本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，具體涉及一種用于治療腦卒中的依達(dá)拉奉和ZL006乙酯藥用組合物及其用途。

背景技術(shù)：

缺血性腦卒中嚴(yán)重危害人類健康和生命安全，并且是導(dǎo)致長(zhǎng)期殘疾的主要原因，如何改善卒中預(yù)后是臨床治療的重要目標(biāo)。缺血性腦卒中的缺血-再灌注損傷是卒中患者神經(jīng)損傷加重的重要原因，神經(jīng)保護(hù)劑能夠提高血供恢復(fù)后神經(jīng)元的存活率、改善神經(jīng)功能，減輕卒中患者的缺血-再灌注損傷，得到了廣泛重視。針對(duì)腦卒中病理生理機(jī)制的環(huán)節(jié)，研究開發(fā)了眾多神經(jīng)保護(hù)劑，但是進(jìn)展有限。目前唯一臨床有效的自由基清除劑依達(dá)拉奉療效仍然不能令人滿意。

缺血性腦卒中病理生理機(jī)制主要包括以神經(jīng)細(xì)胞死亡、炎癥發(fā)生、血腦屏障破壞等組織損傷為特征的急性期和以神經(jīng)血管恢復(fù)為特征的后期。以往研究顯示僅僅針對(duì)腦卒中病理生理機(jī)制中單一環(huán)節(jié)的藥物，即使在動(dòng)物模型中可以有較好的效應(yīng)，也無法在臨床實(shí)驗(yàn)中取得相應(yīng)的療效。目前認(rèn)為，只有作用于腦卒中發(fā)生發(fā)展的多個(gè)病理環(huán)節(jié)并發(fā)揮強(qiáng)大神經(jīng)保護(hù)作用的藥物才有可能成為有效的腦卒中治療新藥(Stroke，2009；40(8):2899-905)。

在再灌注期間，血氧部分或全部恢復(fù)，氧氣作為幾種重要反應(yīng)的底物，生成很多氧自由基，而后者在鐵蛋白存在的條件下轉(zhuǎn)變?yōu)榱u自由基，攻擊膜結(jié)構(gòu)和DNA，最終破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能；依達(dá)拉奉為強(qiáng)效自由基清除劑，依達(dá)拉奉在體內(nèi)以陰離子形式存在、并可轉(zhuǎn)移一個(gè)電子給自由基，清除自由基，并且打斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞(中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2011,341-348)。但是，依達(dá)拉奉毒副作用較大，據(jù)日本臨床病例569例觀察，26例(4.57％)出現(xiàn)不良反應(yīng)。主要表現(xiàn)為肝功能異常16次(2.81％)，皮疹4次(0.70％)。569例中臨床檢測(cè)值異常變化的有122例(21.4％)，主要是AST上升7.71％(43/558)，ALT上升8.23％(46/559)等肝功能檢測(cè)值異常。

腦缺血后興奮性遞質(zhì)谷氨酸大量釋放，激活神經(jīng)元突觸后膜上的N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-Methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)，引起NMDAR突觸后致密蛋白-95(postsynaptic density-95,PSD95)/神經(jīng)元型一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)三元復(fù)合物的形成,進(jìn)一步激活nNOS，產(chǎn)生大量一氧化氮(nitric oxide,NO)，NO本身具有較強(qiáng)的氧化性，釋放過多或清除功能不足時(shí)，會(huì)直接損傷周圍細(xì)胞表面脂質(zhì)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。另一方面，腦缺血再灌注過程中生成了大量的氧陰離子自由基(O₂^-.)，和NO反應(yīng)生成超氧亞硝酸陰離子自由基(ONOO^-.)，后者作為穩(wěn)定的強(qiáng)氧化物，將對(duì)細(xì)胞造成更為嚴(yán)重的損傷(Cell.Mol.Life Sci.,2004,61,657-668)。NMDAR抑制劑能夠減少腦缺血后NO的釋放，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，但是不良反應(yīng)較大，臨床效果不確切。小分子化合物ZL006能夠特異性阻斷PSD-95蛋白與nNOS的偶聯(lián)，減少NMDAR/PSD95/nNOS三元復(fù)合物的形成，可以在不影響NMDA受體的生理功能、不干擾nNOS的活性及其他亞型NOS功能的同時(shí)，減少NO的釋放，減輕缺血性卒中后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和損傷(Nature Medicine 2010:1439-1443)。由于ZL006難以通過血腦屏障，腦組織分布低，我們的研究發(fā)現(xiàn)，高劑量ZL006(10mg/kg)不能獲得比正常劑量ZL006(2mg/kg)更好的治療效果。ZL006乙酯能夠改善ZL006的腦組織分布，具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用(Bioorg Med Chem Lett.2016:2152-2155)。但是，我們發(fā)現(xiàn)，高劑量ZL006乙酯(10mg/kg)同樣不能獲得比正常劑量ZL006乙酯(1mg/kg)更好的治療效果。

在超過安全有效劑量范圍后，進(jìn)一步提高依達(dá)拉奉或者ZL006乙酯的劑量難以獲得更好的治療作用，同時(shí)會(huì)引起毒副作用的增加。我們的研究發(fā)現(xiàn)，將依達(dá)拉奉和ZL006乙酯以適當(dāng)?shù)谋壤?lián)合給藥，可以獲得比單用依達(dá)拉奉或者ZL006乙酯更好的治療效果，也可以在聯(lián)合給藥依達(dá)拉奉較低的劑量下獲得比單用較高劑量依達(dá)拉奉更好的治療效果。特別的,依達(dá)拉奉對(duì)缺血性腦卒中恢復(fù)期的神經(jīng)功能沒有改善,而依達(dá)拉奉和ZL006乙酯藥用組合物還能夠改善缺血性腦卒中恢復(fù)期的神經(jīng)功能。因此，依達(dá)拉奉與ZL006乙酯以恰當(dāng)?shù)姆绞叫纬傻慕M合物，將能夠同時(shí)產(chǎn)生自由基清除和阻斷nNOS-PSD-95解耦，通過兩個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮協(xié)同作用，從而發(fā)揮良好的神經(jīng)保護(hù)作用，還能夠改善缺血性腦卒中恢復(fù)期的神經(jīng)功能。是本發(fā)明最重要的創(chuàng)新之處。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種治療腦卒中的藥用組合物及其應(yīng)用，該藥物組合物的成分之間具備協(xié)同增效的作用，通過ZL006乙酯顯著提升了依達(dá)拉奉的療效，還能夠改善缺血性腦卒中恢復(fù)期的神經(jīng)功能。

技術(shù)方案：一種治療腦卒中的藥用組合物，包括依達(dá)拉奉和ZL006乙酯。

優(yōu)選的，依達(dá)拉奉和ZL006乙酯的質(zhì)量比為(5-1):1。

上述藥用組合物在制備治療腦卒中藥物中的應(yīng)用

本發(fā)明中的藥物組合物施用方式優(yōu)選以注射形式給藥，包括但不限于注射劑、凍干劑等。

有益效果：依達(dá)拉奉能夠清除自由基，并且打斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，ZL006乙酯可以解開PSD95-nNOS耦聯(lián)從而避免過多NO生成的物質(zhì)，依達(dá)拉奉和ZL006乙酯以適當(dāng)?shù)谋壤浜鲜褂脮r(shí)具有增強(qiáng)或協(xié)同作用的效果，可以提高使用效果。將依達(dá)拉奉和ZL006乙酯以適當(dāng)?shù)谋壤?lián)合給藥，可以獲得比單用依達(dá)拉奉或者ZL006乙酯更好的治療效果，也可以在聯(lián)合給藥依達(dá)拉奉較低的劑量下獲得比單用較高劑量依達(dá)拉奉更好的治療效果。在獲得同樣治療效果的前提下，由于依達(dá)拉奉給藥濃度的減少，降低了不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，還能夠改善缺血性腦卒中恢復(fù)期的神經(jīng)功能。

附圖說明

圖1為依達(dá)拉奉(5mg/kg)和ZL006乙酯(1mg/kg)聯(lián)合給藥對(duì)于大鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用示意圖(1：溶劑組(1％亞硫酸氫鈉溶液)，2：ZL006乙酯組，3：依達(dá)拉奉組，4：依達(dá)拉奉和ZL006乙酯聯(lián)合給藥組)A：各劑量組腦梗死面積與溶劑組的比較。B：各組神經(jīng)缺陷癥狀評(píng)分與溶劑組的比較。

圖2為依達(dá)拉奉(1mg/kg)和ZL006乙酯(1mg/kg)聯(lián)合給藥對(duì)于大鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用示意圖(1：溶劑組(1％亞硫酸氫鈉溶液)，2：ZL006乙酯組，3：依達(dá)拉奉組，4：依達(dá)拉奉和ZL006乙酯聯(lián)合給藥組)A：各劑量組腦梗死面積與溶劑組的比較。B：各組神經(jīng)缺陷癥狀評(píng)分與溶劑組的比較。

圖3為依達(dá)拉奉(1mg/kg)和ZL006乙酯(1mg/kg)聯(lián)合給藥對(duì)于大鼠急性局灶性腦缺血恢復(fù)期的保護(hù)作用示意圖(1：溶劑組(1％亞硫酸氫鈉溶液)，2：ZL006乙酯組，3：依達(dá)拉奉組，4：依達(dá)拉奉和ZL006乙酯聯(lián)合給藥組)。各組神經(jīng)缺陷癥狀評(píng)分與溶劑組的比較。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

局灶性腦缺血再灌注模型的制備

采用大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)再灌注模型誘導(dǎo)腦缺血損傷。大鼠經(jīng)2％水合氯醛(0.2mL/10g，i.p.)麻醉后，將動(dòng)物仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，沿頸正中切開皮膚，鈍性分離頸部肌肉組織，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)并小心游離；輕輕剝離伴行的迷走神經(jīng)，結(jié)扎并剪斷向內(nèi)及淺表走向的頸外動(dòng)脈分支(ECA)；循頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)向前，在顱底附近有向外側(cè)的分支動(dòng)脈—翼腭動(dòng)脈，將其分離結(jié)扎。CCA近心端以手術(shù)線結(jié)扎；結(jié)扎線的遠(yuǎn)端用眼科剪剪開小口，將商業(yè)化用于手術(shù)用MCAO模型制備的尼龍線(4/0號(hào))沿該小口處插入，插入約20mm感覺有輕微阻力時(shí)為止，提示線栓前端已經(jīng)達(dá)到大腦前動(dòng)脈。至此，大腦中動(dòng)脈(MCA)的血液供應(yīng)包括頸動(dòng)脈和大腦韋氏環(huán)前交通支來源的血供均已阻斷。根據(jù)標(biāo)記判斷插入線拴的深度。線拴的血管外部分結(jié)扎固定，防止線栓的滑脫。右側(cè)腦缺血120分鐘后，小心拔除線栓，結(jié)扎斷端，實(shí)現(xiàn)缺血后的再灌注。縫合皮膚，回籠精心喂養(yǎng)。手術(shù)過程中保持動(dòng)物體溫恒定在37±0.5℃。

局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)缺陷癥狀評(píng)價(jià)

采用改良Bederson 5分制法進(jìn)行神經(jīng)缺陷癥狀評(píng)價(jià)。采用單盲法評(píng)價(jià)腦缺血后大鼠的神經(jīng)缺陷癥狀，即由試驗(yàn)設(shè)計(jì)者將動(dòng)物按組標(biāo)記，對(duì)神經(jīng)缺陷癥狀進(jìn)行評(píng)分的試驗(yàn)者不知道動(dòng)物的分組情況，評(píng)分結(jié)束后，評(píng)分者將各種標(biāo)記的評(píng)分結(jié)果呈交設(shè)計(jì)者，由設(shè)計(jì)者揭盲，獲得各試驗(yàn)組每只動(dòng)物的評(píng)分。

腦梗死面積測(cè)定

動(dòng)物用10％的水合氯醛3.5mL/kg麻醉，斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，用生理鹽水沖洗大腦表面血跡，吸去表面殘留水跡，于-80℃放置7min，取出后立即于視線交叉平面垂直向下作冠狀切面，并向后每隔2mm切片，將腦片置于用0.2mol/L pH 7.4～7.8PBS新鮮配制的20g/L TTC染液中水浴(37℃90min)，正常腦組織染成深紅色，缺血腦組織則呈蒼白色，用生理鹽水沖洗后，迅速將腦片從前向后按順序排成一排，吸干表面殘留水跡，拍照。用圖像分析軟件對(duì)照片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，圈定右側(cè)缺血面積(白色區(qū)域)和右側(cè)總面積，用如下公式計(jì)算腦梗死面積的百分比。

實(shí)驗(yàn)1、依達(dá)拉奉(5mg/kg)和ZL006乙酯聯(lián)合給藥對(duì)于大鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

大鼠MCAO 120分鐘，再灌注后1小時(shí)尾靜脈注射依達(dá)拉奉(5mg/kg)、ZL006乙酯(1mg/kg)、依達(dá)拉奉(5mg/kg)和ZL006乙酯(1mg/kg)、以及等體積的溶劑(1％亞硫酸氫鈉溶液)，注射藥物的體積為0.1mL/100g體重，于腦缺血后48小時(shí)評(píng)價(jià)神經(jīng)缺陷癥狀，而后處死動(dòng)物，取腦，TTC染色，測(cè)定染色后腦片的梗死面積。結(jié)果如圖1所示：與溶劑對(duì)照組相比，各組顯著降低腦梗死面積，顯著減輕神經(jīng)缺陷癥狀。聯(lián)合給藥組比單獨(dú)給藥組顯示了更好的神經(jīng)保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)2、依達(dá)拉奉(1mg/kg)和ZL006乙酯聯(lián)合給藥對(duì)于大鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

采用實(shí)驗(yàn)1的方法，分別測(cè)定依達(dá)拉奉(1mg/kg)、依達(dá)拉奉(1mg/kg)和ZL006乙酯(1mg/kg)的混合液對(duì)大鼠MCAO神經(jīng)保護(hù)作用，結(jié)果如圖2所示：與溶劑對(duì)照組相比，各組顯著降低腦梗死面積，顯著減輕神經(jīng)缺陷癥狀。聯(lián)合給藥組比單獨(dú)給藥組顯示了更好的神經(jīng)保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)3、依達(dá)拉奉(1mg/kg)和ZL006乙酯聯(lián)合給藥對(duì)于大鼠急性局灶性腦缺血恢復(fù)期的保護(hù)作用

大鼠MCAO 120分鐘，再灌注后4天尾靜脈注射依達(dá)拉奉(1mg/kg)、ZL006乙酯(1mg/kg)、依達(dá)拉奉(1mg/kg)和ZL006乙酯(1mg/kg)、以及等體積的溶劑(1％亞硫酸氫鈉溶液)，注射藥物的體積為0.1mL/100g體重，每天給藥1次，于腦缺血后11天評(píng)價(jià)神經(jīng)缺陷癥狀。結(jié)果如圖3所示：與溶劑對(duì)照組相比，各組顯著減輕神經(jīng)缺陷癥狀。聯(lián)合給藥組比單獨(dú)給藥組顯示了更好的神經(jīng)保護(hù)作用。

以上實(shí)例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。