本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種茶葉多肽在制備抗II型糖尿病藥物或保健品中的應用。

背景技術：

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)已經(jīng)是世界上最常見的非傳染性疾病之一。其中全球已被診斷的糖尿病成人患者中，90％是II型糖尿病(Type 2Diabetes mellitus,T2D)。在中國T2D同樣占了總病人的95％。

目前常見的治療II型糖尿病的藥物有以下幾種：1、磺脲類藥物：是II型糖尿病的主要口服降糖藥物，是通過與β-細胞表面特異受體的相互作用刺激胰島素分泌而起作用的。2、雙胍類：作用機制為抑制肝糖元異生，減少葡萄糖的來源，增強組織對葡萄糖的攝取和利用，增強胰島素敏感性，抑制胰高血糖素的釋放。降糖作用肯定，不誘發(fā)低血糖，具有降糖作用以外的心血管保護作用，如調(diào)脂、抗小血板凝集等。3、糖苷酶抑制劑：通過抑制小腸粘膜上皮細胞表面的糖苷酶，延緩碳水化合物的吸收，從而降低餐后血糖。4、噻唑烷二酮：為胰島素增敏劑，通過增加外周組織對胰島素的敏感性、改善胰島素抵抗而降低血糖，并能改善與胰島素低抗有關的多種心血管危險因素。5、甲基甲胺苯甲酸衍生物：非磺脲類胰島素促分泌劑，起效快、作用時間短。

其中一種治療II型糖尿病的方法是通過抑制二肽基肽酶-IV(Dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV)來增強胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)。GLP-1是一種具有30個氨基酸的腸降血糖素，具有促進胰島素分泌和生物合成，抑制胰高血糖素的分泌，促進胰島細胞增殖，抑制胰島細胞凋亡，保存細胞對血糖的敏感性等多種生理功能。DPP-IV是DPP家族的一員(Dipeptidyl peptidases,DPPs)，廣泛分布于小腸、肝臟和腎臟等上皮組織的細胞膜中。最初它被定義為絲氨酸水解酶，但是后來的研究發(fā)現(xiàn)，DPP-IV可以水解許多不同的功能性多肽，其中最主要的就是GLP-1。由小腸L-細胞分泌的GLP-1有75％在運輸?shù)礁闻K的過程當中被DPP-IV所降解。故在血糖控制當中，對DPP-IV的抑制可以減少GLP-1的降解，從而達到治療T2D的作用。由于治療T2D常見藥物(西格列汀)具有一定的副作用，如低血糖，體重增加和胃腸道功能紊亂等，因此，沒有副作用，但相對低療效的膳食療法已成為治療糖尿病的替代療法之一。

茶樹，原名：茶，拉丁文名：Camellia sinensis(L.)O.Ktze.，山茶科、山茶屬灌木或小喬木，嫩枝無毛。葉革質(zhì)，長圓形或橢圓形。分布主要集中在南緯16度至北緯30度之間，茶樹喜歡溫暖濕潤氣候，平均氣溫10℃以上時芽開始萌動，生長最適溫度為20～25℃；年降水量要在1000毫米以上；喜光耐陰，適于在漫射光下生育；一生分為幼苗期、幼年期、成年期和衰老期。其葉子可以制茶，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、消炎、解毒、抗過敏、降血脂、降血糖等保健功效。國內(nèi)外大量研究表明，各種茶葉茶多糖都有顯著或極顯著的降血糖效果。還有一種認為主要是茶多酚起作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種如SEQ ID NO.1所示的茶葉多肽的新用途，即在制備抗II型糖尿病藥物或保健品中的應用。

茶葉多肽或其前體肽在制備治療和/或預防II型糖尿病的藥物中的應用，所述茶葉多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明從茶葉中分離出的多肽序列在申請?zhí)枮?01310508621.6的專利文獻已有公開，該文獻公開了一種源于油菜花粉的具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)活性的多肽化合物AGFAGDDAPR，其氨基酸序列分別為Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg。多肽AGFAGDDAPR具有ACE抑制活性，作為高血壓、心臟病和心血管病的保健品和藥物先導化合物具有良好的應用前景。雖然該多肽與本發(fā)明從茶葉中分離出的多肽的氨基酸序列相同，但本發(fā)明涉及的AGFAGDDAPR在治療糖尿病中的用途是首次公開。

本發(fā)明涉及的茶葉多肽的氨基酸序列為Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg，單鏈線性結(jié)構(gòu)，分子量為976.01Da。研究發(fā)現(xiàn)，該茶葉多肽對DPP-IV活性具有強的抑制作用，采用底物發(fā)色法對DPP-IV抑制效果進行測定，選用Gly-Pro p-nitroanilide作為底物，其中底物濃度為0.29mmol/L，DPP-IV濃度為1.9U/L，茶葉多肽AGFAGDDAPR的IC₅₀為326.25±1.08umol/L。在單次口服糖耐量實驗中，茶葉多肽能夠降低小鼠的血糖水平和AUC120min值，達到了顯著差異，顯示出其在控制血糖方面的潛力。

多肽本身是人體內(nèi)源性物質(zhì)，通過參與、介入、促進或抑制人體內(nèi)生理生化過程而發(fā)揮作用，副作用低，藥效高，針對性強，不會蓄積于體內(nèi)而引起中毒。

多肽藥物往往半衰期短，體內(nèi)易破壞而作用時間短。為了提高多肽的水溶性、穩(wěn)定性、生物膜滲透性，對茶葉多肽進行功能修飾制得前體多肽。

由于多肽類藥物在胃腸道極易被蛋白質(zhì)酶水解，口服的生物利用度很低，因此優(yōu)選的給藥途徑為注射給藥或經(jīng)皮給藥。

茶葉多肽或其前體肽在制備治療和/或預防II型糖尿病的保健品中的應用，所述茶葉多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供了一種治療II型糖尿病的藥物組合物，包括有效量的SEQ ID NO.1所示的茶葉多肽或其前體肽和藥學上可接受的載體。主要活性成分為此茶葉多肽。

為了提高多肽類藥物的生物利用度，需要根據(jù)具體的給藥方式，選擇相應的藥物載體。藥物載體能夠有效地控制藥物在體內(nèi)的釋放。

優(yōu)選的方案，所述藥物載體為脂質(zhì)體，脂質(zhì)體是一種類似微型膠囊的劑型，可被生物降解且免疫原性小。將活性成分茶葉多肽或其前體肽包埋于磷脂雙分子層的脂質(zhì)體中，對藥物起到保護作用。

優(yōu)選的方案，所述藥物載體為傳遞體，傳遞體具有高變形能力，能夠高效穿透皮膚進入體循環(huán)。

所述藥物組合物的制劑形式為微球，將上述的茶葉多肽或其前體肽包裹在高分子材料中，制成微球。作為優(yōu)選，高分子材料為PLGA共聚高分子。

本發(fā)明還提供了一種茶葉多肽作為DPP-IV抑制劑的用途，所述茶葉多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明具備的有益效果：本發(fā)明提供的如SEQ ID NO.1所示的茶葉多肽被證明具有明顯抑制DPP-IV活性的效果，其在制備抗II型糖尿病藥物或保健品和制備DPP-IV抑制劑的應用中具有良好的潛力。

附圖說明

圖1為實施例1中小鼠口服糖耐量實驗各實驗組血糖水平的對比圖，圖中*表示與空白對照組顯著不同(P<0.05)，**表示與空白對照組極顯著不同(P<0.01)。

圖2為實施例1中小鼠口服糖耐量實驗不同處理下藥時曲線下面積比較圖，圖中*表示與空白對照組顯著不同(P<0.05)，**表示與空白對照組極顯著不同(P<0.01)，。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

1、不同茶類水提取物的效果測定：

將收集起來的龍井茶，湯記高山茶，云南紅茶，正山小種，大紅袍，鐵觀音，莫干黃芽，霍山黃芽以及普洱茶充分研磨成粉狀。準確稱取1g(±0.01g)茶粉溶解于75mL沸騰的超純水，沸水浴提取45min后抽濾，然后用超純水定容到100mL，使用前，凍存于-20℃。

對DPP-IV抑制效果的測定采用底物發(fā)色法，選取Gly-Pro p-nitroanilide作為底物，100mmol/L的HCl-Tris溶液作為緩沖液，定義一分鐘內(nèi)催化1umol底物所需要的DPP-IV量為一個酶的活力單位。反應在96孔板內(nèi)進行，反應體系為100uL，其中底物濃度為0.29mmol/L，DPP-IV濃度為1.9U/L，茶葉提取物濃度為10mg/mL。同時設置無茶葉提取的空白對照和500ug/mL西格列汀的陰性對照。加樣順序為緩沖液、DPP-IV、茶葉提取物、底物。加完底物后立即用酶標儀在405nm波長下讀出A₀，37℃放置1h后，再用相同波長讀出A₁。計算抑制率。

實驗結(jié)果如表1所示：

表1不同茶葉水浸出物對DPP-IV的抑制效果

除龍井茶稍低以外，其余茶類之間的抑制效果無顯著差異，且紅茶，黑茶等發(fā)酵茶具有較好的抑制效果。

此外，有報道稱一些來自天然食品的肽鏈對DPP-IV有顯著的抑制作用，故對發(fā)酵程度最高且抑制效果最好的紅茶正山小種進行了肽鏈的分離。

2、肽鏈分離

首先，用50kDa、10kDa、5kDa、1kDa的超濾膜對肽鏈進行粗分離并測定抑制率，測定體系如上所述，結(jié)果如表2所示。根據(jù)結(jié)果進行SDS-PAGE電泳細分，切膠回收后用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析其氨基酸序列。

表2不同孔徑超濾膜分離后正山小種的肽鏈濃度及其抑制效果

從表中可看出經(jīng)過4種孔徑的膜分離后，其肽鏈濃度顯著減少，但是抑制率并無明顯下降，故對1kDa分離后的肽鏈進行細分，并對其肽鏈順序進行了測序分析。結(jié)果如表3所示：

表3從1kDa中分離出的肽鏈序列及其基本信息

3、茶葉中具體成分的抑制效果測定

茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，是茶葉的主要功能性成分之一，其中又以兒茶素為主，兒茶素中又以EGCG的效果最佳，故對兒茶素EGCG以及95％茶多酚進行了抑制率的測定IC₅₀的篩選，反應體系為100uL，其中底物濃度為0.29mmol/L，DPP-IV濃度為1.9U/L，兒茶素EGCG和茶多酚的濃度從0-500ug/mL。同時設置西格列汀作為陰性對照。

從茶葉提取物中獲得4條肽鏈后，人工合成四條多肽，其純度為92％。對人工合成多肽與95％茶多酚等一起進行IC₅₀篩選，結(jié)果如表4所示：

表4不同物質(zhì)純化后的IC₅₀篩選

從表中可以看出肽鏈AGFAGDDAPR具有較低的IC₅₀值，其余三條多肽效果相對低一些。因此可以認為此目標多肽在抵抗II型糖尿病中會起到有效的治療作用。

4、正常小鼠口服糖耐量實驗

選取健康雄性ICR小鼠，體重20g左右，在12小時光暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，保證足夠的食物和水供給，自由進食。將小鼠分成三組，保證每組體重相近，每組10只。在口服糖耐量實驗前30分鐘，對三組小鼠分別灌胃超純水、多肽AGFAGDDAPR(500mg/kg)，西格列汀(5mg/kg)，超純水組為空白對照組，西格列汀組為陽性對照組。糖耐量實驗開始時每只小鼠灌胃5g/kg體重比的葡萄糖，在0,30,60,90,120min用OneTouch Ultra(LifeScan,Inc.Milpitas,USA)測定血糖值，計算曲線下面積。

結(jié)果如圖1和圖2所示：對照組小鼠的初始血糖水平為7.41mmol/L，在30min快速增加，隨后快速下降，在最后60min緩慢下降，120min時趨于穩(wěn)定。西他列汀組在前30min的血糖水平極顯著低于空白對照組(P<0.01)，60min時顯著低于空白對照組(P<0.05)。多肽組在30min時的血糖水平為13.53mmol/L低于空白對照組，達到顯著水平?？诜嚯慕档土薃UC120min的值，從1238mmol/L·min降低到1146mmol/L·min。在單次口服糖耐量實驗中多肽能夠降低小鼠的血糖水平和AUC120min值，達到了顯著差異，顯示出其在控制血糖方面的潛力，在長期實驗中可能有更優(yōu)秀的表現(xiàn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大學

<120> 一種茶葉多肽在制備抗II型糖尿病藥物或保健品中的應用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

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<212> PRT

<213> 茶葉

<400> 1

Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg

1 5 10