本發(fā)明涉及茯苓酸A的新藥物應用，具體涉及茯苓酸A用于制備利尿藥物的應用。
背景技術：
茯苓為多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos)的干燥菌核，別名松苓、松薯等。茯苓始載于《神農本草經》，茯苓性平，味甘、淡，歸心、肺、脾、腎經。茯苓是一味常用的健脾和胃、利水滲濕、寧心安神的中藥；臨床使用分茯苓、茯神、赤茯苓等，茯苓自古以來就是一味藥食兩用、非常重要的中藥，有十藥九茯苓之說，將茯苓列為上品。茯苓的主要活性成分為茯苓多糖和四環(huán)三萜類化合物。茯苓中四環(huán)三萜類化合物具有抗癌、抗腫瘤、免疫調節(jié)、體內拮抗醛固酮等活性。
茯苓皮為茯苓菌核的外皮，茯苓加工時僅使用茯苓內部菌核即白茯苓，加工白茯苓時茯苓外皮和切割下的殘塊都被當成廢料處理，造成了茯苓的極大浪費。研究表明茯苓皮中的四環(huán)三萜類化學成分含量遠遠高于茯苓菌核內部的白茯苓中的含量。茯苓皮四環(huán)三萜酸類化學成分種類眾多，羊毛甾烷型四環(huán)三萜類化合物包括去氫齒孔酸、3-表去氫土莫酸、齒孔酸、3-表去氫土莫酸、去氫土莫酸、去氫齒孔酮酸、茯苓酸等。3，4-裂環(huán)羊毛甾烷型四環(huán)三萜類化合物包括茯苓新酸A、茯苓新酸B、茯苓新酸C、茯苓新酸D、茯苓新酸E、茯苓新酸F、茯苓新酸AM、茯苓新酸AE、茯苓新酸BM、茯苓新酸CE、茯苓新酸DM。
技術實現要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題在于克服藥吲達帕胺、呋塞米、氯噻嗪、氯噻酮等上述利尿藥物的副作用，為用茯苓酸A制備的藥物提供一種新用途。
本發(fā)明提供了茯苓酸A用于制備利尿藥物的應用。
發(fā)明人的結果表明茯苓酸A對生理鹽水負荷的水潴溜大鼠有顯著的利尿作用，茯苓酸A有保鉀排鈉的利尿效應，茯苓酸A可為臨床提供一種新的醛固酮拮抗劑或選擇性醛固酮受體阻滯劑的利尿候選藥物。
附圖說明
圖1為不同時間茯苓酸A、螺內酯及呋塞米給藥組灌胃給藥對大鼠尿量的影響。
具體實施方式
本發(fā)明用茯苓酸A制備利尿藥物以常規(guī)藥用制劑的形式來使用；所述的常規(guī)藥物用制劑含作為活性組分在制劑中與藥學上可接受的載體，如適宜于腸胃內和腸胃外給藥的有機或無機的固體或液體賦形劑混合，該藥用制劑可以是固體形式如膠囊劑、片劑、丸劑、散劑、顆粒劑等。上述制劑中可含有穩(wěn)定劑、潤濕劑、輔料和其它常用的添加劑，如玉米淀粉、硬脂酸、橄欖油、檸檬酸、乳糖、乙二醇、硬脂酸鎂、明膠、石膏粉、瓊脂、抗壞血酸等。上述的制劑可按照各種制劑常規(guī)的制備工藝制成。
為了驗證茯苓酸A利尿的效果，發(fā)明人以生理鹽水負荷的水潴溜正常大鼠模型進行了利尿活性實驗，實驗藥物、動物、儀器、方法及結果如下：
1.實驗藥物
螺內酯片：杭州民生藥業(yè)有限公司產品，批號T15L035，生產日期151225；呋塞米片：上海朝暉藥業(yè)有限公司產品，批號1602N14，生產日期20160225；茯苓酸A按照上述提取制備工藝進行制備，通過1H NMR、13C NMR、MS、UV和IR等波譜與光譜技術進行鑒定結構。
2.實驗動物
體重180-220g的雄性Sprague-Dawley大鼠購買于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(陜)2012-003。
3.實驗儀器
安徽淮北正華生物儀器有限公的ZH-B6型大鼠代謝籠，TD型電子天平，美特列-托利多十萬分子一分析天平。
4.實驗方法
1)茯苓酸A的利尿實驗的動物分組、實驗藥物劑量及尿液收集方法
雄性SD大鼠隨機分為6組：正常對照組、茯苓酸A小劑量組(5mg/kg)、茯苓酸A中劑量組(10mg/kg)、茯苓酸A大劑量組(20mg/kg)、螺內酯對照組(40mg/kg)、呋塞米對照組(20mg/kg)，每組8-12只大鼠，禁食不禁水12h后各組均按5ml/100g體重灌胃給予生理鹽水，并用手輕壓腹部使其排盡余尿，給藥各組均按1ml/100g體重灌胃，正常對照組給自來水1ml/100g。給藥后立即將大鼠分別放入不銹鋼的大鼠代謝籠，每籠1只大鼠。給藥后在大鼠代謝籠下面放置帶刻度的試管，連續(xù)收集6小時尿液，記錄每只動物每小時的尿量。
2)藥效計算
計算每組動物每小時的尿量的平均值和標準誤，計算6h每組動物總尿量的平均值和標準誤，測定尿液pH值，測定尿液中電解質鈉(Na+)、鉀(K+)及氯(Cl-)的含量，進行統計學分析。結果均以平均值±SE表示，采用t檢驗，計算t，P值，將治療組與空白組進行組間差異性比較，t檢驗，P<0.05為有顯著性差異；P<0.01為有非常顯著性差異，判斷茯苓酸A對生理鹽水負荷的水潴溜正常大鼠模型的利尿效果。
3)實驗結果
(1)茯苓酸A的制備及結構鑒定
茯苓酸A的提取制備工藝：經過干燥的茯苓皮藥材粉碎后，用5倍體積的乙酸乙酯浸泡2天，開始滲漉，濃縮提取物，回收乙酸乙酯，得棕色乙酸乙酯提取物。乙酸乙酯提取物用MCI填料拌樣，上MCI色譜柱，采用40:60-70:30甲醇-水梯度洗脫；洗脫液濃縮進一步上200-300目的硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，合并濃縮，最后得茯苓酸A。
黃色粉末，C31H46O5,MW:498,EI-MS m/z:497[M-H]－,479[M-H2O]－,423[M-CH2CH2CO2H]－；1H NMR(pyridine-d5,800MHz)δ:0.963,0.971(2×3H,s,H3-26,27),1.007(3H,s,H3-19),1.111(3H,s,H3-18),1.476(3H,s,H3-30),1.725(3H,s,H3-29),1.802(1H,m,H-1),2.856(1H,dd,J＝11.11,5.73Hz,H-17),2.929(1H,dt,J＝8.12,2.68Hz,H-20),4.499(1H,dd,J＝7.18,6.83Hz,H-16),4.809,4.823(2×1H,brs,H-28),4.837(1H,s,H-31),5.267(1H,brs,H-7),5.25(1H,brs,H-11)。13C NMR(pyridine-d5,200MHz)給出30個碳信號，根據DEPT譜推斷分別為7個甲基，8個亞甲基，7個次甲基(包括3個雙鍵碳δ121.21,116.65,124.92)，7個季碳(含3個雙鍵碳δ142.81,146.53,131.64和一個羧基碳δ178.72)。13C NMR(pyridine-d5,200MHz)給出31個碳信號，根據DEPT譜推斷分別為6個甲基δ:18.31(C-18),22.23(C-19),22.19(C-26),21.83(C-27),21.985(C-28),24.82(C-29)，7個亞甲基(含2個雙鍵碳δ112.14,C-28,107.07,C-31)，9個次甲基(包括2個雙鍵碳δ117.94,120.26和一個羥基碳δ76.38)，9個季碳(含4個雙鍵碳δ150.21,141.82,137.46,156.01和2個羧基碳δ176.58,178.59)。13C NMR(pyridine-d5,200MHz)δ:36.34(C-1),30.17(C-2),176.58(C-3),150.21(C-4),50.71(C-5),28.54(C-6),117.94(C-7),141.82(C-8),137.46(C-9),38.80(C-10),120.26(C-11),36.95(C-12),45.59(C-13),49.28(C-14),43.78(C-15),76.38(C-16),57.58(C-17),18.32(C-18),22.23(C-19),48.41(C-20),178.59(C-21),31.33(C-22),33.18(C-23),156.01(C-24),34.05(C-25),22.19(C-26),21.83(C-27),112.14(C-28),21.98(C-29),24.82(C-30),107.01(C-31)。根據以上數據與文獻對照，鑒定該化合物為：16α-羥基-3,4-裂環(huán)羊毛甾-4(28),7,9(11),24(31)-三烯-3,21-雙酸(16α-hyroxy-3,4-secolanosta-4(28),7,9(11),24(31)-tetraen-3,21-dioic acid)或者茯苓酸A(poricoic acid A)。
(16α-hyroxy-3,4-secolanosta-4(28),7,9(11),24(31)-tetraen-3,21-dioic acid)的化學結構式如下：
(2)不同劑量的茯苓酸A對大鼠尿量的影響
圖1顯示茯苓酸A利尿在6h內尿量的累加結果，與正常對照組相比，小、中、大3個劑量組隨著時間增加尿量增加；小劑量組的1h和2h內尿量沒有統計學上的顯著性差異，其它時間段內尿量存在統計學上的顯著性差異；中和大劑量組在6h內隨著時間增加尿量增加且均存在統計學上的非常顯著性差異。
表1顯示6h內每小時的尿量，與正常對照組相比，小、中、大3個劑量組均存在不同時間的不同程度的利尿效果。茯苓酸A小劑量組3h和6h有顯著的利尿效果；茯苓酸A中劑量組1h、2h和4h有非常顯著的利尿效果；茯苓酸A大劑量組1h、2h、3h、4h和6h有非常顯著的利尿效果；發(fā)明人的研究顯示茯苓酸A的利尿效果主要集中在前3h。以正常對照組為參照，則茯苓酸A三組6h內尿量分別增加了18.2％、29.3％、45.5％。三組的平均增加率31％，茯苓酸A三個劑量組利尿效果均最顯著，特別值得注意的是茯苓酸A三個劑量組在第1小時的尿量均大于螺內酯的尿量。盡管螺內酯是40mg/kg的劑量，而茯苓酸A為20mg/kg的劑量，大劑量與藥螺內酯的6h的總尿量接近，提示茯苓酸A有較好的利尿效果。茯苓酸A三個不同的劑量組大鼠6h尿量低于呋塞米組，結果表明茯苓酸A的利尿程度弱于呋塞米，茯苓酸A出現了與螺內酯相似的利尿效果，推測茯苓酸A可能與螺內酯有相似的拮抗醛固酮的利尿作用機制。
表1不同劑量的茯苓酸A灌胃給藥對大鼠尿量的影響(平均值±SE)
注：茯苓酸A、螺內酯及呋塞米給藥組與水對照組組間進行t檢驗，與對照組比*P<0.05，**P<0.01。
(3)不同劑量的茯苓酸A對大鼠尿液pH值的影響
與正常對照組尿液相比，茯苓酸A三個劑量組對尿液pH值沒有影響。螺內酯增加尿液的pH值并存在統計學上的顯著性差異。呋塞米對尿液的pH值沒有影響。
(4)不同劑量的茯苓酸A對大鼠尿液電解質鈉、鉀及氯離子濃度的影響
表2顯示茯苓酸A對大鼠尿液電解質濃度的影響。與正常對照組大鼠相比，茯苓酸A三個劑量組均能減少尿液K+的濃度且存在統計學上的非常顯著性差異，說明茯苓酸A有保鉀的利尿活性；與正常對照組大鼠相比，茯苓酸A雖然增加尿液電解質Na+的濃度的趨勢，但三個劑量組均沒有達到統計學上的顯著性差異；與正常對照組大鼠相比，茯苓酸A小、中、大三個劑量組對尿液Cl-的濃度有一定影響，且茯苓酸A中和大劑量組存在統計學上的非常顯著性差異。茯苓酸A小、中、大三個劑量組均增加Na+/K+的比值，且存在統計學上的非常顯著性差異。螺內酯和呋塞米能增加尿液Na+和Cl-濃度，同時增加尿液Na+/K+的比值，但對尿液K+濃度沒有顯著的影響。
發(fā)明人的研究結果證明了茯苓酸A在促進鈉排泄的同時具有保鉀的作用。茯苓酸A促進利水的作用機制可能是抑制腎小管對電解質Na+和水的重吸收，茯苓酸A的化學結構與螺內酯(醛固酮拮抗劑)和依普利酮(選擇性醛固酮受體阻滯劑)結構相似，推斷茯苓酸A的利水作用是拮抗醛固酮而改變鈉和鉀離子的平衡。
表2不同劑量茯苓酸A對大鼠尿液pH值及電解質鈉、鉀及氯離子濃度的影響(平均值±SE)
注：茯苓酸A、螺內酯及呋塞米給藥組與水對照組組間進行t檢驗，與對照組比*P<0.05，**P<0.01。