本發(fā)明涉及HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛藥物用途發(fā)明領域，尤其是涉及白藜蘆醇可用于在制備降低HIV gp120誘導的神經(jīng)病理痛的藥物中的應用，其作用機理涉及抑制背根神經(jīng)節(jié)嘌呤2X(P2X)₇受體介導的痛覺信息傳遞。

背景技術：

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染常常引起各種神經(jīng)系統(tǒng)相關疾病，導致神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，嚴重威脅生命。伴隨著疾病的發(fā)展，HIV感染患者常常伴有外周神經(jīng)病變，包括末梢感覺功能障礙，進一步可喪失行走功能。研究表明可能是背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)的損傷導致HIV感染并發(fā)周圍神經(jīng)病變。糖蛋白(glucoprotein120,gp120)是暴露在HIV病毒表面的一種結構蛋白。已證實gp120與HIV感染所致相關病變有關，還可引起DRG神經(jīng)細胞和Schwann細胞凋亡。HIV外層的gp120識別并且浸染宿主細胞，可通過小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞釋放神經(jīng)毒素和炎性因子，損傷神經(jīng)元。gp120直接興奮初級感覺傳入神經(jīng)元，導致痛覺過敏。短暫置gp120于坐骨神經(jīng)或鞘內(nèi)注射重組gp120導致動物機械痛和熱痛過敏。

疼痛它是人類共有而個體差異很大的一種不愉快的感覺，它伴隨著大多數(shù)疾病。根據(jù)疼痛時程可將疼痛分為急性痛(生理性痛)和慢性痛(病理性痛)，其中慢性痛包括炎癥痛、神經(jīng)病理痛(neuropathic pain,NPP)、癌癥痛。由于慢性痛的發(fā)病機制尚未闡明，導致其很難治愈。HIV感染并發(fā)的神經(jīng)病理痛有自發(fā)痛和誘發(fā)痛。HIV并發(fā)外周神經(jīng)病理性損傷常常表現(xiàn)為感覺神經(jīng)病變，30％的艾滋病感染者收其影響。發(fā)病率高、發(fā)病制劑不明確導致HIV感染并發(fā)神經(jīng)病理痛治療極為困難，所以亟待解決。

三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)是重要能量物質(zhì)。Burnstock在上世紀70年代初提出“嘌呤能神經(jīng)學說”后，作為神經(jīng)遞質(zhì)的ATP研究工作倍受關注。嘌呤類物質(zhì)包括三磷酸腺苷(ATP)及代謝產(chǎn)物二磷酸腺苷/一磷酸腺苷(ADP/AMP)和腺苷等均參與信息傳遞。目前普遍認為ATP是外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遞質(zhì)。根據(jù)對腺苷和ATP的選擇性親和力不同將“嘌呤受體”(purinoceptor)區(qū)分為P1和P2受體兩大類型。P2嘌呤受體又分為配體門控離子通道型(P2X)和G-蛋白偶聯(lián)代謝型(P2Y)受體。已有7種P2X受體亞型(分別是P2X₁、P2X₂、P2X₃、P2X₄、P2X₅、P2X₆、P2X₇)，和9種哺乳動物的P2Y受體亞型(分別是P2Y₁、P2Y₂、P2Y₄、P2Y₆、P2Y₁₁、P2Y₁₂、P2Y₁₃、P2Y₁₄、P2Y₁₅)被克隆出來。研究表明P2X₇受體涉及神經(jīng)病理性痛。損傷神經(jīng)時可釋放出大量的細胞炎性因子，ATP可激活P2X₇受體，與細胞炎性因子和其它炎癥介質(zhì)共同作用介導神經(jīng)病理痛。

白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一類主要存在于葡萄皮、百合科、蓼科、豆科、花生和多種藥用植物中的一種多酚類化合物。白藜蘆醇(Res)化學名為3,5,4'-三羥基二苯乙烯(3,5,4'-trihydroxystilbene)，是一種植物天然活性成分。白藜蘆醇具有廣泛的藥理作用，可抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗過敏、降血抗氧化、調(diào)節(jié)免疫以及保護心血管等，是一種重要的植物抗毒素。白藜蘆醇對多種疾病狀態(tài)下的損害可產(chǎn)生保護作用，已廣泛地應用于醫(yī)藥、保健品、食品、化妝品等領域。

本實驗通過HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠模型，觀察白藜蘆醇處理后HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠痛行為的變化，以及與介導神經(jīng)病理痛的P2X₇受體表達變化的關系，為白藜蘆醇用于HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛的預防和治療提供幫助。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供白藜蘆醇的第一個新用途，即白藜蘆醇在制備防治HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛疾病藥物中的應用。

本發(fā)明的第二個目的在于提供白藜蘆醇的第二個新用途，即白藜蘆醇在制備HIVgp120并發(fā)神經(jīng)損傷疾病的藥物中的應用。

本發(fā)明證實白藜蘆醇可降低糖蛋白120神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)衛(wèi)星膠質(zhì)細胞P2X₇受體的表達，降低細胞炎性因子—腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β的表達，增加白細胞介素-10的表達，降低細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的磷酸化以及膠質(zhì)纖維酸性蛋白與P2X₇受體的共表達，抑制背根神經(jīng)節(jié)的傷害性信息傳遞，減輕神經(jīng)損傷及炎性物質(zhì)的傷害剌激，減輕糖蛋白120神經(jīng)病理痛大鼠的痛行為，可應用于制備人類免疫缺陷病毒糖蛋白120相關神經(jīng)病理痛、人類免疫缺陷病毒糖蛋白120神經(jīng)損傷相關疾病的藥物。

附圖說明

圖1為HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠制模過程中的機械縮足反射閾值變化圖。白藜蘆醇能抑制HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠的機械痛行為。實驗分組：對照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。其中^*p<0.05，^**p<0.01表示和對照組比較，^#p<0.05，^##p<0.01表示與HIV gp120大鼠模型組比較。

圖2為HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠DRG的P2X₇受體real-time PCR檢測結果圖。白藜蘆醇可降低HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠DRG上調(diào)的P2X₇mRNA表達水平。實驗分組：對照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。其中^**p<0.01表示和對照組比較，^##p<0.01表示與HIV gp120大鼠模型組比較。

圖3為HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠DRG的P2X₇受體蛋白印跡檢測結果圖。白藜蘆醇處理后可降低HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠DRG上調(diào)的P2X₇受體蛋白表達水平。實驗分組：對照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。圖3(a)為蛋白印跡實驗結果圖，圖3(b)為實驗數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中^**p<0.01表示和對照組比較，^##p<0.01表示與HIV gp120大鼠模型組比較。

圖4為HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠DRG的P2X₇受體與衛(wèi)星膠質(zhì)細胞標志物GFAP的免疫熒光雙標結果圖。大鼠手術側背根神經(jīng)節(jié)P2X₇受體和GFAP存在共表達。白藜蘆醇處理后可降低HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠DRG上調(diào)的P2X₇受體與GFAP共表達水平。實驗分組：對照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。標尺為100μm。

圖5為HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠DRG的TNF-α受體蛋白印跡檢測結果圖。白藜蘆醇處理后可降低HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠DRG上調(diào)的TNF-α受體水平。實驗分組：對照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。圖5(a)為蛋白印跡實驗結果圖，圖5(b)為實驗數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中^**p<0.01表示和對照組比較，^##p<0.01表示與HIV gp120大鼠模型組比較。

圖6為HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠DRG的IL-1β蛋白印跡檢測結果圖。白藜蘆醇處理后可降低HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠DRG上調(diào)的IL-1β表達水平。實驗分組：對照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。圖6(a)為蛋白印跡實驗結果圖，圖6(b)為實驗數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中^**p<0.01表示和對照組比較，^##p<0.01表示與HIV gp120大鼠模型組比較。

圖7為HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠DRG的IL-10蛋白印跡檢測結果圖。白藜蘆醇處理后可升高HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠DRG下調(diào)的IL-10表達水平。實驗分組：對照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。圖7(a)為蛋白印跡實驗結果圖，圖7(b)為實驗數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中^**p<0.01表示和對照組比較，^##p<0.01表示與HIV gp120大鼠模型組比較。

圖8為HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠DRG的ERK1/2蛋白印跡檢測結果圖。白藜蘆醇處理后可降低HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛大鼠DRG上調(diào)的ERK1/2磷酸化水平。實驗分組：對照組；HIV gp120大鼠模型組；HIV gp120大鼠模型+白藜蘆醇處理組。圖8(a)為蛋白印跡實驗結果圖，圖8(b)(c)為實驗數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中^**p<0.01表示和對照組比較，^##p<0.01表示與HIV gp120大鼠模型組比較。

圖9為白藜蘆醇對HEK293細胞轉染的P2X₇受體ATP激活電流影響結果圖。白藜蘆醇可以抑制HEK293細胞轉染的P2X₇受體ATP激活電流。實驗分組：ATP對照組；ATP+白藜蘆醇處理組。圖9(a)分ATP、ATP+白藜蘆醇處理激活電流實驗結果圖，圖9(b)為白藜蘆醇抑制濃度效應曲線，其中^*p<0.05表示和單獨用ATP比較。

具體實施方式

下面結合實施例并對照附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。

實施例1。

用本技術領域公知的方法，制成適用于HIV gp120誘導神經(jīng)病理痛治療的口服或注射的白藜蘆醇制劑。

實施例2。

用本技術領域公知的方法，制成適用于涉及HIV gp120并發(fā)神經(jīng)損傷相關疾病治療的口服或注射的白藜蘆醇制劑。

實施例3。

用本技術領域公知的方法，制成適用于涉及HIV gp120并發(fā)感覺神經(jīng)炎性相關疾病治療的口服或注射的白藜蘆醇制劑。

總之，白藜蘆醇以口服、注射、含片或其它局部或全身用藥劑型藥物進行上述疾病防治。

為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面以白藜蘆醇對P2X₇受體介導的相關疾病治療作用研究的實驗和結果來證明白藜蘆醇的用途。

一、材料和方法。

1.動物和分組。

南昌大學醫(yī)學院實驗動物科學部提供30只200g Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠。適應一周后隨機分為3組，每組10只：假手術對照組；HIV gp120模型組；HIV gp120模型+白藜蘆醇處理組，分別標記，自由飲食飲水。建立應用gp120于坐骨神經(jīng)的神經(jīng)病理痛模型：(1)用10％水合氯醛麻醉大鼠；(2)備皮，消毒，切開左側腿彎凹陷皮膚，使坐骨神經(jīng)暴露，注意不要損傷到神經(jīng)；(3)將2×6mm的氧化纖維素膜浸泡于250μl濃度為0.1％的大鼠血清白蛋白(Rat Serum Albumin，RSA)生理鹽水溶液中，其中含有200ng gp120，對于假手術對照組，則在濃度為0.1％的RSA生理鹽水溶液中浸泡；(4)將浸泡過的纖維素膜寬松的纏繞坐骨神經(jīng)三根分叉部，約有3-4mm的神經(jīng)被纏繞，注意不要壓迫神經(jīng)；(5)縫合肌肉和皮膚切口，用碘伏消毒傷口。

從手術后第1天到手術后兩周，每天向HIV gp120+白藜蘆醇組腹腔注射白藜蘆醇(30mg/kg)。同時，對照組和HIV gp120模型組在注射相同體積生理鹽水。保持每次給藥時間一致。兩周后處死大鼠取標本(L4-L6段背根神經(jīng)節(jié))。

2.藥物與試劑。

白藜蘆醇(南京澤朗公司)，兔源性P2X₇、TNF-α、IL-1β、IL-10抗體(Abcam公司)，兔源性ERK1/2、p-ERK1/2抗體(CST公司)，小鼠源性GFAP抗體(Millipore公司)。

3.主要儀器。

消毒紗布、手巾、棉簽等，碘酒及75％酒精，手術器械包：剪刀、眼科小彎鑷、血管鉗、絲線、有齒鑷等。

4.大鼠行為學測定。

分別于第0，1，4，7，10，12，14天測量各組大鼠機械縮足反射閾值(MWT)，每次測量的時間及其他條件保持一致。

機械痛敏閾值變化的檢測方法：

機械縮足反射閾值的檢測：采用的裝置為BME-404電子機械刺激器(中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所,天津,中國)。該設備的主要參數(shù)如下：尖端直徑測試針0.6mm，壓力測量范圍0.1-50g和壓力測量分辨率0.05g。大鼠放入規(guī)格為25cm×15cm×25cm以小孔鐵絲網(wǎng)為底的無色透明亞克力盒中，靜置30分鐘以上使之達到穩(wěn)定的靜息狀態(tài)，此裝置稍高于操作平臺，以便看清大鼠足底，方便操作。手術側(左側)后肢足底表面垂直接觸測試針，直到大鼠抬起左下肢，壓力值被電腦軟件自動記錄。每只大鼠測量5次(間隔時間≥5分鐘)，所測的平均值即為機械痛敏閾值。

5、實時定量-聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)。

(1)提取總RNA并逆轉錄成cDNA：所有器械均經(jīng)DEPC處理。在第14天取材，分別取各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)，用DEPC處理過的PBS沖洗，置于RNA Store液中﹣20℃保存，提取RNA時將神經(jīng)節(jié)取出移至加有1ml Trizol勻漿器中，研磨后轉移到1.5ml的無核酶離心管中，加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s，靜置3min,，低溫離心12000g×15min,收集上層無色液相，加入與液相等體積的異丙醇，混勻，常溫靜置25min，沉淀RNA，之后4℃離心12000g×10min，棄上清，在管底可見少許白色沉淀為RNA，加入1ml無核酶水配置的75％乙醇，充分洗滌RNA。4℃離心5000g×3min后，吸棄上清液，倒置2分鐘，略干燥(切勿過分干燥，否則RNA不溶于水)，加20μl無RNase水溶解沉淀。采用50μl逆轉錄反應體系：無核酶水11.75μl，5×buffer 10μl，dNTP 3μl，Olig DT 2μl，MMLV 2μl，Rnasin 1.25μl，RNA樣本20μl，共50μl，離心，恒溫37℃水浴1小時。

(2)設計引物：參考文獻設計P2X₇受體引物序列。本發(fā)明選用β-actin作為標準內(nèi)參，引物序列分別為：

(3)實時定量-聚合酶鏈式反應反應體系(共20μl)：

(4)聚合酶鏈式反應反應條件：

(5)分析數(shù)據(jù)。用β-actin作為內(nèi)參對P2X₇受體表達進行標化處理。

6、蛋白印跡。

(1)蛋白提?。簩RG置于加有200μl組織裂解液(含蛋白酶抑制劑)的1ml勻漿器中，于冰上研磨充分。冰上靜止30min，將勻漿樣品轉移到1.5ml EP管中，4℃，14000g離心15min，取上清，按比例加入6×loading buffer，混勻后煮沸5min，使蛋白變性，-20℃保存，備用。

(2)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。

制備SDS-PAGE凝膠，所用試劑如下表：

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳構成(ml)

(3)上樣及電泳：每孔上樣量為25μl(蛋白含量約為20μg)，樣本兩邊加3μl蛋白Marker。濃縮膠恒壓60V，分離膠90V，待溴酚藍遷移至膠的下緣時停止電泳。

(4)轉膜：根據(jù)蛋白Marker的指示和目的蛋白的分子量準備合適大小的PVDF膜和2張4層的濾紙，PVDF膜用甲醇激活后，放入轉膜緩沖液中(濾紙置于轉膜緩沖液中)浸泡以備用。電泳完畢后轉膜，300mA轉膜2個小時。

(5)免疫反應。

A)封閉：將膜置于含5％脫脂牛奶的TBST封閉液中，水平搖床室溫作用2h。

B)一抗結合：將膜放入用5％脫脂牛奶配制的一抗(兔來源的P2X₇、TNF-α、IL-1β、IL-10、ERK1/2、p-ERK1/2稀釋比例1:1000，小鼠抗β-actin單抗稀釋比例1:800)中，4℃過夜，或室溫平搖3h，TBST洗膜3次。

C)二抗結合：將膜用IgG-HRP二抗反應液(P2X₇、TNF-α、IL-1β、IL-10、ERK1/2、p-ERK1/2二抗為山羊抗兔，按1:2000溶于封閉液，β-actin為山羊抗小鼠，按1：2000溶于封閉液)孵育，室溫平搖1.5h后，TBST洗膜10min×3次。

D)免疫復合物的檢測：膜加ECL發(fā)光劑反應3min后，用保鮮膜包裹，置于X線暗盒，暗室中剪大小合適X線膠片，曝光10s～10min，顯影、定影，

(6)半定量分析：膠片掃描后，通過Image圖像分析軟件分析目的條帶在的光密度值，以各組β-actin條帶的光密度值標化其相應組P2X₇、TNF-α、IL-1β、IL-10、ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表達量。

7、免疫熒光雙標。

從大鼠分離的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌后用4％多聚甲醛(PFA)固定24小時，20％蔗糖4℃過夜脫水。用冰凍切片機將神經(jīng)節(jié)切位厚度為10μm的切片。用PBS洗滌后三次，將切片在37℃下用10％正常山羊血清預孵育40分鐘，然后孵育兔源性抗體P2X₇(1:500)和雞抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)(1：500，Abcam)在PBS中稀釋過夜4℃。在PBS中漂洗三次后，孵育切片用山羊抗雞FITC和山羊抗兔TRITC熒光二抗(1:200)37℃孵育40分鐘。在PBS中洗滌三次后，切片用甘油固定并用熒光顯微鏡檢測。對于陰性對照組，正常山羊血清和PBS代替一抗。

8、HEK293細胞轉染。

HEK 293細胞用含有10％FBS、1％青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5％CO₂的細胞培養(yǎng)箱中。根據(jù)Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染試劑說明書對人源性的pcDNA3.0-EGFP-P2X₇質(zhì)粒進行轉染。當HEK293細胞長滿70-80％時，轉染前2小時將細胞培養(yǎng)基更換為Opti-MEM無血清培養(yǎng)基。轉染步驟如下：(a)將4μg質(zhì)粒DNA稀釋到終體積為250μl Opti-MEM中；(b)10μl Lipofectimine2000加入終體積為250μl的Opti-MEM中；(c)將含有Lipofectamine的溶液與含質(zhì)粒的溶液混合，并在室溫下孵育20分鐘。隨后，向每個孔中加入cDNA/Lipofectamine混合溶液。細胞在37℃，5％CO₂下孵育6小時。孵育后，細胞培養(yǎng)基換成含有10％FBS的DMEM并孵育24-48小時。GFP熒光檢測轉染效率。全細胞膜片鉗記錄轉染后1-2天進行。

9、電生理電流記錄。

應用全細胞膜片鈕技術記錄全細胞電流。所用微電極用兩步拉制法制成，微電極充灌電極液后電阻在2-10MΩ之間。電流信號經(jīng)Axopatch 200B膜片甜放大器、Digidata 1440A及Clampex10.3采集和分析。調(diào)節(jié)微操縱器使微電極尖端接近細胞表面，并對微電極內(nèi)施加一負壓，形成高阻封接(1-10GΩ)，置鉗制電壓于-60mV，吸破細胞膜。移動微操縱器上的加藥裝置排管，不同藥物的傳送依賴于重力流的作用，每管直徑(I.D)為0.2mm，管口距記錄細胞100μm左右，然后分別加入需要的藥物。表達綠色熒光的單個HEK293細胞表明其表達P2X₇受體。電極內(nèi)液成分為(mM)：K gluconate 145，EGTA 0.75，HEPES 10，CaCl₂ 0.1，MgATP 2，Na₃GTP 0.3。用KOH調(diào)節(jié)pH到7.2。細胞外液成分為(mM)：NaCl 126，KCl 2.5，glucose 10，MgCl₂ 1.2，CaCl₂ 2.4，NaHCO₃ 18。用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.4。

10、統(tǒng)計學方法。

應用SPSS統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,結果以均數(shù)±標準差表示，各組之間差異性采用方差分析，組間比較采用LSD法，p<0.05表示有顯著性差異，p<0.01為極顯著差異。

二、結果。

(一)行為學結果。

各組大鼠造模中均未見肢體運動障礙和自殘現(xiàn)象。造模前測定各組間機械縮足反射閾值的基礎值差異無顯著性(p>0.05)。

機械痛敏(MWT)測定結果。

Gp120大鼠神經(jīng)病理痛模型的機械縮足反射潛伏期測定結果顯示，在術后4天到14天，模型組與對照組相比，手術側機械痛反應閾值明顯降低(p<0.05)，其中術后7天到14天降低更明顯(p<0.01)。模型+白藜蘆醇處理組與模型組相比，手術側機械痛反應閾值明顯升高(p<0.05)，其中術后12天到14天升高更明顯。(見圖1)。

(二)實時定量-聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)。

P2X₇受體表達。

P2X₇的Real-time PCR結果表明：gp120模型組DRG中P2X₇受體mRNA表達水平明顯高于對照組(p<0.01)，gp120模型+白藜蘆醇處理組明顯低于模型組(p<0.01)。(見圖2)。

(三)蛋白印跡。

1、P2X₇蛋白印跡結果。

P2X₇蛋白印跡結果表明：gp120模型組DRG中P2X₇受體表達水平較對照組明顯增加(p<0.01)；gp120模型組+白藜蘆醇處理組P2X₇受體蛋白的表達低于模型組(p<0.01)(見圖3)。

2、TNF-α蛋白印跡結果。

TNF-α蛋白印跡結果表明：gp120模型組DRG中TNF-α受體表達水平高于對照組(p<0.01)；gp120模型組+白藜蘆醇處理組TNF-α受體蛋白的表達低于模型組(p<0.01)(見圖5)。

3、IL-1β蛋白印跡結果。

IL-1β蛋白印跡結果表明：gp120模型組DRG中IL-1β表達水平較對照組明顯增加(p<0.01)；gp120模型組+白藜蘆醇處理組IL-1β蛋白的表達低于模型組(p<0.01)(見圖6)。

4、IL-10蛋白印跡結果。

IL-10蛋白印跡結果表明：gp120模型組DRG中IL-10表達水平較對照組明顯降低(p<0.01)；gp120模型組+白藜蘆醇處理組IL-10蛋白的表達高于模型組(p<0.01)(見圖7)。

5、ERK1/2蛋白印跡結果。

ERK1/2蛋白印跡結果表明：gp120模型組DRG中ERK1/2磷酸化水平較對照組明顯增加(p<0.01)；gp120模型組+白藜蘆醇處理組ERK1/2磷酸化水平低于模型組(p<0.01)(見圖8)。

(四)免疫熒光雙標。

免疫熒光雙標結果表明：gp120模型組DRG中P2X₇受體與GFAP的共表達水平與對照組比較明顯著升高。P2X₇受體與GFAP的共表達水平在gp120模型組+白藜蘆醇處理組明顯低于模型組。標尺100μm(見圖4)。

(四)全細胞膜片鉗。

全細胞膜片鉗結果表明：白藜蘆醇可濃度依賴性抑制HEK293細胞P2X₇受體ATP激活電流(見圖9)。

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可降低HIV gp120模型組DRG中P2X₇的表達水平，同時觀察到白藜蘆醇升高HIV gp120模型組大鼠的機械痛閾值，表明白藜蘆醇可緩解HIV gp120模型組神經(jīng)病理大鼠的痛行為。白藜蘆醇處理后下調(diào)HIV gp120模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X₇受體表達的同時，還降低細胞炎性因子—腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素(IL-1β)的含量，增加抗細胞炎性因子—白細胞介素(IL-10)的含量，降低ERK1/2磷酸化水平。因此，白藜蘆醇可能是通過減少TNF-α、IL-1β的釋放，增加IL-10的釋放，降低ERK1/2磷酸化水平，降低HIV gp120神經(jīng)病理大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X₇受體的表達，抑制背根神經(jīng)節(jié)P2X₇受體介導的傷害性信息傳遞，減輕HIV gp120神經(jīng)病理痛大鼠的痛行為。