本發(fā)明屬于生物材料合成技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種具有磁-ph值雙響應(yīng)的藥物載體的制備方法。

背景技術(shù)：

在緩控釋及靶向藥物載體發(fā)展的基礎(chǔ)上，應(yīng)答式制劑能根據(jù)人體生理、病理變化做出響應(yīng)而釋放藥物，是新一代智能化藥物載體。藥物輸運(yùn)體系的智能化要求載體材料具有環(huán)境敏感性，即對(duì)外部刺激（如磁場(chǎng)、超聲、光、熱等）或生理環(huán)境變化（如ph值、溫度、氧化還原環(huán)境等）的響應(yīng)性。雙智能化因子的引入，使藥物載體能夠同時(shí)對(duì)外部刺激及生理環(huán)境做出響應(yīng)，是應(yīng)答式制劑開(kāi)發(fā)的有效途徑之一。

磁響應(yīng)材料能夠?qū)ν獠看艌?chǎng)做出迅速響應(yīng)，通過(guò)控制外部磁信號(hào)，啟動(dòng)刺激-響應(yīng)性控制釋放模式。fe3o4是常用磁性納米粒子之一，具有穩(wěn)定、靶向性強(qiáng)及生物相容性好等特點(diǎn)，且制備方法已相當(dāng)成熟，在靶向藥物載體領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

ph響應(yīng)性載體是在體內(nèi)偏酸或偏堿的特定情況下，載體性能發(fā)生變化，從而響應(yīng)性地釋放藥物的一種給藥系統(tǒng)。在細(xì)菌感染導(dǎo)致的炎癥案例中，炎癥因子引起神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能障礙以及炎癥區(qū)血液循環(huán)障礙，促使局部組織改變，ph降低，k⁺增多。由于炎癥區(qū)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解代謝增強(qiáng)，氧化不完全產(chǎn)物增多，ph降低，導(dǎo)致失償性酸中毒。隨著炎癥加劇，中心部位h⁺可增加50倍，化膿性炎癥的ph可達(dá)到6.5-5.6。另一方面，納米藥物通常通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，而細(xì)胞內(nèi)涵體與溶酶體的環(huán)境為酸性（約4-6.5）。使用對(duì)內(nèi)涵體膜具有響應(yīng)性的ph敏感高分子材料制備納米藥物制劑，可有效抑制經(jīng)由內(nèi)化途徑進(jìn)入細(xì)胞的溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)模式，這對(duì)提高藥物特別是易降解的生物大分子的生物利用度和抑制細(xì)胞的抗藥反應(yīng)具有重要作用。β-環(huán)糊精（β-cd）是一種具有ph響應(yīng)性的天然高分子：在酸性條件下（ph<5），cd錐形腔體結(jié)構(gòu)被破壞；在堿性條件下（ph>8.5），cd結(jié)構(gòu)往往只變得不規(guī)則。利用這一特性，可以實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)對(duì)某些病灶部位靶向控釋的目的。

疏水性藥物的生物利用率低，在一定程度限制了其臨床應(yīng)用。β-cd能識(shí)別許多帶有疏水基團(tuán)的化合物并與之形成主客體包合物，在藥物載體等領(lǐng)域中有著廣泛應(yīng)用。尺寸合適的難溶性藥物能進(jìn)入β-cd疏水空腔，與β-cd形成包合物，增加包合物的潤(rùn)濕性，從而增加疏水性藥物的水溶性和生物利用度。

因此，尋求一種能將β-cd與疏水性抗菌藥物進(jìn)行有效包合的藥物載體，且同時(shí)具備較高的藥物包載率和磁-ph響應(yīng)性，具有極大的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種具有磁-ph值雙響應(yīng)的藥物載體的制備方法。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種具有磁-ph值雙響應(yīng)藥物載體的制備方法，包括如下步驟：

s1.將fe3o4納米粒子與乙醇、水混合，加入原硅酸四乙酯反應(yīng)，得到fe3o4@sio2復(fù)合納米粒子；

s2.將β-cd加入硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行改性，得到改性β-cd；

s3.將s1中fe3o4@sio2復(fù)合納米粒子與s2中改性β-cd反應(yīng)，得到fe3o4@sio2/β-cd磁性復(fù)合納米材料；

s4.將s3中fe3o4@sio2/β-cd磁性復(fù)合納米材料加入到聚乙二醇溶液中反應(yīng)，得到fe3o4@sio2/β-cd@peg復(fù)合材料；

s5.將β-cd和s4中fe3o4@sio2/β-cd@peg復(fù)合材料加入溶液中，超聲，于4℃條件下靜置反應(yīng)12~24h，清洗，離心，收集沉淀，干燥后得到fe3o4@sio2/β-cd@peg/β-cd；

s1中，fe3o4納米粒子與原硅酸四乙酯的質(zhì)量體積比為1:(5~15)；反應(yīng)中fe3o4的質(zhì)量濃度為0.05~0.15g/l；

s2中，β-cd與硅烷偶聯(lián)劑的質(zhì)量體積比為1:(1~3)；β-cd的質(zhì)量濃度為45~55g/l；

s3中，fe3o4@sio2復(fù)合納米粒子與s2中β-cd的質(zhì)量比為1:(2~4)；

s5中，β-cd和fe3o4@sio2/β-cd@peg的質(zhì)量比為(8~12):1。

優(yōu)選地，s1中，fe3o4納米粒子與原硅酸四乙酯的質(zhì)量體積比為1:10；反應(yīng)中fe3o4納米粒子的質(zhì)量濃度為0.1g/l。

優(yōu)選地，s2中，β-cd與硅烷偶聯(lián)劑的質(zhì)量體積比為2.5:4；β-cd的質(zhì)量濃度為50g/l；

s3中，fe3o4@sio2復(fù)合納米粒子與s2中β-cd的質(zhì)量比為1:2.5；

s5中，β-cd和fe3o4@sio2/β-cd@peg的質(zhì)量比為10:1。

優(yōu)選地，s1中，fe3o4納米粒子進(jìn)行分散后再與原硅酸四乙酯反應(yīng)，分散處理為將fe3o4納米粒子放入0.1m的鹽酸溶液中進(jìn)行超聲處理，然后清洗。

優(yōu)選地，s1中原硅酸四乙酯反應(yīng)前，加入少量氨水。其中，乙醇和水的體積比為4:1。

優(yōu)選地，s2中具體改性步驟為：將β-cd溶解于二甲基甲酰胺中，加入少量氫化鈉，室溫?cái)嚢?5min，過(guò)濾，加入硅烷偶聯(lián)劑，在90℃氮?dú)鈼l件下反應(yīng)4~6h。

更優(yōu)選地，所述硅烷偶聯(lián)劑為kh-560。

優(yōu)選地，s3中加入少量氨水反應(yīng)10~15h。

優(yōu)選地，s5中，將fe3o4@sio2/β-cd@peg復(fù)合材料加入到β-cd的二甲基甲酰胺飽和溶液中，室溫下超聲10min，于4℃靜置過(guò)夜，施加磁場(chǎng)得到反應(yīng)物，用二甲基甲酰胺溶液、水、乙醇依次清洗反應(yīng)物，在3200r/min離心10min，收集沉淀。

優(yōu)選地，s1中采用化學(xué)共沉淀法制備fe3o4納米粒子的方法為：將二價(jià)鐵鹽和三價(jià)鐵鹽混合，加入氨水，攪拌，分離，洗滌，再加入水和聚乙二醇，超聲混勻，于80℃加熱熟化30min。

優(yōu)選地，采用現(xiàn)有的化學(xué)共沉淀法制備fe3o4納米粒子。

本發(fā)明提供的制備方法制備得到的載體，可以與疏水類藥物按一定濃度比例混溶，得到包覆該疏水類藥物的磁導(dǎo)向藥物載體。

所述疏水類藥物包括但不限于紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、麥迪霉素、吉他霉素、乙酰螺旋霉素素。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單、成本低廉，可制備得到具有磁性及ph雙響應(yīng)效果的應(yīng)答式載藥體系。該藥物載體可在外加磁場(chǎng)下，靶向定位炎癥病灶部位（弱酸性），β-cd結(jié)構(gòu)破壞，藥物快速釋放；而在人體正常組織（中性ph），β-cd結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，藥物釋放緩慢，實(shí)現(xiàn)藥物對(duì)內(nèi)環(huán)境ph的響應(yīng)及控制釋放。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1~3中磁性納米材料的傅里葉紅外圖譜。

圖2為實(shí)施例3中fe3o4@sio2/β-cd@peg/β-cd載體的粒徑分布和掃描電鏡圖。

圖3為實(shí)施例1~2中fe3o4、fe3o4@sio2、fe3o4@sio2/β-cd磁性納米粒子的x射線衍射圖。

圖4為實(shí)施例1~3中磁性納米材料的磁滯曲線和磁響應(yīng)效果示意圖。

圖5為實(shí)施例2~3中fe3o4@sio2/β-cd和fe3o4@sio2/β-cd@peg/β-cd載體的水溶液穩(wěn)定性效果示意圖。

圖6為實(shí)施例2~3中fe3o4@sio2/β-cd和fe3o4@sio2/β-cd@peg/β-cd載體在不同ph的pbs溶液中藥物釋放曲線。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例和附圖來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說(shuō)明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購(gòu)。

名稱縮寫(xiě)：

fe3o4@sio2為simnp

fe3o4@sio2/β-cd為cdmnp

fe3o4@sio2/β-cd@peg/β-cd為cdmnp-peg-cd

cd為β-cd

實(shí)施例1：

采用化學(xué)共沉淀法制備fe3o4納米粒子。將fe²⁺和fe³⁺按物質(zhì)的量比1:2混合，加入過(guò)量氨水，在一定溫度下（約50℃）攪拌30min，磁鐵分離沉淀，0.5%氨水洗滌，沉淀，加適量去離子水及0.5g聚乙二醇，超聲混勻，于80℃加熱熟化30min（600r/min），去離子水反復(fù)洗滌，得黑色磁流體取fe3o4納米粒子放入鹽酸溶液（0.1m），超聲分散，去離子水清洗3次。simnp復(fù)合納米粒子的制備。取0.01g潔凈的fe3o4納米粒子，置入100ml乙醇溶液（乙醇與去離子水的體積比4:1），機(jī)械攪拌，滴加1ml氨水（25%），再滴加0.1ml原硅酸四乙酯，室溫?cái)嚢?2h；施加磁場(chǎng)富集吸出納米粒子，去離子水和乙醇漂洗3次，于60℃真空干燥12h，得棕黑色simnp復(fù)合納米粒子。

實(shí)施例2：

cdmnp磁性復(fù)合納米材料的制備。取2.5gβ-cd溶于50ml二甲基甲酰胺，加入0.5g氫化鈉，室溫?cái)嚢?5min，過(guò)濾，得白色透明溶液，加入4mlkh-560，于90℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌5h，。冷卻至室溫，得改性β-cd；加入1gsimnp，滴加1.5ml氨水（25%），室溫?cái)嚢?2h，磁鐵富集吸出，依次用二甲基甲酰胺、去離子水和乙醇漂洗3次，于50℃真空干燥12h，得棕黑色cdmnp磁性復(fù)合納米材料。

實(shí)施例3：

cdmnp-peg-cd載體的制備。取適量cdmnp磁性復(fù)合納米粒子，置于20%聚乙二醇溶液，室溫機(jī)械攪拌24h；產(chǎn)物富集吸出，水洗，真空干燥，得cdmnp-peg復(fù)合材料。取0.05gcdmnp-peg復(fù)合材料，置于0.5gβ-cd的二甲基甲酰胺飽和溶液，室溫超聲10min，于4℃靜置過(guò)夜；磁富集吸出，用二甲基甲酰胺、蒸餾水、乙醇清洗各1次,離心10min（3200r/min），磁吸附收集沉淀；此過(guò)程重復(fù)3次，以除去殘余的β-cd和cdmnp-peg復(fù)合材料。沉淀真空干燥，封存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例4：

針對(duì)實(shí)施例1~3制備得到的載體進(jìn)行紅外檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1所示。其中，a~d分別為mnp，simnp，cdmnp和cdmnp-peg-cd。對(duì)比mnp的紅外光譜（a），simnp（b）在802.6cm^-1出現(xiàn)si-o-si的對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，958.4cm^-1為si-o-h的特征峰，1097.3cm^-1為si-o-si反對(duì)稱伸縮振動(dòng)的吸收峰。結(jié)果表明，sio2已經(jīng)成功包覆fe3o4。cdmnp的紅外光譜（c）中，799.6cm^-1、958.4cm^-1及1091.6cm^-1為sio2的特征峰；3439.3cm^-1為-oh的伸縮振動(dòng)吸收峰，峰強(qiáng)度降低；2926.4cm^-1和1086.0cm^-1分別是cd烷烴鏈中c-h和c-o的伸縮振動(dòng)峰，表明β-cd已經(jīng)成功接枝到simnp表面。cdmnp-peg-cd的紅外光譜（d）中，2942cm^-1是cd烷烴鏈中c-h的伸縮振動(dòng)峰，2870.0cm^-1是聚乙二醇端羥基的伸縮振動(dòng)峰，證實(shí)復(fù)合材料中引入了聚乙二醇。

實(shí)施例5：

采用納米激光粒度儀對(duì)實(shí)施例3制備得到的cdmnp-peg-cd載體（圖2a）的粒徑分布，粒徑約為334nm，cv為0.56%。圖2（b）為cdmnp-peg-cd載體的掃描電鏡圖，可見(jiàn)粒徑均勻的復(fù)合磁性納米顆粒。

實(shí)施例6：

針對(duì)實(shí)施例1~2制備得到的mnp、simnp以及cdmnp復(fù)合納米粒子進(jìn)行x-射線衍射分析，如圖3所示。simnp和cdmnp仍保留mnp的特征峰，說(shuō)明四氧化三鐵納米粒子的晶體結(jié)構(gòu)在包埋前后沒(méi)有發(fā)生明顯改變；在2θ=27~29°處的寬峰是核殼結(jié)構(gòu)中無(wú)定形sio2殼層的特征峰。選取cdmnp的最強(qiáng)衍射峰(311)，由scherrer公式計(jì)算出的平均粒徑為78.32nm，與粒度儀測(cè)得的粒徑數(shù)據(jù)接近。

d=0.9λ/bcosθ

式中d為粒子平均直徑/nm，0.9為scherrer常數(shù)，λ為x-射線波長(zhǎng)0.154nm，b為衍射峰的半高寬，θ為衍射角/rad。

實(shí)施例7：

針對(duì)實(shí)施例1~3制備得到的載體進(jìn)行磁性分析，結(jié)果見(jiàn)圖4所示。mnps、cdmnp、cdmnp-peg-cd三種磁性納米顆粒的磁滯回線（b）均是由磁化曲線和退磁曲線重合而構(gòu)成的單一曲線，表明本發(fā)明后續(xù)的改性方法未對(duì)材料的磁性產(chǎn)生不利影響，未顯示磁滯現(xiàn)象，仍具有典型的超順磁行為。三者的飽和磁化強(qiáng)度約為46.89emu/g，磁響應(yīng)性較好。磁性直觀示意圖如圖4（a）所示。分散良好的cdmnp水溶液，在玻璃瓶壁放置一磁鐵，3min內(nèi)復(fù)合磁性粒子貼壁富集，水溶液變得澄清，表明良好的磁響應(yīng)性。

實(shí)施例8：

針對(duì)實(shí)施例2~3制備得到的載體的水溶液穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)試，如圖5所示。分別取1gcdmnp和cdmnp-peg-cd，置于適量蒸餾水，超聲30min，靜置觀察。cdmnp-peg-cd溶液穩(wěn)定，40min時(shí)依然有良好的分散性，直至3h才沉降較完全。而cdmnp在40min時(shí)顯著沉降，穩(wěn)定性較差。由此可知，cdmnp-peg-cd明顯改善了水溶液的穩(wěn)定性，能更好的應(yīng)用于人體的體內(nèi)環(huán)境。

實(shí)施例9

針對(duì)實(shí)施例2~3制備得到的cdmnp和cdmnp-peg-cd載體的載藥量進(jìn)行分析。取一定量cdmnp和cdmnp-peg-cd載體，加入到1ml5mg/ml羅紅霉素（rox）的乙醇溶液，振蕩8h，磁鐵吸附材料，取上清，用光度法測(cè)濃度。結(jié)果表明，1mgcdmnp-peg-cd載體對(duì)rox的包封量為0.132mg，明顯高于cdmnp載體對(duì)rox的包封量0.072mg。

針對(duì)實(shí)施例2~3制備得到的cdmnp（圖6a）和cdmnp-peg-cd（圖6b）載體的藥物釋放進(jìn)行分析，如圖6所示。取負(fù)載rox的載體，投入不同ph的pbs溶液，測(cè)定特定時(shí)間的藥物濃度，繪制藥物釋放曲線。相比cdmnp載體，cdmnp-peg-cd載體的最大藥物釋放量有所提高，且在酸性條件下，20min內(nèi)載體可釋放近80%的藥物(圖6b)，而堿性條件下藥物釋放速率受到抑制。如釋藥30min時(shí)，cdmnp-peg-cd載體在ph=1時(shí)的藥物釋放量為ph=7.4時(shí)的1.6倍，為ph=8時(shí)的2.0倍；ph=4時(shí)藥物釋放量為ph=7.4的1.3倍，為ph=8時(shí)的1.6倍，表明良好的ph響應(yīng)性，實(shí)現(xiàn)藥物對(duì)內(nèi)環(huán)境ph的響應(yīng)及控制釋放。