本發(fā)明涉及一種腫瘤靶向性熱敏前藥及其制備方法與應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

癌癥嚴(yán)重危害著人類的生命健康，被認(rèn)為是僅次于心腦血管的致人死亡的主要原因(China Cancer，2009，18，88-89)。在中國(guó)，癌癥已成為疾病死因之首，發(fā)病率和死亡率還在攀升，癌癥已成為非常重要的公共健康問題。由于難以早期發(fā)現(xiàn)，其治療一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難點(diǎn)。目前廣泛使用的許多化療藥物都存在難溶于水及在水中穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，且化療藥物在抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞同樣有殺傷作用，尤其是對(duì)增殖較為迅速的正常細(xì)胞，如骨髓造血細(xì)胞和胃腸道粘膜上皮細(xì)胞等。這是目前影響用藥劑量、治療效果和患者生活質(zhì)量的嚴(yán)重問題(Ann.Surg.，1999，229，790-800)。因此，迫切需要開發(fā)新的治療癌癥的方式。

人血清白蛋白(HSA)是人體血液中的主要蛋白，該蛋白由585個(gè)氨基酸構(gòu)成，是人體循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的含量最多的可溶性蛋白，在血液中的濃度為34～54g/L。HSA在調(diào)節(jié)膠體滲透壓、營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)傷口愈合等方面起著巨大作用，廣泛用于肝硬化腹水、燒傷、休克等的臨床治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種腫瘤靶向性熱敏前藥，該前藥應(yīng)用于熱化療，配合腫瘤熱療可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，為癌癥的治療提供了一種新的方式。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述腫瘤靶向性熱敏前藥的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供含所述腫瘤靶向性熱敏前藥的藥物組合物。

本發(fā)明的再一目的在于提供所述腫瘤靶向性熱敏前藥及含其的組合物的應(yīng)用。

為此，本發(fā)明一方面提供一種腫瘤靶向性熱敏前藥(白蛋白‐藥物鍵合物)，其中，該前藥由以下通式描述：

X-(Y-Z)_n

X為白蛋白；

Z為含氨基的抗腫瘤藥物；

Y為生物可降解的含兩個(gè)以上羧基的白蛋白-藥物間隔物，且Y含有偶氮基團(tuán)；

X中的氨基與Y中的一羧基通過酰胺鍵相連；

Z中的氨基與Y中的另外羧基中的一個(gè)通過酰胺鍵相連；

n為0.05與15之間的數(shù)；優(yōu)選n為0.05～6之間的數(shù)，進(jìn)一步優(yōu)選0.05～5之間的數(shù)。

優(yōu)選地，Y為生物可降解的含兩個(gè)羧基的白蛋白-藥物間隔物，Z中的氨基與Y中的另一通過酰胺鍵相連。

本發(fā)明所述腫瘤靶向性熱敏前藥應(yīng)用于熱療與化療結(jié)合(即熱化療)抗腫瘤領(lǐng)域，同時(shí)，其有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中化療藥物難溶于水、在水中穩(wěn)定性差及毒性大的缺陷。

本發(fā)明采用白蛋白這種內(nèi)源性的生物大分子來鍵合藥物，該熱敏前藥(白蛋白-藥物鍵合物)中藥物分子連接在白蛋白上，具體而言，該熱敏前藥由3部分組成：白蛋白、生物可降解的含兩個(gè)以上羧基的白蛋白-藥物間隔物及含氨基的抗腫瘤藥物。由于腫瘤組織細(xì)胞膜表面富含gp60、gp30、gp18等白蛋白受體，為白蛋白-藥物鍵合物(白蛋白熱敏前藥)提供了一種主動(dòng)靶向腫瘤組織的能力，因此本發(fā)明前藥具有腫瘤靶向性。另外，該熱敏前藥中的間隔物可使藥物與白蛋白形成穩(wěn)定的且暫時(shí)的結(jié)合，使其在血液循環(huán)中保持一定的穩(wěn)定性，而在溫度刺激的作用下又可通過水解使藥物基團(tuán)重新斷裂下來，即本發(fā)明熱敏前藥具有一定的穩(wěn)定性和可水解性。此類熱響應(yīng)機(jī)制可使白蛋白-藥物鍵合物(白蛋白熱敏前藥)在腫瘤部位定點(diǎn)釋放，大大增加藥物作用部位如細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的濃度，克服腫瘤的耐藥性，減少化療的毒副作用。該化合物具有生物相容性好的特點(diǎn)，其熱敏感響應(yīng)性能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的特異性釋放，化合物發(fā)生斷裂后，藥物發(fā)揮抗腫瘤作用，白蛋白可自然降解，可降低體內(nèi)載體的蓄積，并且可同時(shí)負(fù)載多個(gè)含氨基的抗腫瘤藥物，可根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)負(fù)載含氨基的抗腫瘤藥物的數(shù)目以達(dá)到最佳的治療效果。本發(fā)明有助于推動(dòng)熱化學(xué)治療的研究與發(fā)展，同時(shí)為癌癥的臨床診斷和治療提供新理論和新方法。

實(shí)驗(yàn)研究表明本發(fā)明所述腫瘤靶向性熱敏前藥在正常溫度及中溫條件下對(duì)正常細(xì)胞無毒，而在中溫條件下對(duì)腫瘤細(xì)胞存在明顯的毒性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明所述腫瘤靶向性熱敏前藥結(jié)合熱療可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，在本發(fā)明所述腫瘤靶向性熱敏前藥中，Y包括4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)或2,2'-偶氮雙(N-(2-羧基乙基)-2-甲基丙脒)(2,2'-azobis(N-(2-carboxyethyl)-2-methylpropionamidine)等。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，在本發(fā)明所述腫瘤靶向性熱敏前藥中，X包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、豬血清白蛋白和重組血清白蛋白等中的一種或多種；優(yōu)選人血清白蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，在本發(fā)明所述腫瘤靶向性熱敏前藥中，Z包括阿霉素、表阿霉素、甲氨蝶呤、柔紅霉素和去甲氧基柔紅霉素或它們的鹽等中的一種或多種；優(yōu)選阿霉素。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，在本發(fā)明所述腫瘤靶向性熱敏前藥中，其中：

X為人血清白蛋白；

Z為阿霉素；

Y為4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)；

n為0.05與15之間的數(shù)，優(yōu)選n為0.05～6之間的數(shù)，進(jìn)一步優(yōu)選0.05～5之間的數(shù)。

另一方面，本發(fā)明提供腫瘤靶向性熱敏前藥的制備方法，所述方法包括如下步驟：

(a)將所述含兩個(gè)以上羧基的白蛋白-藥物間隔物溶于有機(jī)溶劑，加入活化羧基的活性試劑及穩(wěn)定活化后羧酸的活化基團(tuán)穩(wěn)定劑進(jìn)行反應(yīng)；優(yōu)選地，所述白蛋白-藥物間隔物、所述活性試劑與縮合劑的摩爾比為0.001～10:0.001～10:0.001～10，進(jìn)一步優(yōu)選0.1～5：0.1～5：0.1～10；

(b)將所述含氨基的抗腫瘤藥物加入到步驟(a)反應(yīng)后的反應(yīng)液中進(jìn)入反應(yīng)并提純；優(yōu)選地，步驟(a)中所述含兩個(gè)以上羧基的白蛋白-藥物間隔物與所述含氨基的抗腫瘤藥物的摩爾比為0.001～10:0.001～10，進(jìn)一步優(yōu)選0.1～5：0.2～10；

(c)將步驟(b)提純后的產(chǎn)物溶于有機(jī)溶劑中，加入活化羧基的活性試劑及穩(wěn)定活化后羧酸的活化基團(tuán)穩(wěn)定劑進(jìn)行反應(yīng)得混合溶液；

(d)將白蛋白溶于pH為6.0～7.4的緩沖溶液(例如PBS水溶液)中，并向其中加入所得混合溶液，后處理得所述腫瘤靶向性熱敏前藥；優(yōu)選地，步驟(a)中所述含兩個(gè)以上羧基的白蛋白-藥物間隔物與白蛋白的摩爾質(zhì)量比為0.001～10mmol:0.67～67g，進(jìn)一步優(yōu)選0.1～2mmol：6.7～67g；

優(yōu)選地，所述后處理包括對(duì)步驟(d)所得產(chǎn)物進(jìn)行純化，并進(jìn)行冷凍干燥。

步驟(a)的作用是活化白蛋白-藥物間隔物中的一個(gè)羧基，步驟(b)是使活化后的間隔物與抗腫瘤物中的氨基反應(yīng)，以使Y與Z以酰胺鍵連接；步驟(c)的作用是活化白蛋白-藥物間隔物中的另外羧基，步驟(d)是使活化另外羧基的物質(zhì)與白蛋白中的氨基反應(yīng)，以使X與Y以酰胺鍵連接。本發(fā)明所述方法簡(jiǎn)便、反應(yīng)條件溫和、重現(xiàn)性好，可以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，具有非常重要的實(shí)用價(jià)值。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，在本發(fā)明所述方法中，步驟(a)或步驟(c)中所述的活化試劑包括NHS和/或硫代-NHS(Sulfo-NHS)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，在本發(fā)明所述方法中，步驟(a)或步驟(c)中所述的活化基團(tuán)穩(wěn)定劑包括EDC、DCC、DIC和CDI中的一種或多種。

在步驟(a)及步驟(c)中還可加入適量的催化劑以加快羧酸的活性，例如吡啶等。步驟(a)及步驟(c)中的優(yōu)選在極性非質(zhì)子性溶劑中反應(yīng)，例如DMSO等。步驟(a)～步驟(d)中的反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度可進(jìn)一步優(yōu)化。步驟(a)～步驟(d)優(yōu)選在惰性環(huán)境下進(jìn)行。本發(fā)明所述方法可通過控制白蛋白、間隔物與抗腫瘤藥物的比例，反應(yīng)時(shí)間、試劑的濃度、反應(yīng)的條件(加熱溫度、時(shí)間)，制備載藥量不同的腫瘤靶向性熱敏前藥。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述方法按如下步驟進(jìn)行：

(a)將0.001～10mmol所述含兩個(gè)以上羧基的白蛋白-藥物間隔物(優(yōu)選4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸))溶于0.1～100mL二甲基亞砜，再加入0.001～10mmol NHS和0.001～10mmol EDC及1～200μL吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)0.5～48h；

(b)將0.001～10mmol所述抗腫瘤藥物(優(yōu)選鹽酸阿霉素)加入步驟(a)反應(yīng)后的反應(yīng)溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫避光反應(yīng)0.5～48h，并提純；

(c)將步驟(b)提純后的產(chǎn)物溶于0.1～100mL二甲基亞砜中，再加入0.001～10mmol NHS和0.001～10mmol EDC及1～200μL吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)0.5～48h得混合溶液；

(d)將0.0067～67g白蛋白溶液1～1000mlPBS中，并向其中加入步驟(c)所得混合溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)0.5～48h；

(e)對(duì)步驟(d)所得產(chǎn)物進(jìn)行提純，冷凍干燥得所述腫瘤靶向性熱敏前藥。

再一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，該藥物組合物含治療有效量的本發(fā)明所述腫瘤靶向性熱敏前藥。

再一方面，本發(fā)明提供所述腫瘤靶向性熱敏前藥或所述藥物組合物在制備用于治療腫瘤的熱化療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述熱敏前藥或含其的組合物應(yīng)用于熱化療，在具體應(yīng)用時(shí)，當(dāng)將治療有效量的熱敏前藥或藥物組合物給予受體后，需輔助熱療以達(dá)到治療目的，例如使用高頻電磁波、超聲波、熱水浴等使組織加熱，達(dá)到殺死癌細(xì)胞的溫度，致使腫瘤組織變形壞死，繼而使瘤體縮小或消除，在不損傷人體正常組織的情況下，以治療惡性腫瘤。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，本發(fā)明所述腫瘤包括結(jié)腸癌、直腸癌、腦瘤、肺癌、表皮鱗癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌、食管腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、皮膚癌、甲狀腺癌、頭頸癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及鼻咽癌中的一種或多種。

綜上所述，本發(fā)明主要提供了一種腫瘤靶向性熱敏前藥，該前藥主要應(yīng)用于熱化療領(lǐng)域，該類前藥為熱響應(yīng)前藥，其可通過熱響應(yīng)機(jī)制可使白蛋白-藥物鍵合物在腫瘤部位定點(diǎn)釋放，大大增加藥物作用部位如細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的濃度，克服腫瘤的耐藥性，減少化療的毒副作用。本發(fā)明有助于推動(dòng)熱化學(xué)治療的研究與發(fā)展，同時(shí)為癌癥的臨床診斷和治療提供新理論和新方法。

附圖說明

圖1為實(shí)施例6所得到的細(xì)胞毒性圖；

圖2為實(shí)施例7所得到的細(xì)胞毒性圖；

圖3為實(shí)施例7所得腫瘤生長(zhǎng)曲線圖。

圖4為白蛋白-阿霉素鍵合物與阿霉素本身在水溶液中的溶解性測(cè)試結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為了對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行以下詳細(xì)說明，應(yīng)理解這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中，各原始試劑材料均可商購獲得，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照儀器制造商所建議的條件。

實(shí)施例1

(1)準(zhǔn)確稱取0.00028g(0.001mmol)4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)，將其溶于0.1mL二甲基亞砜，再加入0.00012g(0.001mmol)NHS和0.00019g(0.001mmol)EDC及1μL吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)0.5h。

(2)將0.00054g(0.001mmol)鹽酸阿霉素加入上述反應(yīng)溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫避光反應(yīng)0.5h(4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)的一端羧基與鹽酸阿霉素的氨基反應(yīng))。

(3)采用過硅膠柱色譜分離的方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行提純并真空干燥。

(4)將步驟(3)干燥后的產(chǎn)物溶于0.1mL二甲基亞砜，再加入0.00012g(0.001mmol)NHS和0.00019g(0.001mmol)EDC及1μL吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)0.5h得混合溶液。

(5)將0.0067g人血清白蛋白溶于1mL PBS中，并向其中加入以上混合溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)0.5h(4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)的另一端羧基與白蛋白的氨基反應(yīng))得本實(shí)施例白蛋白-阿霉素鍵合物。

(6)采用透析的方法(PBS 7.4)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行提純，將收集的物質(zhì)于-20℃冰箱預(yù)凍2h，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱冷凍24h，冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48h，得到凍干粉。采用熒光光譜法測(cè)定化合物中阿霉素的含量，n＝0.055。

實(shí)施例2

(1)準(zhǔn)確稱取2.8g(10mmol)4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)，將其溶于100mL二甲基亞砜，再加入1.2g(10mmol)NHS和1.9g(10mmol)EDC及200μL吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)48h。

(2)將5.4g(10mmol)鹽酸阿霉素加入上述反應(yīng)溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫避光反應(yīng)48h(4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)的一端羧基與鹽酸阿霉素的氨基反應(yīng))。

(3)采用過硅膠柱色譜分離的方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行提純并真空干燥。

(4)將步驟(3)干燥后的產(chǎn)物溶于100mL二甲基亞砜，再加入1.2g(10mmol)NHS和1.9g(10mmol)EDC及200μL吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)48h得混合溶液。

(5)將0.67g人血清白蛋白溶于1000mL PBS中，并向其中加入以上混合溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48h(4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)的另一端羧基與白蛋白的氨基反應(yīng))得本實(shí)施例白蛋白-阿霉素鍵合物。

(6)采用透析的方法(PBS 7.4)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行提純，將收集的物質(zhì)于-20℃冰箱預(yù)凍2h，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱冷凍24h，冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48h，得到凍干粉。采用熒光光譜法測(cè)定化合物中阿霉素的含量，n＝3.1。

實(shí)施例3

(1)準(zhǔn)確稱取0.28g(1mmol)4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)，將其溶于100mL二甲基亞砜，再加入0.24g(2mmol)NHS和0.19g(1mmol)EDC及20μL吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)24h。

(2)將0.54g(1mmol)鹽酸阿霉素加入上訴反應(yīng)溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫避光反應(yīng)24h(4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)的一端羧基與鹽酸阿霉素的氨基反應(yīng))。

(3)采用過硅膠柱色譜分離的方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行提純并真空干燥。

(4)將產(chǎn)物溶于100mL二甲基亞砜，再加入0.12g(1mmol)NHS和0.19g(1mmol)EDC及20μL吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)24h得混合溶液。

(5)將6.7g人血清白蛋白溶于100mL PBS中，并向其中加入以上混合溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h(4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)的另一端羧基與白蛋白的氨基反應(yīng))得本實(shí)施例白蛋白-阿霉素鍵合物。

(6)采用透析的方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行提純，將收集的物質(zhì)于-20℃冰箱預(yù)凍2h，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱冷凍24h，冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48h，得到凍干粉。采用熒光光譜法測(cè)定化合物中阿霉素的含量，n＝0.45。

實(shí)施例4

(1)準(zhǔn)確稱取0.00028g(0.001mmol)4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)，溶于0.1mL二甲基亞砜，再加入0.00012g(0.001mmol)NHS和0.00019gEDC(0.001mmol)及1μL吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)0.5h。

(2)將0.000454g(0.001mmol)甲氨蝶呤加入上述反應(yīng)溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫避光反應(yīng)0.5h(4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)的一端羧基與甲氨蝶呤的氨基反應(yīng))。

(3)采用過硅膠柱色譜分離的方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行提純并真空干燥。

(4)將步驟(3)所得產(chǎn)物溶于0.1mL二甲基亞砜，再加入0.00012g(0.001mmol)NHS和0.00019g(0.001mmol)EDC及1μL吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)0.5h得混合溶液。

(5)將0.0067g人血清白蛋白溶于1mL PBS中，并向其中加入以上混合溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)0.5h(4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)的另一端羧基與白蛋白的氨基反應(yīng))得本實(shí)施例白蛋白-甲氨蝶呤鍵合物。

(6)采用透析的方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行提純，將收集的物質(zhì)于-20℃冰箱預(yù)凍2h，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱冷凍24h，冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48h，得到凍干粉。采用HPLC測(cè)定化合物中阿霉素的含量，n＝0.065。

實(shí)施例5

(1)準(zhǔn)確稱取2.8g(10mmol)4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)，溶于100mL二甲基亞砜，再加入1.2g(10mmol)NHS和1.9g(10mmol)EDC及200μL吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)48h。

(2)將5.64g(10mmol)柔紅霉素加入上述反應(yīng)溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫避光反應(yīng)48h(4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)的一端羧基與柔紅霉素的氨基反應(yīng))。

(3)采用過硅膠柱色譜分離的方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行提純并真空干燥。

(4)將步驟(3)所得產(chǎn)物溶于100mL二甲基亞砜，再加入1.2g(10mmol)NHS和1.9g(10mmol)EDC及200μL吡啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)48h得混合溶液。

(5)將67g人血清白蛋白溶于1000mL PBS中，并向其中加入以上混合溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)48h(4,4'-偶氮雙(4-氰基戊酸)的另一端羧基與白蛋白的氨基反應(yīng))得本實(shí)施例白蛋白-柔紅霉素鍵合物。

(6)采用透析的方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行提純，將收集的物質(zhì)于-20℃冰箱預(yù)凍2h，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱冷凍24h，冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48h，得到凍干粉。采用熒光光譜法測(cè)定化合物中阿霉素的含量，n＝0.48。

實(shí)施例6：比較白蛋白-阿霉素鍵合物對(duì)兩株腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6，U87和內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3的細(xì)胞毒性作用。

本實(shí)施例使用的C6，U87，bEnd.3皆屬于腦膠質(zhì)瘤研究中常用細(xì)胞株，均能通過市場(chǎng)購買獲得。將實(shí)施例3獲得的白蛋白-阿霉素鍵合物用DMEM培養(yǎng)基等比例稀釋成適當(dāng)濃度，采用噻唑藍(lán)(MTT)快速比色法測(cè)定白蛋白-阿霉素鍵合物對(duì)C6，U87，bEnd.3的細(xì)胞毒性作用。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6，U87，bEnd.3細(xì)胞以1～5×10⁴個(gè)/孔加入96孔板中，過夜培養(yǎng)至貼壁，然后分別用含有相應(yīng)濃度的白蛋白-阿霉素鍵合物DMEM培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)48h，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，37℃，5％CO₂及飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育4h，吸出培養(yǎng)基，加入150μl DMSO，10min后490nm酶標(biāo)儀檢測(cè)，并繪制細(xì)胞毒性圖，所得結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以看到明顯對(duì)細(xì)胞的無明顯殺傷作用，證明白蛋白-阿霉素鍵合物對(duì)細(xì)胞無毒。

實(shí)施例7：白蛋白-阿霉素鍵合物與熱療聯(lián)合作用。

本實(shí)施例使用的C6，U87，bEnd.3皆屬于腦膠質(zhì)瘤研究中常用細(xì)胞株，均能通過市場(chǎng)購買獲得。將實(shí)施例3獲得的白蛋白-阿霉素鍵合物用DMEM培養(yǎng)基等比例稀釋成適當(dāng)濃度，采用噻唑藍(lán)(MTT)快速比色法測(cè)定白蛋白-阿霉素鍵合物對(duì)C6，U87，Bend3的細(xì)胞毒性作用。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6，U87，bEnd.3細(xì)胞以1～5×10⁴個(gè)/孔加入96孔板中，過夜培養(yǎng)至貼壁，然后分別用含有相應(yīng)濃度的白蛋白-阿霉素鍵合物DMEM培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)47h 42℃培養(yǎng)1h，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，37℃，5％CO₂及飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育4h，吸出培養(yǎng)基，加入150μl的DMSO，10min后490nm酶標(biāo)儀檢測(cè)，并繪制細(xì)胞毒性圖，所得結(jié)果如圖2所示，對(duì)比圖1及圖2可以看出白蛋白-阿霉素鍵合物對(duì)C6，U87細(xì)胞的有明顯殺傷作用，對(duì)bEnd.3細(xì)胞的無明顯殺傷作用，證明白蛋白-阿霉素鍵合物在中溫條件下對(duì)正常無毒，而對(duì)腫瘤細(xì)胞存在明顯的毒性。

實(shí)施例8

本實(shí)施例動(dòng)物腫瘤模型熱化療聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)的具體方案：24只6～8周裸鼠(Balb/c)，6只一組，共分4個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行腦膠質(zhì)瘤實(shí)體腫瘤的建模，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別為：生理鹽水組(陰性對(duì)照)；聚焦超聲組(溫度控制在42℃，20min)；白蛋白-阿霉素鍵合物組；白蛋白-阿霉素鍵合物和聚焦超聲組(溫度控制在42℃，20min)。在腫瘤模型長(zhǎng)至50mm³后，將白蛋白-阿霉素鍵合物溶液(C_DOX＝2mg/kg)通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，采用聚焦超聲選擇性對(duì)小鼠腫瘤組織進(jìn)行超聲，觀察腫瘤生長(zhǎng)狀況并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，所得結(jié)果如圖3所示，從圖3中可以看出白蛋白-阿霉素鍵合物和聚焦超聲組較其他組可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。

配制0.1mg/ml(以阿霉素的量計(jì)算)的阿霉素和白蛋白-阿霉素鍵合物(實(shí)施例2)的PBS7.4的水溶液，于24小時(shí)候用照相機(jī)對(duì)這兩種溶液進(jìn)行拍照，所得結(jié)果如圖4所述，從圖4中可以看出阿霉素發(fā)生了沉淀，而白蛋白-阿霉素鍵合物在水中的呈透明狀，溶解性顯著提高。

最后說明的是：以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的實(shí)施過程和特點(diǎn)，而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)中。