本發(fā)明涉及醫(yī)療藥物領(lǐng)域，具體涉及甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

丹參是中醫(yī)臨床常用的中藥之一，具有活血祛瘀、調(diào)經(jīng)、止痛、安神等功效。丹參酮在丹參中含量較高，是丹參的主要有效成分，其藥理作用極其廣泛，不僅包括抗氧化作用、心血管藥理作用、性激素作用、腦血管藥理作用、抗菌消炎作用，還具有明顯的抗腫瘤作用。其抗腫瘤作用機(jī)制包括抑制腫瘤的生長(zhǎng)和增值，抑制腫瘤的侵襲和遷移，以及與其他抗腫瘤藥物產(chǎn)生的協(xié)同作用。目前市場(chǎng)上含丹參酮的制劑有復(fù)方丹參片，丹參酮膠囊和丹參酮II A磺酸鈉注射液。但丹參酮幾乎不溶于水，其普通口服制劑的生物利用度不高，注射劑的靶向作用效果差，影響了該藥的治療效果。所以進(jìn)一步提高丹參酮的生物利用度以及對(duì)特定部位的靶向作用是丹參酮制劑急需解決的問(wèn)題。

靶向給藥系統(tǒng)是藥劑學(xué)研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一。靶向給藥能夠選擇性的將藥物輸送至靶標(biāo)位置，增加療效的同時(shí)減少藥物對(duì)正常組織的毒副作用。研究表明，肝細(xì)胞膜組分中含有大量甘草酸和甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)特異結(jié)合位點(diǎn)，甘草次酸與該位點(diǎn)結(jié)合呈可飽和性，高度特異性。與大分子抗體相比，甘草次酸屬于小分子物質(zhì)，具有易修飾，低免疫原性，理化性質(zhì)穩(wěn)定，成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，使其成為較理想的肝靶向載體。

在傳統(tǒng)的臨床實(shí)踐中，疾病的診斷和治療是兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過(guò)程。然而，診斷用造影劑和治療用藥的分別使用會(huì)帶來(lái)用藥的副作用疊加，貽誤治療時(shí)期以及增加患者用藥痛苦等缺點(diǎn)。為此，在臨床醫(yī)生和科研工作者的共同努力下，治療診斷學(xué)(theranostics)作為一種新理念逐漸發(fā)展起來(lái)。治療診斷學(xué)是一種將藥物治療與診斷相結(jié)合的手段，個(gè)性化地對(duì)病人同時(shí)實(shí)現(xiàn)治療和診斷，可以提高診斷效率，減少對(duì)人體的毒副作用，以達(dá)到事半功倍的效果。同時(shí)應(yīng)用于診斷和治療的試劑稱(chēng)為治療診斷一體化試劑(theranostic agent)，該類(lèi)試劑能夠?qū)崟r(shí)診斷病情并同步進(jìn)行治療的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)使其成為治療癌癥的新策略。

近年來(lái)，為解決氣態(tài)微泡造影劑粒徑較大而不能穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞的問(wèn)題，出現(xiàn)了一種液態(tài)氟碳納米球。據(jù)報(bào)道，以脂質(zhì)包裹高沸點(diǎn)液態(tài)氟碳全氟溴辛烷(Perfluoroctyl bromide，PFOB，沸點(diǎn)140℃)為內(nèi)核的納米球造影劑粒徑小，具有可穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)血管外靶標(biāo)；穩(wěn)定性好，循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)；生物相容性好，無(wú)毒性，可用作分子探針等優(yōu)點(diǎn)。但是，由于其通過(guò)聚集顯影的原理，導(dǎo)致其超聲顯像效果與微泡相比有顯著差距，顯像效果不佳。因此，以低沸點(diǎn)的液態(tài)氟碳(如全氟戊烷、全氟己烷等)作為內(nèi)核，制備一種相轉(zhuǎn)變的納米超聲造影劑成為一種新策略，該相轉(zhuǎn)變納米超聲造影劑可在一定條件下(加熱，高能聚焦超聲HIFU，低能聚焦超聲LIFU)發(fā)生液——?dú)庀嘧儺a(chǎn)生微氣泡而顯像，顯像效果明顯。這種相變型納米球既具備了PFOB納米球粒徑較小的優(yōu)點(diǎn)，又能彌其超聲顯像效果差的缺陷，這樣便可以解決超聲分子影像學(xué)中的關(guān)鍵問(wèn)題。

在本發(fā)明中所制備的甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑粒徑較小，可通過(guò)腫瘤部位EPR效應(yīng)實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向。同時(shí)，修飾甘草次酸又可以實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞的主動(dòng)靶向，從而可降低該制劑的毒副作用，并增強(qiáng)丹參酮的療效。另一方面，以脂質(zhì)作為殼膜包裹低沸點(diǎn)液態(tài)氟碳的納米球，具有良好的生物相容性，在一定條件下可通過(guò)液——?dú)庀嘧冞M(jìn)行超聲增強(qiáng)顯像，當(dāng)負(fù)載抗癌藥物丹參酮之后可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的診療一體化，從而減少中間環(huán)節(jié)，大大提高效率，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)氣態(tài)微泡粒徑較大(微米級(jí))不能透過(guò)血管內(nèi)皮間隙和液態(tài)氟碳PFOB納米球聚集顯影效果較差等問(wèn)題，提供一種新的甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑及其制備方法。該新型載藥液——?dú)庀嘧冎|(zhì)納米球粒徑較小，可通過(guò)腫瘤部位EPR效應(yīng)實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向。同時(shí)，修飾甘草次酸又可以實(shí)現(xiàn)對(duì)肝的主動(dòng)靶向，可降低該制劑的毒副作用，并增強(qiáng)藥物的治療作用。另一方面，以脂質(zhì)作為殼膜包裹低沸點(diǎn)液態(tài)氟碳的納米球，在一定條件下可通過(guò)液——?dú)庀嘧冞M(jìn)行超聲增強(qiáng)顯影，效果優(yōu)于PFOB納米球的聚集顯影。當(dāng)負(fù)載抗癌藥物丹參酮之后可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的診療一體化，從而減少中間環(huán)節(jié)，大大提高效率，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，但本發(fā)明并不僅限于下述技術(shù)：

步驟1：稱(chēng)取適量的甘草次酸(GA)，N-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，反應(yīng)催化劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)溶于有機(jī)溶劑，室溫避光攪拌24h，得到活化甘草次酸活性酯。

步驟2：稱(chēng)取一定量的步驟1得到的甘草次酸活性酯和一定量二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基交連物(DSPE-PEG2000-NH2)溶于有機(jī)溶劑中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜，得甘草次酸修飾的磷脂聚乙二醇復(fù)合物。

步驟3：將步驟2得到的甘草次酸修飾的磷脂聚乙二醇復(fù)合物，二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，膽固醇，藥物按一定比例稱(chēng)量并溶于有機(jī)溶劑，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至形成一均勻薄膜。加入PBS緩沖液，震蕩或水浴超聲使薄膜脫壁，得到脂質(zhì)混懸液。

步驟4：向步驟3得到的脂質(zhì)混懸液加入一定量液態(tài)氟碳，冰浴條件下，用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲，即得到包裹液態(tài)氟碳的脂質(zhì)納米球。

步驟5：將制備的包裹液態(tài)氟碳的脂質(zhì)納米球進(jìn)行體外加熱相變觀察和超聲顯像觀察。

步驟6：用香豆素6標(biāo)記液態(tài)氟碳的脂質(zhì)納米球，采用熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞攝取觀察。

本發(fā)明方法中，步驟1合成甘草次酸活性酯的試劑包括但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、1-羥基苯并三唑(HOBT)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。所用有機(jī)溶劑包括但不限于二甲基甲酰胺(DMF)、四氫呋喃(THF)、二甲基亞砜(DMSO)、二氯甲烷(DCM)、三氯甲烷(TCM)等。

本發(fā)明方法中，步驟3所用磷脂或其衍生物包括但不限于二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、1，2-二油酰基卵磷脂(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、1，2-二油?；岩掖及?DOPE)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)中的一種或多種。

本發(fā)明方法中，所使用的液態(tài)氟碳包括但不限于全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷。

本發(fā)明應(yīng)用薄膜分散法成功制備了甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑，具有合成工藝簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、生物相容性好、高度特異性結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)例1中空白相變型納米超聲造影劑(A)和甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑(B)的外觀圖

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑粒徑分布圖

圖3為本發(fā)明實(shí)例2中甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑體外加熱致相變顯微鏡觀察圖

圖4為本發(fā)明實(shí)例2中甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑體外加熱致相變超聲顯像圖

圖5為本發(fā)明實(shí)例2中甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑體外LIFU輻照致相變超聲顯像圖

圖6為本發(fā)明實(shí)例2中細(xì)胞攝取熒光顯微鏡觀察圖

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明并不僅限于下述實(shí)施例。

實(shí)施例1

1.甘草次酸活性酯的制備

稱(chēng)取0.564g甘草次酸，0.115g NHS和0.250g DCC溶于四氫呋喃(THF)中，室溫避光攪拌24h，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾除去白色副產(chǎn)物，將濾液濃縮，用乙醚洗滌，干燥既得甘草次酸活性酯。

2.甘草次酸修飾的磷脂聚乙二醇復(fù)合物的制備

稱(chēng)取5mg DSPE-PEG2000-NH₂和2mg甘草次酸活性酯溶于二氯甲烷，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，得甘草次酸修飾的磷脂聚乙二醇復(fù)合物(DSPE-PEG2000-GA)，旋轉(zhuǎn)蒸干后，密封放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.空白相變型納米超聲造影劑的制備

稱(chēng)取7mg DPPC，1.5mg DSPE-PEG2000和2mg膽固醇于100mL圓底燒瓶中，加入5mL二氯甲烷使其溶解，然后，于35℃水浴上減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成一均勻薄膜。加入4mL PBS緩沖液，震蕩或水浴超聲使薄膜脫壁得脂質(zhì)混懸液。轉(zhuǎn)移至一新的EP管中，冰浴冷卻后，加入140μL全氟戊烷(PFP)，冰浴條件下采用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲，超聲條件為：功率100W，超聲時(shí)間為5min，超聲工作5s停5s。超聲完畢后，得一均勻乳白色脂質(zhì)納米球混懸液，外觀如圖1(A)所示。

4.甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑的制備

稱(chēng)取7mg DPPC，1.5mg DSPE-PEG2000-GA，2mg膽固醇和1.2mg丹參酮于100mL圓底燒瓶中，加入5mL二氯甲烷使其溶解，然后，于35℃水浴上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成一均勻薄膜。加入4mL PBS緩沖液，震蕩或水浴超聲使薄膜脫壁得脂質(zhì)混懸液。轉(zhuǎn)移至一新的EP管中，冰浴冷卻后，加入140μL全氟戊烷(PFP)，冰浴條件下采用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲，超聲條件為：功率100W，超聲時(shí)間為5min，超聲工作5s停5s。超聲完畢后，得一均勻橙色(注：丹參酮是橙紅色)脂質(zhì)納米球混懸液，外觀如圖1(B)所示。經(jīng)過(guò)多次離心洗滌后，用紫外分光光度法測(cè)得藥物包封率為84.7±4.6％。

將制備成的甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑混懸液稀釋一定的倍數(shù)，采用馬爾文激光粒度分析儀測(cè)量其粒徑，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可見(jiàn)，脂質(zhì)納米球的粒徑在310nm左右(PDI＝0.232)，粒徑較小，可以通過(guò)腫瘤EPR效應(yīng)進(jìn)入腫瘤間質(zhì)。

實(shí)施例2

1.甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑體外加熱致相變顯微鏡觀察

將制備成的甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑混懸液稀釋一定的倍數(shù)，滴于載玻片上，放置于加熱板中間，采用倒置顯微鏡觀察不同溫度時(shí)發(fā)生的液——?dú)庀嘧?。相變結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果表明，加熱前，脂質(zhì)納米球沒(méi)有相變，隨著溫度的升高，逐漸發(fā)生液——?dú)庀嘧?，?7℃時(shí)，有少量氣泡產(chǎn)生，當(dāng)加熱至50℃，氣泡越來(lái)越多。當(dāng)氣泡增大到一定體積會(huì)發(fā)生破裂或者合并。

2.甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑體外加熱致相變超聲顯像觀察

將制備成的甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑混懸液置于水浴鍋中，調(diào)節(jié)水浴溫度，測(cè)試不同溫度下的顯像效果。結(jié)果(圖4)表明，在25℃時(shí)，幾乎沒(méi)有顯像增強(qiáng)；溫度升高至37℃時(shí)，有微弱的顯像增強(qiáng)；最后當(dāng)溫度繼續(xù)上升至50℃時(shí)，顯像效果較為明顯。

3.甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑體外LIFU輻照致相變超聲顯像觀察

將制備成的甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑混懸液加入到自制的凝膠模型中，采用不同功率的LIFU輻照，觀察輻照前后的顯像效果。結(jié)果如圖5所示，LIFU輻照前沒(méi)有顯像增強(qiáng)，當(dāng)LIFU功率為5W，輻照時(shí)間為3min時(shí)，有較弱的顯像增強(qiáng)。當(dāng)LIFU功率為8W，輻照時(shí)間為3min時(shí)，顯像增強(qiáng)的效果更為明顯。

4.細(xì)胞攝取熒光顯微鏡觀察

采用香豆素6標(biāo)記脂質(zhì)納米球，對(duì)照組為空白相變型納米超聲造影劑，實(shí)驗(yàn)組為甘草次酸修飾的載丹參酮相變型納米超聲造影劑體。人肝癌細(xì)胞Hepg-2培養(yǎng)于6孔板中，待細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將兩組制劑用DMEM培養(yǎng)基稀釋相同倍數(shù)后加入到培養(yǎng)Hepg-2的6孔板中，繼續(xù)避光培養(yǎng)1h后，吸取培養(yǎng)液，用PBS洗滌3遍，加入多聚甲醛固化，然后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞對(duì)兩組制劑的攝取情況。結(jié)果如圖6所示，對(duì)照組(A組)的熒光強(qiáng)度要弱于實(shí)驗(yàn)組(B組)，說(shuō)明甘草次酸修飾的脂質(zhì)納米球具有肝靶向作用，能更好的被肝細(xì)胞所攝取。