本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種隔山消提取物，同時(shí)還涉及該隔山消提取物的制備方法，以及在降血糖方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種常見的高發(fā)病率的內(nèi)分泌代謝性疾病，其發(fā)病率逐年增高，已成為世界性的、危害人類健康的常見病和多發(fā)病，與心腦血管、腫瘤疾病并列為三大疾病之一。糖尿病的患病率逐年上升，預(yù)計(jì)2025年將增至3.8億；中國糖尿病發(fā)病率居世界第一位，大約十分之一的人口患有高血糖癥或糖尿病。1型糖尿病是由于先天胰島素缺乏導(dǎo)致的；2型糖尿病是由于胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗形成的，是最常見的類型。糖尿病常引起各種急、慢性并發(fā)癥，導(dǎo)致眼、足、腎臟、心臟等臟器發(fā)生病變甚至危及生命。深入研究糖尿病的發(fā)病機(jī)理，研究開發(fā)新的降糖藥物或天然降糖藥物，對日益增加的糖尿病患者十分重要。目前在臨床上控制血糖的手段主要還是依賴藥物，常用的降糖藥物可分為幾大類，第一類是磺酰脲類藥物，例如氯磺丙脲、格列本脲 (優(yōu)降糖)、甲苯磺丁脲等，主要機(jī)制是刺激胰島β細(xì)胞的分泌，增加血液中胰島素的量，起到降糖作用。第二類是雙胍類藥物，例如苯乙雙胍、丁二胍、二甲雙胍等，主要機(jī)制是刺激胰島受體的敏感性，增加組織對糖的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低血液中糖含量。第三類是α-糖苷酶抑制劑類藥物，例如阿卡波糖（拜糖平）、伏格列波糖，主要機(jī)制是競爭性抑制小腸上皮細(xì)胞上的α-葡萄糖苷酶的活性, 阻斷碳水化合物分解成葡萄糖，延緩單糖在小腸的吸收速率，控制餐后血糖。第四類是噻唑烷二酮類藥物，例如吡格列酮、羅格列酮、恩格列酮等，主要機(jī)制是增加胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗，增加胰島素利用。近年來也出現(xiàn)了一些新的劑型藥物，如鉻制劑，降糖效果比較明顯?？傮w而言，西藥的降糖效果比較明顯，可以有效地控制血糖，然而長期服用，毒副作用比較大，如磺酰脲類藥物容易產(chǎn)生傷肝腎，低血糖、惡心、頭痛頭昏、視力模糊、增加心血管疾病死亡率的副作用；雙胍類藥物容易引起惡心、加重心臟負(fù)擔(dān)；噻唑烷二酮類容易傷肝、致癌。為了尋找低毒的降糖藥物，越來越多的醫(yī)藥工作者開始研究天然產(chǎn)物中的降血糖活性成分。
目前從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的降血糖活性成分有多糖類化合物、黃酮類化合物、皂苷類化合物、萜類化合物、生物堿類化合物、不飽和脂肪酸等。降糖作用機(jī)制方面主要可以歸結(jié)為以下幾個(gè)方面：一、胰島素類似物，葫蘆科植物苦瓜（Morodicacharantia L)在傳統(tǒng)中草藥中被認(rèn)為可刺激消化功能和促進(jìn)食欲?，F(xiàn)代藥理和化學(xué)研究表明其主要有效成分是苦瓜素，這是一類多肽類化合物，早在1974年，卡納(Khanna, P.)發(fā)現(xiàn)苦瓜中的多肽成分P多肽具有降糖作用，后來證實(shí)其作用機(jī)制與類胰島素相似，通過改變酮體和脂肪酸的代謝水平調(diào)節(jié)血糖（Khanna,P.Hypoglycemic activity of polypeptide-p isolated from a plant source. J. Nat. Prod., 1981, 44: 648.）。服部(Hattorik, K.)發(fā)現(xiàn)大花紫薇中的一種鞣質(zhì)成分能夠促進(jìn)胰島素受體β亞基的活性。珠簾藤、異葉山牽牛、海南桫拉木等植物的水提取物或醇提取物均顯示類胰島素樣降糖活性（Hattori, K.; Sukenobu, N.; Sasaki, T.; et al. Activation of insulin receptors produced by lagerstroemin.J. Pharmacol. Sci. (Tokyo, Jpn.), 2003, 93(1): 69.）。二、刺激胰島素分泌作用，此作用主要是通過兩方面來實(shí)現(xiàn)的，第一是保護(hù)胰島素細(xì)胞，黃酮類成分具有細(xì)胞保護(hù)作用，楊新波（Yang Xin-Bo）等發(fā)現(xiàn)給糖尿病小鼠重復(fù)給以水芹黃酮可以降低血糖，并通過組織學(xué)的比較發(fā)現(xiàn)其具有保護(hù)胰島損傷的作用（Yang, X.B.; Huang, Z.M.; Cao, W.B.; et al. Anti-diabetic effects from cress flavonoids.Acta. Pharmacol. Sin., 2000, 3: 49.）。第二是促進(jìn)胰島細(xì)胞再生，吳勇等發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可以提高胰島素分泌胰島細(xì)胞的數(shù)量，增加胰島素的分泌（吳勇，歐陽靜萍，涂淑等. 黃芪中多糖對糖尿病大鼠的微血管病變改善作用及機(jī)制研究。湖北中西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，3（3）: 16.）。三、胰島素增敏作用，娜（NaM.）等發(fā)現(xiàn)白檀醇提物中的熊果酸、科羅索酸具有對胰島素增敏的作用（Na,M.; Yang, S.; He L.; et al. Inhibition of protein tyrosine phosphatasel B produced by Ursane-type triterpenes isolated from Symplocos. paniculata. Planta. Med., 2006, 72 (3): 261.）。此外，人參果、干李子、石榴籽等都有類似的降糖機(jī)理。天然產(chǎn)物中存在著大量的具有α-糖苷酶抑制活性的化合物，如大黃中的多糖類成分、杜仲中的黃酮類成分、梔子中的環(huán)烯醚萜類成分、玉米須中的皂苷類成分都具有較好的α-糖苷酶抑制活性活性。α-糖苷酶抑制劑副作用小，近年來成為研究降糖藥的熱點(diǎn)之一。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供了一種能降低血糖的隔山消提取物。
本發(fā)明的另一目的在于提供該隔山消提取物的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供該隔山消提取物在降血糖方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的一種隔山消提取物，是以C21甾體皂苷和苷元為主要成分的提取物。
上述的一種隔山消提取物，其中：C21甾體皂苷和苷元為主要成分的提取物為告達(dá)亭或青陽參苷元。
本發(fā)明的一種隔山消提取物的制備方法，包括以下步驟：
（1）取隔山消塊根洗凈后, 曬干粉碎至100-120目細(xì)粉；
（2）隔山消塊根細(xì)粉用有機(jī)溶劑冷浸3次、每次一周或加熱回流提取3次、每次2小時(shí)，經(jīng)減壓濃縮除去有機(jī)溶劑得浸膏，浸膏加水溶解，經(jīng)石油醚、苯或環(huán)己烷等除去油脂, 然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液合并，經(jīng)減壓濃縮除去乙酸乙酯得隔山消乙酸乙酯提取物即隔山消提取物。
(3)隔山消提取物用水與醇混合（2：0-1, 3）溶解，加入酸使其水解，經(jīng)石油醚、苯或環(huán)己烷等除去油脂, 然后逐步加入堿調(diào)節(jié)水解溶液至中性，減壓回收甲醇得水解產(chǎn)物，經(jīng)硅膠H減壓短柱層析，分別以不同比例的石油醚-丙酮梯度洗脫，分別得到告達(dá)亭，青陽參苷元。
其中：有機(jī)溶劑為酒精、甲醇或丙酮等；酸為硫酸、鹽酸或磷酸等，堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鋇等。
本發(fā)明的一種隔山消提取物在降血糖方面的應(yīng)用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有明顯的有益效果，從以上技術(shù)方案可知：本發(fā)明以隔山消塊根為原料, 用有機(jī)溶劑對隔山消塊根進(jìn)行提取，獲得隔山消塊根以C21甾體皂苷和苷元為主要成分的提取物，其中含量最大為告達(dá)亭和青陽參苷元。在篩選降糖活性天然物質(zhì)的過程中，利用四氧嘧啶性糖尿病小鼠模型發(fā)現(xiàn)了隔山消提取物的乙酸乙酯部位和部分C21甾體苷元具有顯著的降血糖作用。在總提物劑量為二甲雙胍的五分之一、告達(dá)亭為二甲雙胍的千分之十四、青陽生苷元為二甲雙胍的千分之八時(shí)，降血糖的效果相似于二甲雙胍。為開發(fā)利用隔山消天然活性物質(zhì)開發(fā)新的降血糖藥物提供了方法。
具體實(shí)施方式
結(jié)合具體試驗(yàn)和實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1
一種隔山消乙酸乙酯提取物的制備方法，包括以下步驟：
取隔山消塊根洗凈后, 曬干粉碎至100目細(xì)粉。隔山消塊根粉末1公斤，75%乙醇冷浸3次每次一周，經(jīng)減壓濃縮除去乙醇得浸膏，浸膏加水3-5 L溶解，經(jīng)工業(yè)石油醚除脂,然后工業(yè)重蒸乙酸乙酯3-5 L分別萃取3次，取乙酸乙酯萃取液合并，經(jīng)減壓濃縮除去乙酸乙酯得隔山消乙酸乙酯提取物即隔山消提取物48.6克。
實(shí)施例2
一種隔山消乙酸乙酯提取物的制備方法，包括以下步驟：
取隔山消塊根洗凈后, 曬干粉碎至120目細(xì)粉。隔山消塊根粉末1公斤，75%乙醇加熱回流提取3次每次2小時(shí)，經(jīng)減壓濃縮除去乙醇得浸膏，浸膏加水3-5 L溶解，經(jīng)工業(yè)石油醚除脂,然后工業(yè)重蒸乙酸乙酯3-5 L分別萃取3次，取乙酸乙酯萃取液合并，經(jīng)減壓濃縮除去乙酸乙酯得隔山消乙酸乙酯提取物即隔山消提取物52.1克。
實(shí)施例3
一種隔山消乙酸乙酯提取物的制備方法，包括以下步驟：
取隔山消塊根洗凈后, 曬干粉碎至110目細(xì)粉。隔山消塊根粉末1公斤，95%乙醇加熱回流提取3次每次2小時(shí)，經(jīng)減壓濃縮除去乙醇得浸膏，浸膏加水3-5 L溶解，經(jīng)工業(yè)石油醚除脂,然后工業(yè)重蒸乙酸乙酯3-5 L分別萃取3次，取乙酸乙酯萃取液合并，經(jīng)減壓濃縮除去乙酸乙酯得隔山消乙酸乙酯提取物即隔山消提取物38.6克。
實(shí)施例4
一種隔山消乙酸乙酯提取物的制備方法，包括以下步驟：
取隔山消塊根洗凈后, 曬干粉碎至120目細(xì)粉。隔山消塊根粉末1公斤，工業(yè)75%甲醇加熱回流提取3次每次2小時(shí)，經(jīng)減壓濃縮除去甲醇得浸膏。膏狀加水3-5 L溶解，經(jīng)工業(yè)石油醚除脂,然后乙酸乙酯3-5 L分別萃取3次，取乙酸乙酯萃取液合并，經(jīng)減壓濃縮除去乙酸乙酯得隔山消乙酸乙酯提取物即隔山消提取物47.2克。
實(shí)施例5
一種隔山消乙酸乙酯提取物的制備方法，包括以下步驟：
取隔山消塊根洗凈后, 曬干粉碎至120目細(xì)粉。隔山消塊根粉末1公斤，75%丙酮水加熱回流提取3次每次2小時(shí)，經(jīng)減壓濃縮除去乙醇得總提物膏狀216克。膏狀加水3-5 L溶解，經(jīng)工業(yè)石油醚除脂,然后工業(yè)重蒸乙酸乙酯3-5 L分別萃取3次，取乙酸乙酯萃取液合并，經(jīng)減壓濃縮除去乙酸乙酯得隔山消乙酸乙酯提取物即隔山消提取物46.8克。
實(shí)施例6
一種隔山消告達(dá)亭和青陽參苷元的制備方法，包括以下步驟：
根據(jù)實(shí)施例1的方法，隔山消塊根粉末1公斤，75%乙醇冷浸3次每次一周，經(jīng)減壓濃縮除去乙醇得浸膏，浸膏用H2O/CH3OH (2：1, 3 L)溶解，然后加入10% 濃硫酸(2 L)，加熱回流使其水解，工業(yè)石油醚或石油醚-苯（1:1）萃取3次脫脂，逐步加入10% 氫氧化鈉調(diào)節(jié)水解溶液 pH = 7.0，減壓回收甲醇得水解產(chǎn)物，然后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取3次，減壓回收乙酸乙酯得總苷元浸膏，總苷元經(jīng)硅膠H減壓短柱層析，分別以不同比例的石油醚-丙酮梯度洗脫，分別得到告達(dá)亭(3.008g)，青陽參苷元(1.504 g)。
實(shí)施例7
一種隔山消告達(dá)亭和青陽參苷元的制備方法，包括以下步驟：
根據(jù)實(shí)施例2的方法，隔山消塊根粉末1公斤，75%乙醇加熱回流提取3次每次2小時(shí)，經(jīng)減壓濃縮除去乙醇得浸膏，浸膏用H2O/CH3OH (2：1, 3 L)溶解，然后加入10% 濃硫酸(2 L)，加熱回流使其水解，石油醚或石油醚-苯（1:1）萃取3次脫脂，逐步加入10% 氫氧化鈉調(diào)節(jié)水解溶液pH = 7.0，減壓回收甲醇得水解產(chǎn)物，然后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取3次，減壓回收乙酸乙酯得總苷元浸膏，總苷元經(jīng)硅膠H減壓短柱層析，分別以不同比例的石油醚-丙酮梯度洗脫，分別得到告達(dá)亭(3.082mg)，青陽參苷元(1.576 mg)。
根據(jù)實(shí)施例6和7得到的告達(dá)亭和青陽參苷元理化數(shù)據(jù)：
告達(dá)亭(Caudatin)：白色無定形粉末, C28H42O7；EI-MS, m/z：490 [M]+, 473, 447, 429, 411, 393, 362, 319, 301, 283, 265, 181, 163, 145, 129, 111, 43；1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ：5.52 (1H, s, H-2′), 5.35 (1H, br.s, H-6), 4.55 (1H, dd, J =4.0, 11.2Hz, H-12), 3.41 (1H, m, H-3), 2.93 (1H, m, H-4′), 2.17 (3H, s, 21-CH3), 2.13 (3H, s, 7′-CH3), 1.47 (3H, s, 18-CH3), 1.14 (3H, s, 19-CH3), 1.08 (6H, d, J =6.8Hz, 5′-CH3、6′-CH3)；13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ：209.0 (C-20), 166.8 (C-1′), 165.9 (C-3′), 140.4 (C-5), 117.6 (C-6), 112.8 (C-2′), 91.5 (C-17), 88.0 (C-14), 74.1 (C-8), 71.6 (C-12), 71.4 (C-3), 57.7 (C-13), 43.5(C-9), 41.8 (C-4), 38.6 (C-1), 38.1 (C-4′), 36.8 (C-10), 34.1 (C-7), 32.9 (C-15), 31.8 (C-16), 30.6 (C-2), 27.1 (C-21), 24.1 (C-11), 20.8 (C-6′), 20.7 (C-5′), 18.4 (C-19), 16.4 (C-7′), 9.4 (C-18)。
青陽參苷元(Qingyangshengenin)：白色無定形粉末, C28H36O8；(+)ESI-MS m/z：523 [M+Na]+；1H-NMR (CD3COCD3, 400 MHz)δ：7.84 (2H, d, J =8.8Hz, H-4′, 6′), 6.92 (2H, d, J =8.8Hz, H-3′, 7′), 5.27 (1H, br.s, H-6), 4.75 (1H, dd, J =4.0, 11.6Hz, H-12), 3.45 (1H, m, H-3), 2.08 (3H, s, 21-CH3), 1.65 (3H, s, 18-CH3), 1.15 (3H, s, 19-CH3)；13C-NMR (CD3COCD3, 100 MHz)δ：208.6 (C-20), 164.3 (C-1′), 161.9 (C-5′), 140.0 (C-5), 131.8 (C-3′), 131.8 (C-7′), 122.1 (C-2′), 117.9 (C-6), 115.3 (C-4′), 115.3 (C-6′), 92.0 (C-17), 89.0 (C-14), 74.1 (C-8), 72.7 (C-12), 71.3 (C-3), 57.8 (C-13), 43.8 (C-9), 42.5 (C-4), 38.8 (C-1), 37.0 (C-10), 34.2 (C-15), 33.3 (C-7), 32.3 (C-16), 31.2 (C-2), 26.9 (C-21), 24.4 (C-11), 17.8 (C-19), 9.9 (C-18)。
實(shí)驗(yàn)例：實(shí)施例1-5得到的隔山消提取物和實(shí)施例6、7得到的告達(dá)亭和青陽參苷元的降血糖作用
對四氧嘧啶性糖尿病小鼠的影響。
試驗(yàn)動(dòng)物：健康ICR小鼠，雄性，體重20-30 g。
供試藥品：隔山消提取物、告達(dá)亭、青陽參苷元和二甲雙胍片。隔山消提取物 50 mg/kg、告達(dá)亭3.5 mg/kg、青陽參苷元 2.0 mg/kg、二甲雙胍250 mg/kg。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、取60只20-30 g ICR雄性小鼠，稱重編號(hào)，禁食6小時(shí)，尾靜脈一次性注射四氧嘧啶80 mg/kg，給藥體積10 mL/kg，誘導(dǎo)成糖尿病小鼠模型；72小時(shí)后斷尾取血10μL，葡萄糖氧化酶法測定血糖水平，血糖值大于11.1 mmol/L者視為糖尿病小鼠。
2、糖尿病小鼠按體重和血糖值均衡分成5組，每組9只，分別為模型組、隔山消提取物50 mg/kg、告達(dá)亭 3.5 mg/kg、青陽參苷元 2.0 mg/kg、二甲雙胍250 mg/kg，另設(shè)正常對照組，各組按10 mL/kg灌胃給藥，1次/d，共四周。實(shí)驗(yàn)期間每周斷尾取血測定血糖水平。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
隔山消提取物、告達(dá)亭和青陽參苷元對糖尿病動(dòng)物隨機(jī)血糖的影響：
由表1可見，實(shí)驗(yàn)期間糖尿病小鼠的血糖水平持續(xù)在較高水平，與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(P<0.05)，灌胃給予糖尿病小鼠隔山消提取物后1周隨機(jī)血糖水平降低，與糖尿病動(dòng)物組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(P<0.05)，降糖作用持續(xù)4周，給藥后30 min起效，效價(jià)相似于二甲雙胍，但劑量僅為二甲雙胍的1/5。告達(dá)亭和青陽參苷元分別于灌胃給藥第2周和3周出現(xiàn)隨機(jī)血糖降低，與糖尿病動(dòng)物組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(P<0.05)，效價(jià)相似于二甲雙胍，但劑量僅為二甲雙胍的千分之十四和千分之八。
注： **P＜0.01 vs正常組；##P＜0.01 vs模型組, #P＜0.05 vs模型組。(t-test)
2.隔山消提取物、告達(dá)亭和青陽參苷元對糖尿病小鼠空腹血糖的影響
由表2可見，灌胃給予隔山消提取物第3周出現(xiàn)空腹血糖降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，告達(dá)亭和青陽參苷元對糖尿病小鼠空腹血糖影響不明顯。陽性藥二甲雙胍給藥后空腹血糖明顯降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
3. 隔山消提取物、告達(dá)亭和青陽參苷元對糖尿病小鼠體重的影響
結(jié)果表明，糖尿病小鼠體重增長明顯慢于正常動(dòng)物，各給藥組對體重影響不明顯（表3）。
4. 隔山消提取物、告達(dá)亭和青陽參苷元對糖尿病小鼠平均進(jìn)食量的影響
結(jié)果表明糖尿病動(dòng)物進(jìn)食量明顯多于正常動(dòng)物，給予各受試樣品后，糖尿病動(dòng)物進(jìn)食量明顯減少，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(P＜0.05，0.01)，持續(xù)三周周，青陽參苷元樣品持續(xù)二周（表4）。
5.隔山消提取物、告達(dá)亭和青陽參苷元對糖尿病小鼠平均飲水量
結(jié)果表明糖尿病動(dòng)物飲水量明顯多于正常動(dòng)物，給予樣品隔山消提取物后，糖尿病動(dòng)物飲水量明顯減少，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(P＜0.05，0.01)，告達(dá)亭、青陽參苷元樣品和陽性藥二甲雙胍組飲水量一過性降低，持續(xù)一至二周（表5）。
乙酸乙酯部分用量是二甲雙胍的1/5, 效果第四周為二甲雙胍的1.5
按實(shí)施例1-5得到隔山消提取物及實(shí)施例6和7所得到的告達(dá)亭和青陽參苷元制備藥物時(shí)，將其與藥物學(xué)上可接受的、對人和動(dòng)物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑制備成各種劑型。
所述的藥用載體或賦形劑是一種或多種固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。將隔山消提取物及告達(dá)亭和青陽生苷元采用制藥和食品領(lǐng)域公認(rèn)的方法制備成各種劑型，如液體制劑（注射劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑等）、固體制劑（片劑、膠囊劑、顆粒劑、沖劑等）等口服給藥途徑進(jìn)行血糖的治療。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。