本發(fā)明涉及的是一種藥物制劑，尤其涉及一種用于治療自身免疫性皮膚病的外用藥物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

銀屑病是一種常見的慢性皮膚病，又稱牛皮癬。其特征是出現(xiàn)大小不等的丘疹，紅斑，表面覆蓋著白色鱗屑，邊界清楚，好發(fā)于頭皮，四肢伸側(cè)及背部。春冬季節(jié)易復(fù)發(fā)或加重，而夏秋季多緩解。目前此病無法徹底治愈，所用治療方法可能只有控制病情的作用。

玫瑰糠疹是常見的炎癥性皮膚病，好發(fā)于軀干和四肢近端大小不等，數(shù)目不定玫瑰色斑片，其上有糖狀鱗屑，本病有自限性，一般持續(xù)6～8周而自愈。但也有經(jīng)久不愈的情況，由于很多玫瑰糠疹患者延誤治療后容易遺留難看的色素沉著。

多形性紅斑是急性自限性炎癥性皮膚病，病變處的組織內(nèi)有較多的滲出液出現(xiàn)，故本病又名滲出性多形紅斑或多形滲出性紅斑，重癥稱史-約綜合征。多形紅斑以高出皮膚呈靶形的紅斑為特征的復(fù)發(fā)性皮膚病，常對稱分布。皮疹呈多形性，典型損害為靶形或虹膜狀損害?？捎啥喾N原因所致，可與感染細菌、病毒(特別是單純泡疹病毒)、霉菌、原蟲有關(guān)，也可由某些藥物，如磺胺類、巴妥類、水楊酸鹽類及生物制品致病。

對于以上自身免疫性皮膚病，市場上多采用內(nèi)服和外用療法，糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗生素、抗組織胺藥物等化學(xué)藥物和激素，以及爐甘石洗劑外涂。激素類和抗生素的長期使用，產(chǎn)生毒副作用影響健康，部分皮膚病反復(fù)發(fā)作、再加上皮損，導(dǎo)致病原菌感染就更難以達到較好的療效。所以有必要開發(fā)一種效果顯著、廣譜性的藥物治療自身免疫性類的皮膚病。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種用于治療自身免疫性皮膚病的外用藥物及其制備方法和應(yīng)用，以解決現(xiàn)有藥物作用單一，療效不夠理想，部分皮膚病反復(fù)發(fā)作，無法根治，且毒副作用大等技術(shù)問題。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種用于治療自身免疫性皮膚病的外用藥物，其組分包括質(zhì)量比為20％-100％的NK細胞原液。

進一步地，所述外用藥物為一種液體制劑，命名為SNK液，所述SNK液的組分及其質(zhì)量百分比包括：NK細胞原液80.0-95.0％、甘油1.0-2.0％、硼砂0.05-0.08％、羥苯乙酯0.01-0.03％，溶劑為水。

進一步地，所述外用藥物為一種膏狀制劑，命名為SNK膏，所述SNK膏的組分及其質(zhì)量百分比包括：NK細胞原液65.0-75.0％白凡士林1.0-10.0％、單、雙硬脂酸甘油酯3.0-10.0％、對羥基苯甲酸乙酯0.01-0.5％、硼砂0.08-0.5％、二甲亞砜0.5-5.0％、山梨酸1.0-10.0％，余量為水。

本發(fā)明還提供了上述治療自身免疫性皮膚病的外用藥物的制備方法，包括以下步驟：

(1)取NK細胞進行擴增培養(yǎng)，獲得NK細胞原液；

(2)將NK細胞原液與外用藥物輔料混合，制備獲得所述外用藥物。

進一步地，若所述藥物為液體制劑時，所述NK細胞原液的質(zhì)量百分比為80.0-95.0％，所述輔料及其質(zhì)量百分比包括：甘油1.0-2.0％、硼砂0.05-0.08％、羥苯乙酯0.01-0.03％，溶劑為水；若所述藥物為膏狀制劑時，所述NK細胞原液的質(zhì)量百分比為65.0-75.0％，所述輔料及其質(zhì)量百分比包括：白凡士林1.0-10.0％、單、雙硬脂酸甘油酯3.0-10.0％、對羥基苯甲酸乙酯0.01-0.5％、硼砂0.08-0.5％、二甲亞砜0.5-5.0％、山梨酸1.0-10.0％，余量為水。

進一步地，所述NK細胞擴增培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：

步驟一：取新鮮血液，提取血液中的外周血單核細胞(以下簡稱PBMC)；

步驟二：在RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的慶大霉素和10％重量百分比的胎牛血清，獲得NK細胞培養(yǎng)液；

步驟三：取3.0×10⁷-4.0×10⁷個PBMC于一細胞培養(yǎng)瓶中，加入20-30ml的NK細胞培養(yǎng)液和2ml的濃度為1.0×10⁷個/ml的NK擴增試劑，獲得起始培養(yǎng)液；

步驟四：將NK細胞接種于起始培養(yǎng)液中培養(yǎng)1-2天，培養(yǎng)期間根據(jù)細胞生長狀態(tài)添加NK細胞培養(yǎng)液；當(dāng)培養(yǎng)至第3天時，將培養(yǎng)液離心，獲得的細胞沉淀中加入NK細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；

步驟五：當(dāng)NK細胞數(shù)量達1.5×10⁸個/瓶以上時，加入2支的NK擴增試劑和NK細胞培養(yǎng)液進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中根據(jù)細胞生長狀態(tài)增加NK細胞培養(yǎng)液并進行分袋培養(yǎng)，使細胞濃度在1.0×10⁶個/ml，當(dāng)培養(yǎng)至第12天時，控制加液量，使細胞濃度為2.0×10⁶個/ml；

步驟六：繼續(xù)培養(yǎng)至第14天后，收集細胞培養(yǎng)液，獲得NK細胞原液。

本發(fā)明還提供了上述外用藥物在作為自身免疫性皮膚病治療藥物中的應(yīng)用。

進一步地，將NK細胞原液與不同的外用藥物輔料混合，制備獲得外用液體制劑和外用膏狀制劑，在使用上述外用藥物治療自身免疫性皮膚病時，先用外用液體制劑涂抹或噴液于患處，再用外用膏狀制劑涂抹患處，進行混合使用治療，可保持藥效能夠很好地讓皮膚吸收，達到最佳治療效果，混合治療數(shù)次后，癥狀即可減輕或消失。

本發(fā)明的原理為：NK細胞(natural killer cell，自然殺傷細胞)是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在一些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。本生物制劑采用NK細胞原液治療病原體感染性皮膚病，NK細胞原液的主要成分是NK細胞分泌的生長因子，包括MIP-1α、MIP-1β、RANTES、單核細胞趨化蛋白、白介素(如IL-2)、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、干擾素以及穿孔素等抗炎、抗病毒及高效活性因子，參與炎癥反應(yīng)，通過抑制過敏反應(yīng)物質(zhì)、慢反應(yīng)物質(zhì)等的釋放，發(fā)揮治療效果。使用后，可在皮膚表面形成保護膜，有利于損傷修復(fù)，預(yù)防真菌和細菌的再次感染。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種用于治療自身免疫性皮膚病的外用藥物及其制備方法和應(yīng)用，該外用藥物的抗炎、抗病毒及高效活性因子，可確保藥物活性成分安全有效地抵達病灶，清除病因，并可迅速止痛緩解癥狀。使用時，可形成皮膚保護膜，有利于損傷修復(fù)。對于銀屑病、玫瑰糠疹和多形性紅斑等自身免疫性皮膚病，炎癥因子通過穩(wěn)定細胞膜，抑制過敏反應(yīng)物質(zhì)、慢反應(yīng)物質(zhì)等的釋放，達到止癢、消炎的目的。并且使用方便，長期使用無毒副作用，特別是對于皮膚敏感者、嬰幼兒、孕婦等，不適宜用其它種類藥物、激素的特殊人群也同樣適用。

具體實施方式

實施例1

1、材料：

本實施例所用方法如無特別說明均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉的常規(guī)方法，所用的試劑等材料，如無特別說明，均為市售購買產(chǎn)品。

2、方法

2.1制備NK細胞原液

步驟一：PBMC提?。?/p>

將新鮮血液于740g離心10分鐘，獲得上層淡黃色血漿和下層血細胞，將下層血細胞與生理鹽水按照體積比1：1混合，取50ml離心管，將稀釋的血細胞懸液鋪在15ml淋巴細胞分離液上，400g離心30分鐘。收集中間白色膜狀細胞層，加入生理鹽水洗滌，400g離心10分鐘，棄上清液，重復(fù)洗滌一次。最后用適量培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，即獲得PBMC。

步驟二：NK細胞培養(yǎng)液的制備：

在Gibco RPMI Medium 1640basic培養(yǎng)液(購買于美國GIBCO公司)中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的慶大霉素和10％重量百分比的Gibco FBS(購買于美國GIBCO公司)，獲得NK細胞培養(yǎng)液。

步驟三：NK細胞起始培養(yǎng)液的制備：

取3.0×10⁷-4.0×10⁷個PBMC于一T75培養(yǎng)瓶中，加入20-30ml的NK細胞培養(yǎng)液和1支NK擴增試劑，其中，所述NK擴增試劑為一種CD8α-白介素21-CD137復(fù)合物(參見中國專利文獻CN102154207A)，可直接通過市場購買的方式獲得，本發(fā)明使用的NK擴增試劑的產(chǎn)品規(guī)格為2ml/支，濃度為1×10⁷個/ml。

步驟四：NK細胞起始培養(yǎng)：

將NK細胞接種于上述T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，其中：

第1、2天注意觀察細胞。如果細胞狀態(tài)良好可不處理。若細胞密度明顯加大，可加NK細胞培養(yǎng)液10ml。

第3天將培養(yǎng)液離心，獲得的細胞沉淀轉(zhuǎn)移至新的T75培養(yǎng)瓶中，并加入30ml的NK細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

第4天觀察細胞，若細胞狀態(tài)良好，可不做處理，如果細胞密度過大，可酌情加NK細胞培養(yǎng)液。

第5天，若第4天未處理，且細胞狀態(tài)良好，密度大，則加入NK細胞培養(yǎng)液20ml。

第6天觀察細胞，根據(jù)細胞密度添加培養(yǎng)液30-50ml。

步驟五：NK細胞擴大培養(yǎng)：

第7天計數(shù)，若細胞數(shù)量大于1.5×10⁸個/瓶，則加入2支NK擴增試劑，若細胞數(shù)量在30-60百萬，則長至第8天再添加NK擴增試劑。然后添加NK細胞培養(yǎng)液，使總細胞濃度在1.0×10⁶個/ml。隨培養(yǎng)體積逐步增大，可轉(zhuǎn)入T175培養(yǎng)方瓶擴大體積培養(yǎng)，培養(yǎng)液體積大于120ml或細胞數(shù)量大于2.0×10⁸個/瓶時，則可以轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋培養(yǎng)。

第8-11天每天觀察細胞，使得細胞濃度在1.0×10⁶個/ml左右，通過計數(shù)添加培養(yǎng)液，使得細胞濃度在1.0×10⁶個/ml。

第12-14天每天觀察，當(dāng)細胞數(shù)量大于3.0×10⁹個/袋，并且體積大于1200ml時，將細胞分為2袋。

步驟六：收集NK細胞原液：

當(dāng)細胞生長至所需數(shù)量時即可進行收集使用或凍存。一般情況下，14或15天收集細胞，因為此時細胞處于對數(shù)生長期，狀態(tài)最好，越往后細胞狀態(tài)會緩慢下滑，此時細胞可到3×10⁹個以上，NK細胞(CD3-CD56+)純度可達到80％以上。

2.2制備SNK液：

按重量計，取NK細胞原液95.0％、甘油1.0％、硼砂0.05％、羥苯乙酯0.01％和適量無菌水，混勻后滅菌分裝，獲得所述SNK液。

2.3制備SNK膏：

按重量計，取NK細胞原液75.0％、白凡士林10.0％、單、雙硬脂酸甘油酯10.0％、對羥基苯甲酸乙酯0.5％、硼砂0.5％、二甲亞砜5.0％、山梨酸10.0％和適量無菌水，混勻后滅菌分裝，獲得所述SNK膏。

3、臨床驗證

將臨床實驗分成3組進行，具體為：

實驗組1：選若干自身免疫性皮膚病的病人，包括：銀屑病5例、玫瑰糠疹4例、多形性紅斑4例，用SNK液進行涂抹或噴液治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計臨床治療結(jié)果。

實驗組2：選若干自身免疫性皮膚病的病人，包括：銀屑病5例、玫瑰糠疹4例、多形性紅斑4例，用SNK膏進行涂抹治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計臨床治療結(jié)果。

實驗組3：選若干自身免疫性皮膚病的病人，包括：銀屑病5例、玫瑰糠疹4例、多形性紅斑2例，用SNK液及膏涂抹或噴液治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計臨床治療結(jié)果。

結(jié)果如下表1所示：

表1：SNK液和SNK膏臨床實驗結(jié)果統(tǒng)計表

臨床實驗可看出，本發(fā)明的NK細胞原液、SNK液和SNK膏對自身免疫性皮膚病具有廣譜抗病性。3組實驗患者均未出現(xiàn)任何副作用，長期使用無毒副作用。其中：第一組和第二組分別為SNK液和SNK膏，SNK液和SNK膏中由于NK細胞原液的含量不同，療效稍微有差別，SNK液比膏效果好。當(dāng)SNK液和SNK膏一起使用時(先涂SNK液，再涂SNK膏)，既可保證NK液中的活性因子高效和持久被皮膚所吸收，又可提高療效，兩者聯(lián)合使用療效最佳。

實施例2

本實施例提供了一種SNK液，按重量計，所述SNK液由NK細胞原液80.0％、甘油2.0％、硼砂0.08％、羥苯乙酯0.03％和適量無菌水組成。

選銀屑病患者2例，用上述SNK液進行治療，每天使用2-3次，連續(xù)使用20天后，癥狀明顯緩解，使用25天后，基本痊愈，具有顯著的治療效果。

實施例3

本實施例提供了一種SNK膏，按重量計，所述SNK膏由NK細胞原液65.0％、白凡士林10.0％、單、雙硬脂酸甘油酯10.0％、對羥基苯甲酸乙酯0.5％、硼砂0.5％、二甲亞砜5.0％、山梨酸10.0％和適量無菌水組成。

選多形性紅斑患者3例，利用上述SNK膏進行治療，每天2-3次，連續(xù)治療2周后，輕度患者基本痊愈，重度患者癥狀明顯好轉(zhuǎn)。

實施例4

本實施例提供了一種SNK液，按重量計，所述SNK液由NK細胞原液20％，甘油5％和適量的無菌水組成。利用上述SNK液治療玫瑰糠疹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該SNK液對玫瑰糠疹具有一定效果，連續(xù)使用20天后，癥狀明顯緩解。

實施例5

本實施例提供了一種SNK液，按重量計，所述SNK液由NK細胞原液50％，甘油5％和適量的無菌水組成。利用上述SNK液治療多形性紅斑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該SNK液對多形性紅斑具有一定療效，連續(xù)使用20天后，癥狀明顯緩解。

實施例6

本實施例提供了一種SNK液，所述SNK液為100％的NK細胞原液，利用所述SNK液治療銀屑病，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該SNK液對銀屑病具有顯著的治療效果，患者使用20天后，輕度患者即可痊愈，重度患者癥狀明顯緩解，重度患者使用25天后，可基本痊愈。

理論上，藥物中的NK細胞原液的含量越高，活性因子含量越高，效果越好，但考慮到使用方便性和增加皮膚滲透性和保護性的情況下，需要在NK細胞原液基礎(chǔ)上添加了一些輔助成分，實施例6中采用100％的NK細胞原液進行治療，其臨床實驗結(jié)果與實施例1的SNK液及膏相比，在治療效果上并無很大差別。

以上為本發(fā)明一種詳細的實施方式和具體的操作過程，是以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，但本發(fā)明的保護范圍不限于上述的實施例。