本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種牙髓干細(xì)胞組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：關(guān)節(jié)炎是與年齡密切相關(guān)的常見的關(guān)節(jié)疾病，隨著老齡化社會(huì)的到來，在老年人口中骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率有增加趨勢(shì)，骨性關(guān)節(jié)炎早期病理改變?yōu)檐浌堑耐俗兗捌茐模浒l(fā)病機(jī)制尚不明確，缺乏特異性的治療手段。最終的病理過程是細(xì)胞機(jī)制合成與降解的平衡收破壞引起的關(guān)節(jié)組織破壞。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是累及關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、半月板及滑膜等整個(gè)關(guān)節(jié)組織的復(fù)雜的慢性病變，容易引起軟骨代謝的改變，這種改變起始于關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)變化，滑膜的炎癥影響和參與這個(gè)過程已被廣泛認(rèn)可?，F(xiàn)有治療方法中，比較新穎的治療措施是采用細(xì)胞生物技術(shù)進(jìn)行骨關(guān)節(jié)炎的治療，其中大部分是運(yùn)用胚胎干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行脊椎或是關(guān)節(jié)炎等軟骨病變相關(guān)研究。但是，這些細(xì)胞療法面臨著倫理及取材困難以及取材時(shí)對(duì)患者造成痛苦等問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于一種牙髓干細(xì)胞組合物及其應(yīng)用，使得所述組合物對(duì)骨關(guān)節(jié)炎有顯著的療效，安全性更高。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種牙髓干細(xì)胞組合物，包括牙髓干細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和葡萄糖注射液。針對(duì)現(xiàn)有干細(xì)胞取材以及在治療骨關(guān)節(jié)炎效果方面欠佳的問題，本發(fā)明選用牙髓干細(xì)胞、PBMC以及葡萄糖注射液組成新型組合物，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有較為顯著的療效。其中，作為優(yōu)選，所述牙髓干細(xì)胞濃度為5.0×106-8.0×106個(gè)/ml，在本發(fā)明中的具體實(shí)施方式中，可以具體選擇6.0×106個(gè)/ml。所述牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)可按照常規(guī)方法進(jìn)行，如按照文獻(xiàn)GronthosS,MankaniM,BrahimJ,etal.Postnatalhumandentalpulpstemcells(DPSCs)invitroandinvivo[J].ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(25):13625-13630.中記載的制備方法進(jìn)行，本發(fā)明提供了如下方法：在保證牙髓未被破壞的情況下，將拔除的健康智齒或其他用于分離干細(xì)胞的牙齒立即轉(zhuǎn)移至預(yù)冷高濃度雙抗中(雙抗：鏈霉素及青霉素)，浸泡15min，用D-Hank’s液反復(fù)沖洗3次，在無菌操作臺(tái)劈開牙齒，取出牙髓組織。用眼剪把牙髓組織剪成0.3-0.5mm3塊狀，加入4mg/ml濃度的Ⅰ型膠原酶，消化至肉眼看到不成塊狀的懸液，過篩，清洗之后接種培養(yǎng)(DMEM/F12+10％FBS)，每3天換液，細(xì)胞匯合度75％-85％時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本發(fā)明優(yōu)選采用的牙髓干細(xì)胞為傳代至第3-4代的細(xì)胞，收集方法如下：牙髓干細(xì)胞傳代到第3-4代，匯合度在85-90％時(shí)，用PBS清洗兩遍后，加入2-3mL0.25％胰酶-0.02％EDTA；置于倒置顯微鏡下觀察，80％細(xì)胞皺縮變圓時(shí)，加入5-8mL含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基終止酶解，用移液槍反復(fù)吹打細(xì)胞，直至細(xì)胞全部脫落。把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，500-700g離心4-5min。離心結(jié)束后倒棄上清液，往細(xì)胞沉淀中加入20-30mL的生理鹽水重懸細(xì)胞，500-700g離心4-5min，棄上清液(該步驟重復(fù)一次)。作為優(yōu)選，所述外周血單個(gè)核細(xì)胞的濃度為5.0×105-8.0×105個(gè)/ml；在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，可具體選擇6.0×105個(gè)/ml。本發(fā)明所述PBMC可按照常規(guī)方法提取，具體地本發(fā)明按照如下方法進(jìn)行：靜脈采集4ml抗凝血液，600g離心5min，棄除血漿，向紅細(xì)胞層加入3ml生理鹽水稀釋，緩慢混勻，取1支15ml離心管，先加入5mlFicoll溶液，再緩慢加入稀釋的血液，使稀釋的血液懸在Ficoll溶液上方。600g離心20min,吸取中間白膜細(xì)胞層，清洗3遍，待用。作為優(yōu)選，所述葡萄糖注射液為10％葡萄糖注射液。以本發(fā)明所述組合物為試驗(yàn)對(duì)象，將單個(gè)核細(xì)胞及10％葡萄糖為陽性對(duì)照，各組對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎模型進(jìn)行注射治療，結(jié)果顯示，在9周的時(shí)間內(nèi)，本發(fā)明處理組下的軟骨厚度增厚速度較快，與陽性對(duì)照組呈現(xiàn)顯著性差異，表明本發(fā)明所述組合物對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有顯著的療效。同時(shí)，采用軟骨病理學(xué)Mankin評(píng)分對(duì)比各組的修復(fù)性，結(jié)果顯示本發(fā)明各實(shí)驗(yàn)組安全性最高?；诖思夹g(shù)效果，本發(fā)明提出了所述組合物在制備治療骨關(guān)節(jié)炎中產(chǎn)品中的應(yīng)用。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明組合物選擇牙髓干細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞和葡萄糖注射液作為治療骨關(guān)節(jié)炎的成分，組合物組成簡單，牙髓干細(xì)胞和PBMC為自體細(xì)胞，沒有倫理爭(zhēng)論問題，取材不受限制，并且整體對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的效果優(yōu)于單純的牙髓干細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景。附圖說明圖1所示為牙髓干細(xì)胞的直徑分布圖；圖2所示為牙髓干細(xì)胞染色鏡檢圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例公開了一種牙髓干細(xì)胞組合物及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明產(chǎn)品和應(yīng)用已通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，本發(fā)明選用普通級(jí)瞬木反射正常的健康大白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，雌雄隨機(jī)選取50只(購于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，兔齡4-5個(gè)月，分為陰性組，模型組、陽性對(duì)照組1、陽性對(duì)照組2及本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組，每組各10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。牙髓干細(xì)胞的提取通過拔除大白兔磨牙按照本發(fā)明提供的方法進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后進(jìn)行傳代。外周血單個(gè)核細(xì)胞通過采集大白兔靜脈血按照本發(fā)明提供的方法進(jìn)行提取。以下就本發(fā)明所提供的一種牙髓干細(xì)胞組合物及其應(yīng)用做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1：牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和傳代1、分離和傳代大白兔在局麻的狀態(tài)下拔出一顆磨牙，在保證牙髓未被破壞的情況下，立即轉(zhuǎn)移至預(yù)冷高濃度雙抗中(雙抗：鏈霉素及青霉素)，浸泡15min，用D-Hank’s液反復(fù)沖洗3次，在無菌操作臺(tái)劈開牙齒，取出牙髓組織。用眼剪把牙髓組織剪成0.3-0.5mm3塊狀，加入4mg/ml濃度的Ⅰ型膠原酶，消化至肉眼看到不成塊狀的懸液，過篩，清洗之后接種培養(yǎng)(DMEM/F12+10％FBS)，每3天換液，細(xì)胞匯合度75％-85％時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。牙髓干細(xì)胞傳代到第3代，匯合度在85-90％時(shí)，用PBS清洗兩遍后，加入2-3mL0.25％胰酶-0.02％EDTA；置于倒置顯微鏡下觀察，80％細(xì)胞皺縮變圓時(shí)，加入5-8mL含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基終止酶解，用移液槍反復(fù)吹打細(xì)胞，直至細(xì)胞全部脫落。把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，500-700g離心4-5min。離心結(jié)束后倒棄上清液，往細(xì)胞沉淀中加入20-30mL的生理鹽水重懸細(xì)胞，500-700g離心4-5min，棄上清液(該步驟重復(fù)一次)。2、牙髓干細(xì)胞檢測(cè)牙髓干細(xì)胞收集前24h抽取培養(yǎng)液上清檢測(cè)細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素和支原體，結(jié)果均呈陰性，表明牙髓干細(xì)胞微生物量達(dá)標(biāo)；牙髓干細(xì)胞收集時(shí)對(duì)其直徑和活力進(jìn)行檢測(cè)和觀察，結(jié)果見圖1和圖2，由圖1和圖2可見，牙髓干細(xì)胞在P3代時(shí)，細(xì)胞大小均勻、形態(tài)均為梭型，融合至85％時(shí)呈現(xiàn)漩渦狀。消化收集時(shí)，細(xì)胞98％拒染(死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞拒染)，細(xì)胞直徑在14-18um之間，符合牙髓干細(xì)胞體積大小分布，說明了牙髓干細(xì)胞并沒有出現(xiàn)體積變大等異?，F(xiàn)象，活力較好。牙髓干細(xì)胞表面抗原流式檢測(cè)結(jié)果顯示，牙髓干細(xì)胞高表達(dá)CD146和CD90，表達(dá)率均為100％；低表達(dá)CD34和CD45，表達(dá)率分別為0.4％、0.2％，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原特征，說明了牙髓干細(xì)胞并沒有出現(xiàn)分化的現(xiàn)象，仍維持著干細(xì)胞的特點(diǎn)。實(shí)施例2：外周血單個(gè)核細(xì)胞的提取大白兔腿部靜脈采集4ml抗凝血液，600g離心5min，棄除血漿，向紅細(xì)胞層加入3ml生理鹽水稀釋，緩慢混勻，取1支15ml離心管，先加入5mlFicoll溶液，再緩慢加入稀釋的血液，使稀釋的血液懸在Ficoll溶液上方。600g離心20min,吸取中間白膜細(xì)胞層，清洗3遍，待用。實(shí)施例3：本發(fā)明所述牙髓干細(xì)胞組合物6.0×106個(gè)/ml牙髓干細(xì)胞，6.0×105個(gè)/ml外周血單個(gè)核細(xì)胞，10％葡萄糖注射液；實(shí)施例4：本發(fā)明所述牙髓干細(xì)胞組合物8.0×106個(gè)/ml牙髓干細(xì)胞，5.0×105個(gè)/ml外周血單個(gè)核細(xì)胞，10％葡萄糖注射液；實(shí)施例5：本發(fā)明所述牙髓干細(xì)胞組合物5.0×106個(gè)/ml牙髓干細(xì)胞，8.0×105個(gè)/ml外周血單個(gè)核細(xì)胞，10％葡萄糖注射液；實(shí)施例6：骨關(guān)節(jié)炎治療效果對(duì)比按照文獻(xiàn)《實(shí)驗(yàn)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型的建立及鑒定曾俊華》(馬篤軍，彭力平，何升華，余闐，陳達(dá).中國臨床研究.2016(05)∶679-682.)制作兔骨關(guān)節(jié)炎模型，造模時(shí)間為4-5周。陰性組兔不造模注射10％葡萄糖溶液，模型組兔造模并注射10％葡萄糖，陽性對(duì)照組1兔造模注射牙髓干細(xì)胞及10％葡萄糖，陽性對(duì)照組2兔造模注射單個(gè)核細(xì)胞及10％葡萄糖，實(shí)驗(yàn)組1-3兔造模注射本發(fā)明實(shí)施例3-5組合物，各組細(xì)胞濃度相同，均以經(jīng)皮穿刺為關(guān)節(jié)區(qū)局部多點(diǎn)注射，每周注射一次，連續(xù)注射三周。為了評(píng)價(jià)骨關(guān)節(jié)炎形態(tài)學(xué)是否改變，在首次注射后的第1周、第3周、第6周、第9周進(jìn)行一次MRI掃描，對(duì)比軟骨厚度的變化情況，結(jié)果見表1。表1MRI評(píng)價(jià)軟骨厚度(x±S，n＝3，mm)注：**表示實(shí)驗(yàn)組1,2,3分別與模型組，陽性組對(duì)照組有極顯著性差異，P<0.01；由表1可以看出，陰性組的軟骨厚度在第9周內(nèi)并沒有出現(xiàn)大的變化，軟骨厚度維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，且厚度并沒有出現(xiàn)差異性減少。而模型組，其存在一定的自我修復(fù)機(jī)制，軟骨厚度在第9周內(nèi)有所增加，但其厚度增厚速度慢，并不能起到明顯的改善作用。陽性對(duì)照的軟骨厚度經(jīng)過9周的修復(fù)后，其軟骨厚度與模型組相比有較好的改善，但是尚未達(dá)到顯著性差異，而本發(fā)明各實(shí)驗(yàn)組的軟骨厚度與陽性對(duì)照組相比均具有顯著性差異，表明本發(fā)明牙髓干細(xì)胞組合物可用于治療骨關(guān)節(jié)炎，且治療效果較好。同時(shí)，對(duì)各組進(jìn)行修復(fù)情況評(píng)分，以軟骨病理學(xué)Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)述，結(jié)果見表2。表2軟骨病理學(xué)Mankin評(píng)分比較(x±S)組別只數(shù)第1周第3周第6周第9周陰性組101.40±0.121.50±0.181.43±0.241.47±0.21模型組105.31±0.575.23±0.325.16±0.184.90±0.28陽性對(duì)照組1105.30±0.325.12±0.184.99±0.224.20±0.17陽性對(duì)照組2105.31±0.345.20±0.285.07±0.214.62±0.24實(shí)驗(yàn)組1105.30±0.254.06±0.37**3.23±0.26**2.76±0.27**實(shí)驗(yàn)組2105.31±0.384.51±0.20**3.78±0.14**3.01±0.32**實(shí)驗(yàn)組3105.30±0.424.14±0.19**3.45±0.09**2.98±0.04**注：**表示實(shí)驗(yàn)組1,2,3分別與模型組，陽性組對(duì)照組有極顯著性差異，P<0.01；由表2可知，陰性組的軟骨病理學(xué)Mankin評(píng)分在9周內(nèi)并沒有出現(xiàn)大的變化，軟骨組織維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，并沒有出現(xiàn)病理性變化。而模型組，其存在一定的自我修復(fù)機(jī)制，軟骨病理學(xué)Mankin分值在9周內(nèi)有所下降，但其改善速度慢，并不能起到明顯的改善作用。陽性對(duì)照組軟骨厚度經(jīng)過9周的修復(fù)后，其軟骨病理學(xué)Mankin分值與模型組相比更小，但是尚未達(dá)到顯著性差異；而本發(fā)明各實(shí)驗(yàn)組分值雖然與陰性組相比仍具有一定差異，但是相比陽性對(duì)照組分值更小且達(dá)到顯著性差異，起到明顯的改善作用。以上所述只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3