本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及用于口蹄疫疫苗的復(fù)乳型佐劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：動(dòng)物疫苗中油性佐劑使用最為廣泛，且免疫增強(qiáng)效果最好。含油佐劑疫苗有三種劑型：油包水(W/O)型、水包油包水(W/O/W)型及水包油(O/W)型。目前，含油佐劑疫苗以W/O(油乳劑)最為普遍、增強(qiáng)免疫效果最佳，但是存在不能代謝的礦物油含量高、黏度大和毒副反應(yīng)強(qiáng)等缺點(diǎn)。豬、犬、貓等動(dòng)物對(duì)該劑型疫苗尤為敏感，這限制了W/O劑型在實(shí)際中的應(yīng)用。而O/W劑型克服了W/O的缺點(diǎn)，但佐劑活性太弱，提高免疫效果的能力有限，不能滿足養(yǎng)殖業(yè)的需求。水包油包水(W/O/W)型疫苗中常用的佐劑為水包油包水(W/O/W)型復(fù)乳?，F(xiàn)有技術(shù)中，水包油包水(W/O/W)型復(fù)乳包括ISA206佐劑(法國SEPPIC公司)以及含有大量礦物油的佐劑，含有這些佐劑的疫苗雖然免疫活性高，但是免疫后較長時(shí)間才能夠被動(dòng)物完全吸收，接種部位易發(fā)炎，因此副反應(yīng)較大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供用于口蹄疫疫苗的復(fù)乳型佐劑，含有該佐劑的口蹄疫疫苗在穩(wěn)定性、免疫增強(qiáng)效果較好的前提下，較短時(shí)間內(nèi)就能夠完全被動(dòng)物吸收，避免接種部位發(fā)炎，因此顯著減少了副反應(yīng)。本發(fā)明的另一目的是提供含有復(fù)乳型佐劑的口蹄疫疫苗，該疫苗穩(wěn)定性、免疫效果較好，在較短時(shí)間內(nèi)就能夠完全被動(dòng)物吸收，避免接種部位發(fā)炎，因此顯著減少了副反應(yīng)。本發(fā)明的再一目的是提供上述疫苗的制備方法，該方法簡單，高效，安全。本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：用于口蹄疫疫苗的復(fù)乳型佐劑，由下述質(zhì)量份的組分組成：礦物油50-65份，維生素E10-35份，蓖麻油乙基氧化物3-5份，吐溫802-8份，正戊醇2-6份，硬脂醇聚氧乙烯醚1-4份，去離子水1-5份。在本發(fā)明中，所述蓖麻油乙基氧化物為EmulsogenEL360，所述硬脂醇聚氧乙烯醚為硬脂醇聚氧乙烯(21)醚。本發(fā)明還提供所述用于口蹄疫疫苗的復(fù)乳型佐劑的制備方法，將各組分混合，攪拌均勻，滅菌。本發(fā)明還提供含有所述復(fù)乳型佐劑的口蹄疫疫苗。在本發(fā)明中，所述疫苗由所述復(fù)乳型佐劑和口蹄疫抗原組成。優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述復(fù)乳型佐劑和口蹄疫抗原的質(zhì)量比為1:05～1.5。本發(fā)明還提供所述口蹄疫疫苗的制備方法，將復(fù)乳型佐劑和口蹄疫抗原預(yù)熱至15～30℃，將復(fù)乳型佐劑與口蹄疫抗原混合，手搖或攪拌均勻，得到口蹄疫疫苗。本發(fā)明用于口蹄疫疫苗的復(fù)乳型佐劑，采用維生素E代替部分礦物油，選用低毒性表面活性劑，含有該佐劑的口蹄疫疫苗在穩(wěn)定性、免疫增強(qiáng)效果較好的前提下，在較短時(shí)間內(nèi)易被動(dòng)物完全吸收，避免接種部位發(fā)炎，因此顯著降低了對(duì)動(dòng)物的毒副作用。該復(fù)乳型佐劑與滅活抗原可以通過手搖、磁力攪拌或機(jī)器攪拌，制成穩(wěn)定的W/O/W型疫苗。制備過程無需精密儀器，操作方便，制備成本低。本發(fā)明含有復(fù)乳型佐劑的口蹄疫疫苗，注射方便，制備方法簡單、高效、安全。具體實(shí)施方式實(shí)施例1制備復(fù)乳型佐劑本實(shí)施例中EmulsogenEL360購自科萊恩化工有限公司，產(chǎn)品編號(hào)CNP1004847；硬脂醇聚氧乙烯(21)醚購自上海美豪精細(xì)化工有限公司，產(chǎn)品編號(hào)PCN/4500713528。復(fù)乳型佐劑1配方：復(fù)乳型佐劑2配方：復(fù)乳型佐劑3配方：對(duì)照佐劑1配方：對(duì)照佐劑2配方(是公開號(hào)為CN104398478A、名稱“獸用藥物的復(fù)乳型載體及其應(yīng)用”發(fā)明專利申請(qǐng)中實(shí)施例1的油相3)：制備復(fù)乳型佐劑1-3和對(duì)照佐劑1、2，具體方法如下：按照配方稱取各組分，混合，攪拌均勻，于115℃條件下采用高壓蒸氣滅菌20分鐘。佐劑于室溫避光保存。實(shí)施例2口蹄疫疫苗(W/O/W型)的制備豬口蹄疫滅活病毒液(O型，Mya98株)由金宇保靈生物藥品有限公司提供，滅活前每0.2毫升病毒液中病毒含量為107.17LD50。將復(fù)乳型佐劑1-3、對(duì)照佐劑1分別與豬口蹄疫滅活病毒液按照質(zhì)量比1:1混合，通過手搖5-10分鐘或在250rpm條件下攪拌30分鐘，使各組分混合均勻，得到口蹄疫疫苗，口蹄疫疫苗的編號(hào)與佐劑的對(duì)應(yīng)關(guān)系見表1。佐劑、病毒液在混合前最好預(yù)熱至15～30℃。按照公開號(hào)為CN104398478A、名稱“獸用藥物的復(fù)乳型載體及其應(yīng)用”發(fā)明專利申請(qǐng)中實(shí)施例3方法，將對(duì)照佐劑2與豬口蹄疫滅活病毒液(O型，Mya98株)制成口蹄疫疫苗，編號(hào)為疫苗E。佐劑編號(hào)疫苗編號(hào)復(fù)乳型佐劑1口蹄疫疫苗A復(fù)乳型佐劑2口蹄疫疫苗B復(fù)乳型佐劑3口蹄疫疫苗C對(duì)照佐劑1口蹄疫疫苗D對(duì)照佐劑2口蹄疫疫苗E口蹄疫疫苗A-E均為W/O/W型，它們的物理性狀均一致，乳化液呈淡粉色，搖動(dòng)時(shí)壁上略帶淡藍(lán)色劑型。采用如下方法檢測(cè)口蹄疫疫苗A-E：取一250mL燒杯，盛放100mL冷水，取一清潔吸管，吸取少許疫苗滴于冷水表面，各疫苗的液滴均呈云霧狀擴(kuò)散。黏度：用1mL吸管(出口內(nèi)徑1.2mm)吸取25℃左右的疫苗1.0mL,令其垂直自然流出，記錄流出0.4mL所需的時(shí)間，結(jié)果：各疫苗的流出時(shí)間均在8秒以內(nèi)。粒徑：用移液槍精確取疫苗10μL于測(cè)試杯中，加入290μLPBS緩沖液充分混勻，確保乳化顆粒良好分散，將測(cè)試杯放入馬爾文納米粒度儀中測(cè)定，測(cè)定溫度設(shè)定為25℃，結(jié)果各疫苗的平均粒徑在130-190nm范圍內(nèi)。離心穩(wěn)定性：取疫苗10mL加入離心管中，在3000rpm/min離心15min，盛放各疫苗的管底均無析出水相。37℃穩(wěn)定性：將疫苗置于37℃培養(yǎng)箱中，每天定時(shí)觀察，各疫苗放置14天后不破乳?？谔阋咭呙鏏-E在4℃冰箱中放置12個(gè)月，均穩(wěn)定。實(shí)施例3口蹄疫疫苗A、B、C的安全檢驗(yàn)檢驗(yàn)實(shí)施例2中口蹄疫疫苗A-E對(duì)小鼠和豬的安全性。(1)小鼠安全試驗(yàn)取16-22g清潔級(jí)小鼠60只，隨機(jī)分成6組，其中一組不接種作為對(duì)照，另外五組分別免疫口蹄疫疫苗A、B、C、D或E，每只小鼠頸部皮下注射1/2頭份(0.5ml，這里的1/2頭份是相對(duì)于豬的)口蹄疫疫苗。疫苗接種后1周、2周、3周，各組隨機(jī)剖解小鼠3只，觀察注射部位吸收情況，結(jié)果見表2。通過表2可以看出：接種小鼠注射部位剖解，疫苗A、B、C組注射后2周3/3完全吸收；D組注射后2周僅有1/3完全吸收，注射后3周才3/3完全吸收；E組注射后2周僅有1/3完全吸收，注射后3周才3/3完全吸收。小鼠安全試驗(yàn)結(jié)果說明：采用本發(fā)明佐劑1-3制備的口蹄疫疫苗，在注射后兩周就被全部試驗(yàn)動(dòng)物完全吸收，避免了由于疫苗長時(shí)間未完全吸收在接種部位引起的發(fā)炎，因此與對(duì)比佐劑1、2相比，顯著降低了副反應(yīng)，安全性高。表2口蹄疫疫苗的安全檢驗(yàn)結(jié)果(2)豬安全試驗(yàn)取口蹄疫抗體陰性的30-35日齡健康仔豬各30頭，隨機(jī)分成6組，其中一組不接種作對(duì)照組，另外五組分別接種口蹄疫疫苗A、B、C、D或E，每頭肌肉注射4頭份(4ml)口蹄疫疫苗。接種后觀察14天，所有試驗(yàn)豬觀察指標(biāo)包括體溫、精神、食欲等局部、全身反應(yīng)以及剖解注射部位吸收情況，結(jié)果見表3。通過表3可以看出：所有試驗(yàn)豬精神、體溫、食欲等均未見異常。疫苗接種仔豬未見疫苗接種引起的異常反應(yīng)。高劑量(4ml)接種豬注射部位剖解，口蹄疫疫苗A、B、C接種14天后所有豬只完全吸收，口蹄疫疫苗D接種14天后只有2/5豬只完全吸收，口蹄疫疫苗E接種14天后只有1/5豬只完全吸收。豬安全試驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明佐劑1-3制備的口蹄疫疫苗，在注射后兩周能夠被全部試驗(yàn)動(dòng)物完全吸收，避免了由于疫苗長時(shí)間未完全吸收在接種部位引起的發(fā)炎，因此，與對(duì)比佐劑1、2相比，顯著降低了副反應(yīng)，安全性高。表3口蹄疫疫苗安全檢驗(yàn)結(jié)果上述安全性試驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明采用維生素E代替部分礦物油，選用低毒性表面活性劑，使得口蹄疫疫苗短時(shí)間內(nèi)易被動(dòng)物完全吸收，避免了由于疫苗長時(shí)間未完全吸收在接種部位引起的發(fā)炎，從而顯著減小對(duì)動(dòng)物的毒副作用。實(shí)施例4口蹄疫疫苗A、B、C的免疫原性試驗(yàn)1、豬免疫原性試驗(yàn)檢測(cè)口蹄疫疫苗A、B、C的免疫原性。將健康2-3個(gè)月豬20頭進(jìn)行分組試驗(yàn)，分為4組，每組5頭。其中一組不接種作為空白對(duì)照，另外三組分別接種口蹄疫疫苗A、B、C，每頭接種1ml。免疫后28天采血分離血清，用豬口蹄疫ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(購自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司)檢測(cè)ELISA抗體值，抗體值≥6log2為陽性。結(jié)果見表4，該疫苗單次免疫豬4周后ELISA抗體全部轉(zhuǎn)陽。該結(jié)果表明用本發(fā)明復(fù)乳佐劑制備的口蹄疫疫苗具有較好的免疫原性，免疫后抗體水平高，是良好的疫苗用佐劑。表4不同口蹄疫疫苗免疫豬產(chǎn)生的ELISA抗體(log2)分組口蹄疫疫苗A口蹄疫疫苗B口蹄疫疫苗C空白對(duì)照1677227773377724787257773平均值6.87.27.02.42、小鼠免疫原性比較試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用疫苗：1.實(shí)施例2中制備的口蹄疫疫苗A；2.206佐劑疫苗：ISA206佐劑(購自SEPPIC公司)與實(shí)施例2中相同口蹄疫抗原以質(zhì)量比1:1混合、乳化后制備得到的；3.白油佐劑疫苗：將白油與實(shí)施例2中相同口蹄疫抗原以質(zhì)量比2:1混合，乳化后得到。4.實(shí)施例2中制備的口蹄疫疫苗E。取20g左右清潔級(jí)小鼠25只，隨機(jī)分為口蹄疫疫苗A組、206佐劑疫苗組、白油佐劑疫苗組、口蹄疫疫苗E組和空白對(duì)照組，每組有5只小鼠，除空白對(duì)照組不免疫外，其他各組免疫與其組名相對(duì)應(yīng)的疫苗，除白油佐劑疫苗組免疫0.3ml/只外，其他免疫組頸部皮下注射0.2ml/只。免疫后28天，用口蹄疫ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(購自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司)檢測(cè)ELISA抗體值。小鼠免疫原性試驗(yàn)結(jié)果見表5，從該表中可見小鼠單次免疫后4周ELISA抗體水平，口蹄疫疫苗A組抗體效價(jià)高于206佐劑疫苗組和口蹄疫疫苗E組，表明本發(fā)明復(fù)乳佐劑免疫效果達(dá)到或超過ISA206佐劑和現(xiàn)有含有大量礦物油的復(fù)乳型佐劑；口蹄疫疫苗A組效價(jià)略低于白油佐劑疫苗組，表明本發(fā)明佐劑免疫效果接近白油佐劑，符合W/O/W型佐劑免疫原性低于W/O性佐劑推斷。表5小鼠免疫后28天ELISA抗體效價(jià)(log2)當(dāng)前第1頁1 2 3