本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種牙髓干細(xì)胞組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：關(guān)節(jié)炎是與年齡密切相關(guān)的常見的關(guān)節(jié)疾病，隨著老齡化社會的到來，在老年人口中骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率有增加趨勢，骨性關(guān)節(jié)炎早期病理改變?yōu)檐浌堑耐俗兗捌茐?，其發(fā)病機制尚不明確，缺乏特異性的治療手段。最終的病理過程是細(xì)胞機制合成與降解的平衡收破壞引起的關(guān)節(jié)組織破壞。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是累及關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、半月板及滑膜等整個關(guān)節(jié)組織的復(fù)雜的慢性病變，容易引起軟骨代謝的改變，這種改變起始于關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)變化，滑膜的炎癥影響和參與這個過程已被廣泛認(rèn)可?，F(xiàn)有治療方法中，比較新穎的治療措施是采用細(xì)胞生物技術(shù)進行骨關(guān)節(jié)炎的治療，其中大部分是運用胚胎干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行脊椎或是關(guān)節(jié)炎等軟骨病變相關(guān)研究。但是，這些細(xì)胞療法面臨著倫理及取材困難以及取材時對患者造成痛苦等問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于一種牙髓干細(xì)胞組合物及其應(yīng)用，使得所述組合物對骨關(guān)節(jié)炎有顯著的療效，安全性更高。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種牙髓干細(xì)胞組合物，包括牙髓干細(xì)胞、白介素-10和葡萄糖注射液。針對現(xiàn)有干細(xì)胞取材以及在治療骨關(guān)節(jié)炎效果方面欠佳的問題，本發(fā)明選用牙髓干細(xì)胞、白介素-10以及葡萄糖注射液組成新型組合物，對骨關(guān)節(jié)炎具有較為顯著的療效。其中，作為優(yōu)選，所述牙髓干細(xì)胞濃度為8.0×106-1.5×107個/ml，在本發(fā)明中的具體實施方式中，可以具體選擇1.0×107個/ml。所述牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)可按照常規(guī)方法進行，如按照文獻GronthosS,MankaniM,BrahimJ,etal.Postnatalhumandentalpulpstemcells(DPSCs)invitroandinvivo[J].ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(25):13625-13630.中記載的制備方法進行，本發(fā)明提供了如下方法：在保證牙髓未被破壞的情況下，將拔除的健康智齒或其他用于分離干細(xì)胞的牙齒立即轉(zhuǎn)移至預(yù)冷高濃度雙抗中(雙抗：鏈霉素及青霉素)，浸泡15min，用D-Hank’s液反復(fù)沖洗3次，在無菌操作臺劈開牙齒，取出牙髓組織。用眼剪把牙髓組織剪成0.3-0.5mm3塊狀，加入4mg/ml濃度的Ⅰ型膠原酶，消化至肉眼看到不成塊狀的懸液，過篩，清洗之后接種培養(yǎng)(DMEM/F12+10％FBS)，每3天換液，細(xì)胞匯合度75％-85％時進行傳代培養(yǎng)。本發(fā)明優(yōu)選采用的牙髓干細(xì)胞為傳代至第3-4代的細(xì)胞，收集方法如下：牙髓干細(xì)胞傳代到第3-4代，匯合度在85-90％時，用PBS清洗兩遍后，加入2-3mL0.25％胰酶-0.02％EDTA；置于倒置顯微鏡下觀察，80％細(xì)胞皺縮變圓時，加入5-8mL含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基終止酶解，用移液槍反復(fù)吹打細(xì)胞，直至細(xì)胞全部脫落。把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，500-700g離心4-5min。離心結(jié)束后倒棄上清液，往細(xì)胞沉淀中加入20-30mL的生理鹽水重懸細(xì)胞，500-700g離心4-5min，棄上清液(該步驟重復(fù)一次)。作為優(yōu)選，所述白介素-10的濃度為1.0-5.0ng/ml；在本發(fā)明具體實施方式中，可具體選擇3.0ng/ml。作為優(yōu)選，所述葡萄糖注射液為10％葡萄糖注射液。以本發(fā)明所述組合物為試驗對象，牙髓干細(xì)胞及10％葡萄糖為陽性對照，各組對兔骨關(guān)節(jié)炎模型進行注射治療，結(jié)果顯示，在9周的時間內(nèi)，本發(fā)明處理組下的軟骨厚度增厚速度較快，與陽性對照組呈現(xiàn)顯著性差異，表明本發(fā)明所述組合物對骨關(guān)節(jié)炎具有顯著的療效。同時，采用軟骨病理學(xué)Mankin評分對比各組的修復(fù)性，結(jié)果顯示本發(fā)明各實驗組安全性最高?；诖思夹g(shù)效果，本發(fā)明提出了所述組合物在制備治療骨關(guān)節(jié)炎中產(chǎn)品中的應(yīng)用。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明組合物選擇牙髓干細(xì)胞、白介素-10和葡萄糖注射液作為治療骨關(guān)節(jié)炎的成分，組合物組成簡單，牙髓干細(xì)胞為自體細(xì)胞，取材不受限制，并且整體對骨關(guān)節(jié)炎的效果優(yōu)于單純的牙髓干細(xì)胞和間充干細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景。附圖說明圖1所示為牙髓干細(xì)胞的直徑分布圖；圖2所示為牙髓干細(xì)胞染色鏡檢圖。具體實施方式本發(fā)明實施例公開了一種牙髓干細(xì)胞組合物及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明產(chǎn)品和應(yīng)用已通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。在本發(fā)明具體實施方式中，本發(fā)明選用普通級瞬木反射正常的健康大白兔為實驗對象，雌雄隨機選取50只(購于廣東省實驗動物中心)，兔齡4-5個月，分為陰性組，模型組、陽性對照組1、陽性對照組2及本發(fā)明實驗組，每組各10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。牙髓干細(xì)胞的提取通過拔除大白兔磨牙按照本發(fā)明提供的方法進行分離培養(yǎng)，然后進行傳代。以下就本發(fā)明所提供的一種牙髓干細(xì)胞組合物及其應(yīng)用做進一步說明。實施例1：牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和傳代1、分離和傳代大白兔在局麻的狀態(tài)下拔出一顆磨牙，在保證牙髓未被破壞的情況下，立即轉(zhuǎn)移至預(yù)冷高濃度雙抗中(雙抗：鏈霉素及青霉素)，浸泡15min，用D-Hank’s液反復(fù)沖洗3次，在無菌操作臺劈開牙齒，取出牙髓組織。用眼剪把牙髓組織剪成0.3-0.5mm3塊狀，加入4mg/ml濃度的Ⅰ型膠原酶，消化至肉眼看到不成塊狀的懸液，過篩，清洗之后接種培養(yǎng)(DMEM/F12+10％FBS)，每3天換液，細(xì)胞匯合度75％-85％時進行傳代培養(yǎng)。牙髓干細(xì)胞傳代到第3代，匯合度在85-90％時，用PBS清洗兩遍后，加入2-3mL0.25％胰酶-0.02％EDTA；置于倒置顯微鏡下觀察，80％細(xì)胞皺縮變圓時，加入5-8mL含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基終止酶解，用移液槍反復(fù)吹打細(xì)胞，直至細(xì)胞全部脫落。把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，500-700g離心4-5min。離心結(jié)束后倒棄上清液，往細(xì)胞沉淀中加入20-30mL的生理鹽水重懸細(xì)胞，500-700g離心4-5min，棄上清液(該步驟重復(fù)一次)。2、牙髓干細(xì)胞檢測牙髓干細(xì)胞收集前24h抽取培養(yǎng)液上清檢測細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素和支原體，結(jié)果均呈陰性，表明牙髓干細(xì)胞微生物量達標(biāo)；牙髓干細(xì)胞收集時對其直徑和活力進行檢測和觀察，結(jié)果見圖1和圖2，由圖1和圖2可見，牙髓干細(xì)胞在P3代時，細(xì)胞大小均勻、形態(tài)均為梭型，融合至85％時呈現(xiàn)漩渦狀。消化收集時，細(xì)胞97％拒染(死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞拒染)，細(xì)胞直徑在14-18um之間，符合牙髓干細(xì)胞體積大小分布，說明了牙髓干細(xì)胞并沒有出現(xiàn)體積變大等異?，F(xiàn)象，活力較好。牙髓干細(xì)胞表面抗原流式檢測結(jié)果顯示，牙髓干細(xì)胞高表達CD146和CD90，表達率分別為99.9％，100％；低表達CD34和CD45，表達率分別為0.1％、0.2％，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原特征，說明了牙髓干細(xì)胞并沒有出現(xiàn)分化的現(xiàn)象，仍維持著干細(xì)胞的特點。實施例2：本發(fā)明所述牙髓干細(xì)胞組合物1.0×107個/ml牙髓干細(xì)胞，3.0ng/ml白介素-10，10％葡萄糖注射液；實施例3：本發(fā)明所述牙髓干細(xì)胞組合物8.0×106個/ml牙髓干細(xì)胞，1.0ng/ml白介素-10，10％葡萄糖注射液；實施例4：本發(fā)明所述牙髓干細(xì)胞組合物1.5×107個/ml牙髓干細(xì)胞，5.0ng/ml白介素-10，10％葡萄糖注射液；實施例5：骨關(guān)節(jié)炎治療效果對比按照文獻《實驗兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型的建立及鑒定曾俊華》(馬篤軍，彭力平，何升華，余闐，陳達.中國臨床研究.2016(05)：679-682.)制作兔骨關(guān)節(jié)炎模型，造模時間為4-5周。陰性組兔不造模注射10％葡萄糖溶液，模型組兔造模并注射10％葡萄糖，陽性對照組兔造模注射牙髓干細(xì)胞及10％葡萄糖，實驗組1-3兔造模注射本發(fā)明實施例2-4組合物，各組細(xì)胞濃度相同，均以經(jīng)皮穿刺為關(guān)節(jié)區(qū)局部多點注射，每周注射一次，連續(xù)注射三周。為了評價骨關(guān)節(jié)炎形態(tài)學(xué)是否改變，在首次注射后的第1周、第3周、第6周、第9周進行一次MRI掃描，對比軟骨厚度的變化情況，結(jié)果見表1。表1MRI評價軟骨厚度(x±S，n＝3，mm)組別只數(shù)第1周第3周第6周第9周陰性組101.15±0.161.15±0.341.14±0.341.15±0.22模型組100.57±0.410.59±0.350.62±0.180.63±0.32陽性對照組100.57±0.200.60±0.330.68±0.150.70±0.21實驗組1100.56±0.450.79±0.43**0.88±0.26**1.01±0.05**實驗組2100.56±0.230.76±0.18**0.84±0.22**0.95±0.12**實驗組3100.57±0.070.75±0.13**0.84±0.08**0.96±0.14**注：**表示實驗組1,2,3分別與模型組，陽性組對照組有極顯著性差異，P<0.01；由表1可得出，陰性組的軟骨厚度在第9周內(nèi)并沒有出現(xiàn)大的變化，軟骨厚度維持在一個穩(wěn)定的水平，且厚度并沒有出現(xiàn)差異性減少。而模型組，其存在一定的自我修復(fù)機制，軟骨厚度在第9周內(nèi)有所增加，但其厚度增厚速度慢，并不能起到明顯的改善作用。陽性對照的軟骨厚度經(jīng)過9周的修復(fù)后，其軟骨厚度與模型組相比有較好的改善，但是尚未達到顯著性差異，而本發(fā)明各實驗組的軟骨厚度與陽性對照組相比均具有顯著性差異，表明本發(fā)明牙髓干細(xì)胞組合物可用于治療骨關(guān)節(jié)炎，且治療效果較好。同時，對各組進行修復(fù)情況評分，以軟骨病理學(xué)Mankin評分標(biāo)準(zhǔn)進行評述，結(jié)果見表2。表2軟骨病理學(xué)Mankin評分比較(x±S)注：**表示實驗組1,2,3分別與模型組，陽性組對照組有極顯著性差異，P<0.01；由表2可得出，陰性組的軟骨病理學(xué)Mankin評分在9周內(nèi)并沒有出現(xiàn)大的變化，軟骨組織維持在一個穩(wěn)定的水平，并沒有出現(xiàn)病理性變化。而模型組，其存在一定的自我修復(fù)機制，軟骨病理學(xué)Mankin分值在9周內(nèi)有所下降，但其改善速度慢，并不能起到明顯的改善作用。陽性對照組軟骨厚度經(jīng)過9周的修復(fù)后，其軟骨病理學(xué)Mankin分值與模型組相比更小，但是尚未達到顯著性差異；而本發(fā)明各實驗組分值雖然與陰性組相比仍具有一定差異，但是相比陽性對照組分值更小且達到顯著性差異，起到明顯的改善作用。以上所述只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3