖分化能力1倍以上、安全實(shí)用、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可單獨(dú)應(yīng)用或作為基因載體、藥物載體應(yīng)用于醫(yī)用鈦植入材料表面生物改性。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明將兒茶酚基團(tuán)成功接枝于脂多糖胺納米囊泡，利用兒茶酚化囊泡上的兒茶酚基團(tuán)與鈦表面形成類共價(jià)鍵結(jié)合，從而獲得結(jié)合穩(wěn)定、耐機(jī)械摩擦、具有較大比表面積、單層均勻鋪展的納米囊泡引發(fā)層；

(2)本發(fā)明聚電解質(zhì)膜結(jié)構(gòu)通過(guò)陰陽(yáng)離子交替浸漬的方式構(gòu)建，工藝簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用；

(3)本發(fā)明膜結(jié)構(gòu)內(nèi)所含CNP和脂多糖胺納米囊泡為中空納米結(jié)構(gòu)，可以在構(gòu)膜時(shí)單獨(dú)使用或攜帶基因、藥物等使用。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1中獲得兒茶酚化的脂多糖胺納米囊泡CNP的反應(yīng)示意圖；

圖2是實(shí)施例1中多巴胺的兒茶酚基團(tuán)接枝到透明質(zhì)酸合成CHA的反應(yīng)示意圖；

圖3是實(shí)施例1中脂多糖胺納米囊泡(A)、兒茶酚化脂多糖胺納米囊泡(B)透射電鏡圖；

圖4是實(shí)施例1中鈦表面cPEM組裝過(guò)程表面形貌的原子力顯微鏡觀察；其中A：鍍鈦芯片表面形貌；B：CNP引發(fā)層表面形貌；C：cPEM膜0.5個(gè)循環(huán)(Ti-CNP-CHA)時(shí)表面形貌；D：cPEM膜1個(gè)循環(huán)[Ti-CNP-(CHA/NP)₁]時(shí)表面形貌；E：cPEM膜2個(gè)循環(huán)[Ti-CNP-(CHA/NP)₂]時(shí)表面形貌；F：cPEM膜3個(gè)循環(huán)[Ti-CNP-(CHA/NP)₃]時(shí)表面形貌；

圖5是實(shí)施例1中MSCs細(xì)胞黏附cPEM和純鈦空白對(duì)照表面15min后黏附率對(duì)比，其中cPEM表面細(xì)胞15min黏附率為86％，空白對(duì)照組為50％；

圖6是實(shí)施例1中MSCs細(xì)胞在純鈦上培養(yǎng)1h時(shí)的激光共聚焦顯微鏡觀察圖像，MSCs細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白采用鬼筆環(huán)肽染色，其中(A)低倍(×100倍)，(B)高倍(×400倍)；

圖7是實(shí)施例1中MSCs細(xì)胞在cPEM上培養(yǎng)1h時(shí)的激光共聚焦顯微鏡觀察圖像，MSCs的肌動(dòng)蛋白采用鬼筆環(huán)肽染色，其中(A)低倍(×100倍)(B)高倍(×400倍)；

圖8是實(shí)施例2中模擬臨床植入時(shí)力學(xué)環(huán)境，將Ti-cPEM植入牛骨前(A)后(B)沿縱軸逐層掃描的激光共聚焦圖像；

圖9是實(shí)施例2中模擬臨床植入時(shí)力學(xué)環(huán)境，將Ti-cPEM植入牛骨前(A)后(B)的激光共聚焦掃描Ti-cPEM圖像；

圖10是實(shí)施例2中掃描電子顯微鏡觀察聚電解質(zhì)多層膜改性Ti前(A)后(B) 表面形貌，其中A：拋光鈦表面；B：Ti-CNP-(CHA/NP)₃；

圖11是實(shí)施例2中Ti-cPEM改性前后的鈦釘植入牛骨后表面形貌(掃描電鏡圖)，其中A：純鈦釘；B：Ti-cPEM釘；C：純鈦釘?shù)木植糠糯?，D:Ti-cPEM釘?shù)木植糠糯蟆?/p>

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體的實(shí)施方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于下列實(shí)施方式。

平均分子量為60K的透明質(zhì)酸為柳州盛強(qiáng)生物科技公司購(gòu)得。多巴胺(分子量153)為美國(guó)Sigma公司購(gòu)得。碳二亞胺(EDC)(分子量191)為美國(guó)Aladdin公司購(gòu)得。3,4-二羥基苯基丙酸(分子量182)為上海物競(jìng)公司購(gòu)得。鈦棒為醫(yī)用純鈦，英國(guó)Goodfellow公司購(gòu)得。鈦種植體型號(hào)023-6510，長(zhǎng)10mm，直徑4.8mm，購(gòu)于江蘇創(chuàng)英科技公司。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供的抗植入機(jī)械破壞的鈦種植體表面生物活性膜的制備方法，包括以下步驟：

(1)兒茶酚化脂多糖胺納米囊泡CNP(catechol functionalized lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes)固體制備

以碳二亞胺(EDC)為偶聯(lián)劑，通過(guò)脂多糖胺LPSA納米囊泡表面的伯胺基團(tuán)與3,4-二羥基苯基丙酸(DHPP)中羧基發(fā)生縮合反應(yīng)，獲得兒茶酚化的脂多糖胺納米囊泡CNP，反應(yīng)示意圖如圖1中所述。

具體步驟如下：

以申請(qǐng)人前期合成的脂多糖胺(lipopolysaccharide-amine，LPSA)(申請(qǐng)?zhí)?00910193876.1)為反應(yīng)原料，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)為溶劑，配制1mg/mL的脂多糖胺LPSA磷酸鹽納米囊泡(lipopolysaccharide-amine nanopolymersome，NP)溶液100mL，用1mol/L的NaOH和HCl調(diào)節(jié)溶液pH＝5.5，依次加入0.05g 3,4-二羥基苯基丙酸(3,4-dihydroxyphenyl propionic acid)和0.1g碳二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)，維持溶液pH＝5.5，常溫常壓下持續(xù)攪拌4h，將反應(yīng)后溶液轉(zhuǎn)移到透析袋(透析袋截留分子量為3500Da)透析48h，凍干機(jī)中凍干，獲得CNP固體；

脂多糖胺納米囊泡(圖3中A)、兒茶酚化脂多糖胺納米囊泡(圖3中B)透射電鏡圖如圖3中所示，從圖3中可以看出，脂多糖胺納米囊泡和CNP為中空納米結(jié)構(gòu)。

(2)兒茶酚化透明質(zhì)酸CHA(catechol functionalized hyaluronic acid)固體制備

利用透明質(zhì)酸HA的羧基與多巴胺DA的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)脫水生成酰胺鍵，使多巴胺的兒茶酚基團(tuán)接枝到透明質(zhì)酸合成CHA，反應(yīng)示意圖如圖2中所示。

具體步驟如下：

避光條件下將1g透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)溶解于100mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)(pH＝5.5，pH調(diào)節(jié)均使用1mol/L的NaOH和HCl)，依次加入0.50g碳二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)、0.45g多巴胺(dopamine，DA)，維持溶液pH＝5.5，常溫常壓下持續(xù)攪拌4h，將反應(yīng)后溶液轉(zhuǎn)移至透析袋(截留分子量3500Dalton)透析48h，轉(zhuǎn)移至凍干機(jī)內(nèi)凍干，獲得具備不同兒茶酚接枝率的CHA固體，室溫密閉保存。

(3)聚電解質(zhì)液配制

分別配制下面的溶液：

配制含0.15mol/L NaCl的去離子水溶液；

配制含10mmol/L Tris-HCl的去離子水溶液；

以含0.15mol/L NaCl的去離子水為溶劑，配制1mg/mL脂多糖胺納米囊泡溶液；

以含10mmol/L Tris-HCl的去離子水為溶劑，配制1mg/mL CHA溶液；

以含10mmol/L Tris-HCl的去離子水為溶劑，配制1mg/mL CNP溶液。

(4)聚電解質(zhì)膜的層層自組裝過(guò)程：

4.1引發(fā)層構(gòu)建

首先將鈦種植體完全浸入CNP溶液10min，在鈦表面通過(guò)配位鍵和氫鍵作用形成CNP陽(yáng)離子引發(fā)層，然后小心取出鈦片浸入清洗液10mmol/L Tris-HCl溶液，浸泡5min取出，氮?dú)獯蹈?，獲得Ti-CNP；

其中，鈦種植體為鈦片，鈦片是將鈦棒(鈦棒為醫(yī)用純鈦，英國(guó)Goodfellow公司購(gòu)得)切割為直徑10mm、厚2mm的圓形鈦片，依次使用500、1000、1500、2000目砂紙逐級(jí)打磨拋光。丙酮、無(wú)水乙醇、去離子水依次超聲清洗15min，氮?dú)獯蹈?，高溫滅菌備用?/p>

4.2陰離子層構(gòu)建

將Ti-CNP片浸入CHA溶液10min取出，使鈦表面形成CHA陰離子層，然后再浸入清洗液10mmol/L Tris-HCl溶液，浸泡5min取出，氮?dú)獯蹈桑@得Ti-CNP-CHA。

4.3陽(yáng)離子層構(gòu)建

將Ti-CNP-CHA完全浸入脂多糖胺納米囊泡溶液10min，在鈦表面形成脂多糖胺納米囊泡陽(yáng)離子層，使用清洗液0.15mol/L的NaCl溶液浸泡5min，氮?dú)獯蹈?，獲得Ti-CNP-(CHA-NP)₁，其中“1”表示鈦片依次浸泡在CHA和NP溶液中形成的1個(gè)循環(huán)。

4.4鈦表面兒茶酚化聚電解質(zhì)膜的構(gòu)建

以步驟(4.2)和步驟(4.3)為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行3循環(huán)，獲得鈦表面兒茶酚化聚電解質(zhì)膜，構(gòu)建的膜表達(dá)式定義為Ti-CNP-(CHA/NP)₃，簡(jiǎn)化為Ti-cPEM。

采用上述獲得的Ti-cPEM進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如下：

每組取試件5個(gè)，臨界點(diǎn)干燥，利用激光共聚焦儀測(cè)量試件表面粗糙度Ra值，每個(gè)試件任取4個(gè)測(cè)試點(diǎn)，結(jié)果為136±30nm。

利用壓痕劃痕儀進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，測(cè)量試件表面聚電解質(zhì)膜與鈦基底間結(jié)合能力，實(shí)驗(yàn)中使用Berkovich劃痕壓頭(規(guī)格半徑≤20nm，角度35.26°)，每個(gè)試件任取4個(gè)測(cè)試點(diǎn)，結(jié)果44.99±12.5mN。

Ti-cPEM膜表面形貌觀察：

鈦表面cPEM組裝過(guò)程表面形貌的原子力顯微鏡觀察如圖4中所示，其中A：鍍鈦芯片表面形貌；B：CNP引發(fā)層表面形貌，CNP均勻散在分布，顆粒大小均一，呈類球形；C：cPEM膜0.5循環(huán)(Ti-CNP-CHA)時(shí)表面形貌；D：cPEM膜1個(gè)循環(huán)[Ti-CNP-(CHA/NP)₁]時(shí)表面形貌；E：cPEM膜2循環(huán)[Ti-CNP-(CHA/NP)₂]時(shí)表面形貌；F：cPEM膜3個(gè)循環(huán)[Ti-CNP-(CHA/NP)₃]時(shí)表面形貌。C～F可見(jiàn)膜表面粒子逐漸聚集、連接成片。

利用原子力顯微鏡觀察在鍍鈦芯片(QCM用)表面組裝過(guò)程中聚電解質(zhì)膜cPEM形貌變化，可見(jiàn)組裝引發(fā)層CNP后，表面吸附一層均勻、散在分布的類球形納米粒子。進(jìn)一步組裝透明質(zhì)酸后，表面變化不明顯，局部可見(jiàn)較大直徑的納米顆粒聚集。組裝第1個(gè)循環(huán)后(圖D)，芯片表面形貌出現(xiàn)顯著變化，納米顆粒聚集，聚集體直徑大于5μm，芯片表面膜覆蓋率接近50％，隨著組裝層數(shù)的增加，納米粒子進(jìn)一步增加，并逐漸連接成片，覆蓋芯片表面，局部可見(jiàn)致密大聚集體。

采用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠MSCs，MSCs細(xì)胞傳至第三代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以純鈦為空白對(duì)照組。檢測(cè)細(xì)胞15min黏附率。結(jié)果如圖5所示，顯示cPEM表面細(xì)胞15min黏附率達(dá)86％，空白對(duì)照組僅為50％。

利用激光共聚焦顯微鏡觀察MSCs細(xì)胞黏附1h時(shí)的肌動(dòng)蛋白微絲鋪展情況如圖6-7所示。其中圖6-圖7中A圖為低倍(×100倍)、B圖為高倍(×400倍)，由圖6中可見(jiàn)，純鈦表面細(xì)胞未完全伸展，胞體內(nèi)微絲不清晰，由圖7可見(jiàn)cPEM組試件表面細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞輪廓清晰，微絲豐富，可見(jiàn)絲狀偽足向試件表面鋪展。

檢測(cè)表面MSCs細(xì)胞24h增殖能力顯示MSCs增殖分化能力提升100％。對(duì)MSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)7d時(shí)MSCs細(xì)胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性提升140％，21d細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)量增加104％。

實(shí)施例2

與實(shí)施例1不同的是，實(shí)施例2膜構(gòu)建是在鈦種植體上制備，鈦種植體型號(hào)023-6510，長(zhǎng)10mm，直徑4.8mm，購(gòu)于江蘇創(chuàng)英科技公司。

將實(shí)施例1中的脂多糖胺納米囊泡溶液更換成綠色熒光標(biāo)記的脂多糖胺納米囊泡溶液，按實(shí)施例1的步驟在鈦種植體表面構(gòu)建綠色熒光標(biāo)記的兒茶酚化聚電解質(zhì)膜，然后進(jìn)行如下試驗(yàn)。

其中綠色熒光標(biāo)記的脂多糖胺納米囊泡溶液的制備方法如下：

以含0.15mol/L NaCl的去離子水為溶劑，配制1mg/mL綠色熒光標(biāo)記的脂多糖胺納米囊泡溶液，其中綠色熒光標(biāo)記的脂多糖胺納米囊泡制備步驟如下：

分別配制1mg/mL脂多糖胺納米囊泡/水溶液、2mg/mL異硫氰酸熒光素FITC/0.1mol/L硼酸鹽緩沖液溶液(pH8.5)，然后將2種溶液等體積混合，室溫下避光攪拌反應(yīng)，4小時(shí)后停止反應(yīng)，將反應(yīng)混合物用透析袋(截留分子量3500Dalton)透析24小時(shí)，再過(guò)濾、凍干即得綠色熒光標(biāo)記的脂多糖胺納米囊泡溶液。注意，凡是與FITC有關(guān)的操作均應(yīng)避光。

膜抗植入機(jī)械破壞的臨床模擬實(shí)驗(yàn)。牛肋骨去除肋骨表面軟組織，選擇總厚度>1cm，骨皮質(zhì)1～2mm厚度，含松質(zhì)骨部分作為植入點(diǎn)。麻花鉆22#1500r/min打孔10mm深，后逐級(jí)更換為28#、35#、42#擴(kuò)孔至孔徑4.2mm。使用42#麻花鉆進(jìn)一步擴(kuò)大骨皮質(zhì)部分至約4.8mm。取下麻花鉆，更換為連接攜帶器及種植體，按照30Nm扭矩植入種植體。植入深度達(dá)10mm停止植入，靜置1min，緩慢旋出，浸泡在1ml生理鹽水中洗去表面殘?jiān)?，置于EP管4度避光保存。300μL生理鹽水沖洗種植窩，收集沖洗后的生理鹽水4度保存，以供后續(xù)檢測(cè)。將試驗(yàn)后種植體進(jìn)行激光共聚焦掃描，對(duì)比植入前后種植體表面綠色熒光強(qiáng)度及范圍，觀察膜是否被破環(huán)。

結(jié)果如圖8-9所示，圖8是模擬臨床植入力學(xué)環(huán)境，將Ti-cPEM鈦釘植入牛骨前(A)后(B)的激光共聚焦逐層掃描照片(沿鈦釘縱軸掃描)，圖8中可見(jiàn)，植入前Ti-cPEM釘各層面熒光顯色完整，膜覆蓋均勻；植入后各層面熒光大面積存留，局部有少量脫色。

圖9是模擬臨床植入力學(xué)環(huán)境，將Ti-cPEM鈦釘植入牛骨前(A)后(B)底面激光共聚焦掃描照片。由圖9中可見(jiàn)，植入前Ti-cPEM釘?shù)酌婺訜晒怙@色完整，膜覆蓋較均勻，植入后大部分膜層存留，僅有少量局部剝脫。說(shuō)明兒茶酚化的cPEM改性膜與鈦基底結(jié)合牢固，基本能耐受臨床植入時(shí)的機(jī)械破壞，為植入后改性膜發(fā)揮其生物活性提供了必要條件。

圖10是鈦改性前后表面掃描電鏡照片，其中A圖為拋光鈦表面；B圖為Ti-CNP-(CHA/NP)₃(其中CNP中氨基、CHA中羧基被兒茶酚取代的摩爾百分比分別為40％、30％，與實(shí)施例1中相同)。由圖8中可見(jiàn)，拋光鈦表面較粗糙，拋光劃痕可見(jiàn)，而組裝聚電解質(zhì)多層膜后，樣品表面變得更光滑，且質(zhì)地均一。

圖11是cPEM改性前后的鈦釘植入牛骨后表面形貌(掃描電鏡圖)。其中A：純鈦釘；B：Ti-cPEM釘；C：純鈦釘?shù)木植糠糯螅珼:Ti-cPEM釘?shù)木植糠糯?。A圖和B圖中可見(jiàn)，植入后的種植體表面粘附部分組織塊，局部可見(jiàn)種植體表面劃痕，cPEM覆膜種植體表面粘附組織塊稍多于純鈦表面；C圖可見(jiàn)純鈦種植體表面劃痕清晰，D圖可見(jiàn)聚電解質(zhì)膜覆蓋大部分表面，膜脫落較少，劃痕較輕微，劃痕印跡模糊。

實(shí)施例3

鈦表面兒茶酚化聚電解質(zhì)生物活性膜的制備如下：

(1)兒茶酚化脂多糖胺納米囊泡CNP固體制備

以申請(qǐng)人前期合成的脂多糖胺(lipopolysaccharide-amine，LPSA)(申請(qǐng)?zhí)?00910193876.1)為反應(yīng)原料，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)為溶劑，配制1mg/mL的脂多糖胺磷酸鹽納米囊(NP)溶液100mL，使用1mol/L的NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH至4.75，依次加入0.1g 3,4-二羥基苯基丙酸(3,4-dihydroxyphenyl propionic acid)和0.2g碳二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)，維持溶液pH＝4.75，4℃常壓持續(xù)攪拌12h，將反應(yīng)后溶液轉(zhuǎn)移到透析袋(截留分子量3500Dalton)透析48h，凍干機(jī)中凍干，獲得兒茶酚取代度為56％(接枝率)的兒茶酚化脂多糖胺納米囊泡CNP固體。

(2)CHA固體制備

將1g透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)溶解于100mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)(pH＝5.5，pH調(diào)節(jié)均使用1mol/L的NaOH和HCl)，依次加入0.50g碳二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)、0.92g多巴胺(dopamine)，維持溶液pH＝5.5，4℃常壓下持續(xù)攪拌12h，然后將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移至透析袋(截留分子量3500Dalton)透析48h、再轉(zhuǎn)移至凍干機(jī)內(nèi)凍干，獲得兒茶酚接枝率為19％的cHA固體，室溫密閉保存。

后續(xù)(3)、(4)、(5)步驟同實(shí)施例1，獲得兒茶酚化聚電解質(zhì)多層膜改性鈦種植體后，繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞及牛骨植入實(shí)驗(yàn)等，結(jié)果類似實(shí)施例1。

上面列舉一部分具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，有必要在此指出的是上下具體實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，不代表對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明作出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。