本發(fā)明涉及的是生物制藥的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種NK細胞原液在制備治療皮膚病藥物中的應用。
背景技術(shù)：
在醫(yī)學上，皮膚病是有關(guān)皮膚的疾病，是嚴重影響人民健康的常見病、多發(fā)病之一，如麻風、疥瘡、真菌病、皮膚細菌感染等。皮膚病是皮膚(包括毛發(fā)和甲)受到內(nèi)外因素的影響后，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生變化，產(chǎn)生病理過程，并相應的產(chǎn)生各種臨床先后表現(xiàn)。皮膚病的發(fā)病率很高，多比較輕，常不影響健康，但少數(shù)較重甚至可以危及生命。
皮膚病的種類很多，包括真菌、細菌及病毒感染性皮膚病、自生免疫性皮膚病和物理性皮膚病等，大多患者都伴有紅腫熱痛、皮膚瘙癢等癥狀，不僅給患者帶來不適，而且嚴重影響美觀，若處理不當，極易發(fā)生感染、潰爛而難以治愈，留下難看的疤痕。
目前，皮膚病的治療藥物種類繁多，療效參差不齊，主要包括內(nèi)用藥物和外用藥物，內(nèi)用藥物包括抗細菌類藥物、抗麻風藥物、抗組織胺藥、激素類藥物等，外用藥物包括抗菌藥、止癢類藥物、外用糖皮質(zhì)激素、遮光劑、脫色劑等。這些藥物大多存在治療效果單一、療程較長、對皮膚有刺激等缺點，尤其對頑固性皮膚病，由于治療療程長，長久使用存在很大的毒副作用，對患者健康造成不利影響。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種NK細胞原液在制備治療皮膚病藥物中的應用，以解決現(xiàn)有皮膚病藥物種類繁多、治療效果單一、療程長、毒副作用大等技術(shù)問題。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
本發(fā)明提供了一種NK細胞原液在制備治療皮膚病藥物中的應用；NK細胞(natural killer cell，自然殺傷細胞)是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發(fā)生。NK細胞原液的主要成分是NK細胞分泌的蛋白質(zhì)和細胞因子，包括MIP-1α、MIP-1β、RANTES、單核細胞趨化蛋白、白介素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、干擾素以及穿孔素等，這些蛋白質(zhì)和細胞因子能夠被皮膚吸收，并能夠直接作用于靶細胞，可殺滅或抑制細菌、真菌、病毒，改善皮膚的免疫系統(tǒng)，修復受損的皮膚，達到綜合治療各種皮膚類疾病的目的；使用后，皮膚表面形成保護膜，有利于受損皮膚的快速修復，防止病情反復加重。
進一步地，利用NK細胞原液制備獲得的用于治療皮膚病藥物為一種外用生物制劑，具體制備方法包括：將NK細胞原液與外用藥用輔料混合，制備獲得外用液體制劑或外用膏狀制劑，使用時，將外用藥物制劑和/或外用膏狀制劑涂抹于患處，即可達到治療皮膚病的目的，其中，本發(fā)明中，將所述外用液體制劑命名為SNK液，將所述外用膏狀制劑命名為SNK膏。
進一步地，使用時，先使用SNK液噴灑于患處，再使用SNK膏涂抹于患處，進行混合治療，可保持藥效能夠更好地讓皮膚吸收，達到最佳治療效果，混合使用數(shù)天后，癥狀即可減輕或消失。
進一步地，所述NK細胞原液的制備方法，包括以下步驟：
步驟一：取新鮮血液，提取血液中的外周血單核細胞(以下簡稱PBMC)；
步驟二：在RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的慶大霉素和10％重量百分比的胎牛血清，獲得NK細胞培養(yǎng)液；
步驟三：取3.0×107-4.0×107個PBMC于一細胞培養(yǎng)瓶中，加入20-30ml的NK細胞培養(yǎng)液和2ml的濃度為1.0×107個/ml的NK擴增試劑，獲得起始培養(yǎng)液；
步驟四：將NK細胞接種于起始培養(yǎng)液中培養(yǎng)1-2天，培養(yǎng)期間根據(jù)細胞生長狀態(tài)添加NK細胞培養(yǎng)液；當培養(yǎng)至第3天時，將培養(yǎng)液離心，獲得的細胞沉淀中加入NK細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；
步驟五：當NK細胞數(shù)量達1.5×108個/瓶以上時，加入2支NK擴增試劑和NK細胞培養(yǎng)液進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中根據(jù)細胞生長狀態(tài)增加NK細胞培養(yǎng)液并進行分袋培養(yǎng)，使細胞濃度在1.0×106個/ml，當培養(yǎng)至第12天時，控制加液量，使細胞濃度為2.0×106個/ml；
步驟六：繼續(xù)培養(yǎng)至第14天后，收集細胞培養(yǎng)液，獲得NK細胞原液。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：本發(fā)明提供了一種NK細胞原液在制備皮膚病藥物中的應用，所述NK細胞原液為NK細胞分泌的各種蛋白質(zhì)和細胞因子的集合，利用這些蛋白質(zhì)和細胞因子的抗菌、抗病毒等活性，當其被皮膚吸收后，可直接作用于靶細胞，從而消除病灶。通過大量臨床試驗發(fā)現(xiàn)，NK細胞原液具有廣譜治療皮膚病的效果，包括物理性皮膚病、蚊蟲叮咬類皮膚病、自身免疫性皮膚病、細菌或真菌感染性皮膚病、皮膚附屬器皮膚病等。由于其具備廣譜治療特性，在治療某一類皮膚病的同時，可以同時殺傷或抑制真菌和細菌及病毒、改善皮膚的免疫系統(tǒng)，使用后，可形成皮膚保護膜，利于損傷修復，達到綜合治療皮膚病的目的，療效顯著，并能夠有效防止病情的反復發(fā)作。藥理學表明，NK細胞原液安全無毒副作用，長期使用無毒副作用，對于嬰兒、孕婦、皮膚敏感者等特殊人群也同樣適用；另外，由于NK細胞原液屬于細胞因子制劑，無抗藥性，長期使用效果不減。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例1
1、材料
本實施例所用方法如無特別說明均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉的常規(guī)方法，所用的試劑等材料，如無特別說明，均為市售購買產(chǎn)品。
2、方法
2.1制備NK細胞原液
步驟一：PBMC提?。?/p>
將新鮮血液于740g離心10分鐘，獲得上層淡黃色血漿和下層血細胞，將下層血細胞與生理鹽水按照體積比1：1混合，取50ml離心管，將稀釋的血細胞懸液鋪在15ml淋巴細胞分離液上，400g離心30分鐘。收集中間白色膜狀細胞層，加入生理鹽水洗滌，400g離心10分鐘，棄上清液，重復洗滌一次。最后用適量培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，即獲得PBMC。
步驟二：NK細胞培養(yǎng)液的制備：
在Gibco RPMI Medium 1640basic培養(yǎng)液(購買于美國GIBCO公司)中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的慶大霉素和10％重量百分比的Gibco FBS(購買于美國GIBCO公司)，獲得NK細胞培養(yǎng)液。
步驟三：NK細胞起始培養(yǎng)液的制備：
取3.0×107-4.0×107個PBMC于一T75培養(yǎng)瓶中，加入20-30ml的NK細胞培養(yǎng)液和1支NK擴增試劑，其中，所述NK擴增試劑為一種CD8α-白介素21-CD137復合物(參見中國專利文獻CN102154207A)，可直接通過市場購買的方式獲得，本發(fā)明使用的NK 擴增試劑的產(chǎn)品規(guī)格為2ml/支，濃度為1×107個/ml。
步驟四：NK細胞起始培養(yǎng)：
將NK細胞接種于上述T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，其中：
第1、2天注意觀察細胞狀態(tài)。如果細胞狀態(tài)良好可不處理。觀察細胞密度明顯加大，可加NK細胞培養(yǎng)液10ml。
第3天將培養(yǎng)液離心，獲得的細胞沉淀轉(zhuǎn)移至新的T75培養(yǎng)瓶中，并加入30ml的NK細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
第4天觀察細胞，若細胞狀態(tài)良好，細胞密度較小，可不做處理；如果細胞密度過大，可酌情加NK細胞培養(yǎng)液。
第5天，若第4天未處理，且細胞狀態(tài)良好，細胞密度大，則加入NK細胞培養(yǎng)液20ml。
第6天觀察細胞，根據(jù)細胞密度加液，加NK細胞培養(yǎng)液30-50ml。
步驟五：NK細胞擴大培養(yǎng)：
第7天計數(shù)，若細胞數(shù)量大于1.5×108個/瓶，則加入2支NK擴增試劑，若細胞數(shù)量在30-60百萬，則長至第8天再添加NK擴增試劑。然后添加NK細胞培養(yǎng)液，使總細胞濃度在1.0×106個/ml。隨培養(yǎng)體積逐步增大，可轉(zhuǎn)入T175培養(yǎng)方瓶擴大體積培養(yǎng)，培養(yǎng)液體積大于120ml或細胞數(shù)量大于2.0×108個/瓶時，則可以轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋培養(yǎng)。
第8-11天每天觀察，按細胞生長速度加液，使得細胞濃度在1.0×106個/ml左右。第12-14天每天觀察，當細胞數(shù)量大于3.0×109個/袋，并且體積大于1200ml時，將細胞分為2袋。
步驟六：收集NK細胞原液：
當細胞生長至所需數(shù)量時即可進行收集使用或凍存。一般情況下，14或15天收集細胞，此時細胞可到3×109個以上，NK細胞(CD3-CD56+)純度可達到80％以上。
2.2制備SNK液：
按重量計，取NK細胞原液85.0％、甘油5.0％、硼砂0.08％、透明質(zhì)酸0.1％、羥苯乙酯0.03％，溶劑為無菌水，混勻后滅菌分裝，獲得所述SNK液。
2.3制備SNK膏：
按重量計，取NK細胞原液80.0％、卡波姆941為1.5％、甘油為2.0％、三乙醇胺3.0％、對羥基苯甲酸乙酯0.5％和無菌水，混勻后滅菌分裝，獲得所述SNK膏。
3、臨床驗證
將臨床實驗分成3組進行，具體為：
實驗組1：用SNK液進行噴液治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計臨床治療結(jié)果。
實驗組2：用SNK膏進行涂抹治療，每天使用2-3次，統(tǒng)計臨床治療結(jié)果。
實驗組3：用SNK液和SNK膏進行混合治療(先用SNK液，再用SNK膏)，每天使用2-3次，統(tǒng)計臨床治療結(jié)果。
其中，對于淺部真菌性皮膚病，均進行刮取鱗屑及甲屑進行真菌直接鏡檢，并作出明確診斷后，作為實驗病例。
表1：臨床實驗結(jié)果
上述臨床實驗可看出，本發(fā)明的SNK液和SNK膏對淺部真菌感染性皮膚病的治療效果非常顯著，對物理性皮膚病也有顯著的治療效果，對其他類型的皮膚病也具有一定治療效果，具有廣譜的治療作用。治療過程中，患者均未出現(xiàn)任何副作用，也說明了NK細胞原液安全無毒副作用。
SNK液和SNK膏的配方中，除NK細胞原液外，其余均為常規(guī)藥用輔料，由于輔料本身不具備治療效果，因此，可以得出是NK細胞原液在發(fā)揮治療作用。理論上，藥物中的NK細胞原液的含量越高，活性因子含量越高，效果越好，但考慮到使用方便性和增加皮膚滲透性和保護性的情況下，需要在NK細胞原液基礎(chǔ)上添加了一些輔助成分，將其制備成不同藥物制劑。
本實施例中，由于SNK液和SNK膏中NK細胞原液的含量不同，療效稍微有差別，具體表現(xiàn)在實驗組1相比較實驗組2的臨床治療天數(shù)短，治療效果較好。當SNK液和SNK膏一起使用時(實驗組3，先涂SNK液，再涂SNK膏)，既可保證SNK液中的活性因子高效和持久被皮膚所吸收，又可提高療效，兩者聯(lián)合使用療效最佳。
實施例2
本實施例提供了一種廣譜治療皮膚病的外用藥物制劑，所述藥物制劑為一種SNK液，由NK細胞原液50％、單、雙硬脂酸甘油酯10.0％、對羥基苯甲酸乙酯0.5％、硼砂0.5％、二甲亞砜5.0％、山梨酸1.0-10.0％和適量無菌水組成。
利用上述SNK液治療手足癬、嬰兒濕疹、痱子和蚊蟲叮咬，3天后癥狀減輕，7天可痊愈。
實施例3
本實施例提供的一種廣譜治療皮膚病的外用藥物制劑，所述藥物制劑為一種SNK膏，由NK細胞原液40％，白凡士林10.0％、單、雙硬脂酸甘油酯10.0％、對羥基苯甲酸乙酯0.5％、硼砂0.5％、二甲亞砜5.0％、山梨酸10.0％，余量為水。
實施例4
本實施例提供的一種廣譜治療皮膚病的外用藥物制劑，所述藥物制劑為一種SNK液，由100％的NK細胞原液組成。
實施例5
本實施例提供的一種廣譜治療皮膚病的外用藥物制劑，所述藥物制劑為一種SNK液，由NK細胞原液90.0％、卡波姆941為0.1％、甘油1.0％、三乙醇胺1.0％、羥苯乙酯0.01％、透明質(zhì)酸0.05％和適量水組成。
以上為本發(fā)明一種詳細的實施方式和具體的操作過程，是以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，但本發(fā)明的保護范圍不限于上述的實施例。