本發(fā)明涉及一種功效凝膠劑及其制備方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

胎盤是哺乳動物在妊娠期長成的過渡性器官，主要用于母體與胎兒之間的物質(zhì)交換?！侗静菥V目》記載：人胎盤性溫、味甘咸，歸心肺腎經(jīng)。人胎盤具有抗衰老、提高免疫力、補(bǔ)血美容等功效，被稱為珍貴的溫補(bǔ)中藥，但作為藥源不易獲得，且存在倫理及交叉感染等問題；而同樣來源于哺乳動物的豬胎盤安全易得，也具有很好的補(bǔ)血、改善學(xué)習(xí)記憶、抗應(yīng)激能力和提高免疫力等功效，經(jīng)蛋白質(zhì)、微量元素、氨基酸等成分分析確認(rèn)與人胎盤具有相似的功效物質(zhì)基礎(chǔ)。

水溶性殼聚糖具有增稠、乳化、保濕、成膜及凝膠等特性，與殼聚糖相比，可在廣泛 pH 值水中溶解，無毒、無味，可降解，生物相容性好，適于各類膏、乳、霜配方中，在日化、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

目前豬胎盤中蛋白類成分的分離鑒定國內(nèi)外未見報道；以豬胎盤水提液為功效原料，水溶性殼聚糖為基質(zhì)研發(fā)的凝膠制劑產(chǎn)品更是無人問津。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提出利用豬胎盤水提液為原料制成的一種功效凝膠劑。

本發(fā)明主要由豬胎盤水提液、橄欖油、水溶性殼聚糖和林蛙油組成；所述水溶性殼聚糖為羧甲基殼聚糖、琥拍酰殼聚糖、交聯(lián)殼聚糖、羥丙基殼聚糖或巰基殼聚糖中的任意一種。

本發(fā)明產(chǎn)品可以是外用也可以是口服產(chǎn)品，經(jīng)試驗證實該功效凝膠劑具有清除自由基的能力，可減輕自由基對生物組織的傷害，因而具有延緩機(jī)體衰老的功能。如將功效凝膠干預(yù)治療衰老小鼠之后，體內(nèi)SOD含量增加，阻礙了氧自由基對細(xì)胞的損害，并及時修復(fù)損傷細(xì)胞；體內(nèi)MDA 含量的減少也反應(yīng)了細(xì)胞損傷程度的降低。

該凝膠含油不油膩，具有外用易涂展、有舒適感，可進(jìn)一步研發(fā)去皺、祛斑、潤膚美白的功效化妝品；口服口感好，可增強(qiáng)記憶，提高免疫力，可進(jìn)一步研發(fā)防治帕金森、阿爾海默茨病等老年退行性疾病功能食品或保健藥品；所以本發(fā)明功效凝膠劑在日化領(lǐng)域、藥食兩用等方面具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明還提出以上產(chǎn)品的制備方法，包括以下步驟：

1）將新鮮豬胎盤去除污血、臍帶、筋膜后洗凈瀝干，于-20℃條件下冷凍后粉碎，加水勻漿，然后離心，將上清液再以0.45μm濾膜過濾，取得的濾出液為豬胎盤水提液；

2）將林蛙油以豬胎盤水提液浸泡后均質(zhì)，加入橄欖油均質(zhì)，取得橄欖油乳膏，再次加入豬胎盤水提液均質(zhì)后，取得橄欖油乳液；

3）將水溶性殼聚糖以豬胎盤水提液浸泡后均質(zhì)，然后再加入橄欖油乳液，再經(jīng)均質(zhì)，取得功效凝膠劑。

以上工藝常溫操作，簡單合理；未使用任何有機(jī)溶劑，環(huán)保節(jié)能；橄欖油分散在蛋白質(zhì)和殼聚糖凝膠立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中使制成的產(chǎn)品穩(wěn)定性好，不會發(fā)生乳析、絮凝及沉降。

所述豬胎盤水提液中含有0.1～10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的水溶性蛋白質(zhì)。水溶性蛋白質(zhì)是豬胎盤水提液中主要的功效組分，豬胎盤水提液中水溶性蛋白質(zhì)含量必須達(dá)到0.1～10%范圍才具有本發(fā)明的意義。豬胎盤水提液是從正常足月的新鮮豬胎盤中提取得到，因豬胎盤來源（豬種類及飼料的不同）以及豬產(chǎn)仔豬時間的差異所致水溶性蛋白質(zhì)含量差異，可根據(jù)實際需要采用加純凈水稀釋或加豬胎盤水提液凍干粉濃積的方法使豬胎盤水提液中水溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到0.1～10%范圍中的某一確定含量，作為保健用含量可以偏少，作為防治作用含量可以偏多。

橄欖油作為凝膠保濕劑，兼有降脂、護(hù)膚美容多種功效；林蛙油蛋白質(zhì)含量較高，泡發(fā)后對橄欖油有很好的乳化作用，也有增加免疫力等保健功效；水溶性殼聚糖是凝膠基質(zhì)，對橄欖油乳有穩(wěn)定作用，兼有保濕、活化細(xì)胞等功能。

所述水溶性蛋白質(zhì)至少包括葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78、熱休克蛋白8、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3前體蛋白、脯氨酰4-羥化酶β多肽、β細(xì)胞骨架肌動蛋白片段、醛糖還原酶和β血紅蛋白亞基。在豬胎盤水提液中至少包含有以上七種水溶性蛋白質(zhì)等十種以上的蛋白質(zhì)成分，由于上述七種蛋白以外的其它蛋白含量較低，而不能用現(xiàn)今技術(shù)手段鑒別其具體種類。

另外，制備時，豬胎盤水提液、橄欖油、水溶性殼聚糖和林蛙油的混合質(zhì)量比為34∶4∶1∶1。豬胎盤水提液是水相，橄欖油是油相，泡發(fā)的林蛙油是乳化劑，殼聚糖是凝膠基質(zhì)，整個體系實際是復(fù)乳凝膠體系，尤其利于功效成分的吸收，經(jīng)實驗確定各成分以上用量比可以保持該復(fù)合體系物理穩(wěn)定性，即不發(fā)生分層等現(xiàn)象。

另外，本發(fā)明所述步驟2）中浸泡時間為2～12h。林蛙油中蛋白質(zhì)含量較高，蛋白質(zhì)屬于高分子化合物，擴(kuò)散到溶解介質(zhì)中的速度較小分子化合物要慢得多。本發(fā)明先加入有限溶劑量使林蛙油充分溶脹，然后乳化并稀釋。溶脹是卷曲呈螺旋或線團(tuán)狀的高分子在溶劑中完全舒展的過程，溶脹完全需2h以上時間，溶脹不完全則不能溶解和分散在溶媒中；溶脹過程也不能采用加熱或攪拌的方式促進(jìn)溶解，否則適得其反。

所述步驟3）中浸泡時間為2～12h。殼聚糖屬于高分子化合物，擴(kuò)散到溶解介質(zhì)中的速度較小分子化合物要慢得多。本發(fā)明直接加入足量溶劑充分溶脹溶解，利于與橄欖油乳膏充分混合。溶脹是卷曲呈螺旋或線團(tuán)狀的高分子在溶劑中完全舒展的過程，溶脹完全需2h以上時間，溶脹不完全則不能溶解和分散在溶媒中；溶脹過程也不能采用加熱或攪拌的方式促進(jìn)溶解，否則適得其反。

所述均質(zhì)時的混合體系的轉(zhuǎn)速為1300 r·min^-1，每次作用時間為1～5min，這是經(jīng)實驗考察確定的，可以達(dá)到理想的均質(zhì)效果。轉(zhuǎn)速過高渦流帶入的空氣形成氣泡難以趕除，攪拌時間過長有破乳危險。

附圖說明

圖1為豬胎盤水提液十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白分離結(jié)果。

圖2為豬胎盤水提液SDS-PAGE標(biāo)記的第1電泳條帶對應(yīng)蛋白的指紋質(zhì)譜圖。

圖3為豬胎盤水提液SDS-PAGE標(biāo)記的第2電泳條帶對應(yīng)蛋白的指紋質(zhì)譜圖。

圖4為豬胎盤水提液SDS-PAGE標(biāo)記的第3電泳條帶對應(yīng)蛋白的指紋質(zhì)譜圖。

圖5為豬胎盤水提液SDS-PAGE標(biāo)記的第4電泳條帶對應(yīng)蛋白的指紋質(zhì)譜圖。

圖6為豬胎盤水提液SDS-PAGE標(biāo)記的第5電泳條帶對應(yīng)蛋白的指紋質(zhì)譜圖。

圖7為豬胎盤水提液SDS-PAGE標(biāo)記的第6電泳條帶對應(yīng)蛋白的指紋質(zhì)譜圖。

圖8為豬胎盤水提液SDS-PAGE標(biāo)記的第7電泳條帶對應(yīng)蛋白的指紋質(zhì)譜圖。

圖9為顯微鏡下觀察正常組皮膚表皮層病理變化照片。

圖10為顯微鏡下觀察模型組皮膚表皮層病理變化照片。

圖11為顯微鏡下觀察陽性對照組對衰老小鼠皮膚表皮層病理變化照片。

圖12為顯微鏡下觀察功效凝膠高劑量組對衰老小鼠皮膚表皮層病理變化照片。

圖13為顯微鏡下觀察功效凝膠中劑量組對衰老小鼠皮膚表皮層病理變化照片。

圖14為顯微鏡下觀察功效凝膠低劑量組對衰老小鼠皮膚表皮層病理變化照片。

具體實施方式

一、功效凝膠劑的制備

1、取正常足月的新鮮豬胎盤兩個，去除污血、臍帶、筋膜，洗凈瀝干，稱重，總重為166g；-20℃速凍48 h后粉碎；加250mL純凈水，在組織搗碎機(jī)中12000 r·min^-1，勻漿30 min；勻漿液8000 r·min^-1，4℃，離心30 min；上清液經(jīng)0.45 μm濾膜濾出得濾液①。向離心沉降部分加250mL純凈水，在組織搗碎機(jī)中12000 r·min^-1，勻漿30 min；勻漿液8000 r·min^-1，4℃，離心30 min；上清液經(jīng)0.45 μm濾膜濾出得濾液②。向離心沉降部分再加250mL純凈水，在組織搗碎機(jī)中12000 r·min^-1，勻漿30 min；勻漿液8000 r·min^-1，4℃，離心30 min；上清液經(jīng)0.45 μm濾膜濾出得濾液③。合并濾液①②③得豬胎盤水提液，用純凈水稀釋至850g，得稀釋的豬胎盤水提液。

2、自稀釋的豬胎盤水提液中取570g，再分取250g浸泡洗凈的25g林蛙油2～12 h后，經(jīng)1300 r·min^-1均質(zhì)1min，一邊滴加100g橄欖油一邊繼續(xù)均質(zhì)1～5min得橄欖油乳膏。一邊向制成的橄欖油乳膏中滴加剩余豬胎盤水提液一邊繼續(xù)均質(zhì)1～5min得橄欖油乳液。

3、自850g稀釋的豬胎盤水提液中取280g浸泡250g水溶性的羧甲基殼聚糖2～12 h后，經(jīng)1300 r·min^-1均質(zhì)1min，一邊滴入橄欖油乳中一邊繼續(xù)均質(zhì)1～5min得功效凝膠劑1000g，分裝在塑料軟管中備用。

以上羧甲基殼聚糖可以采用琥拍酰殼聚糖、交聯(lián)殼聚糖、羥丙基殼聚糖或巰基殼聚糖中的任意一種替換。

二、以上850g稀釋的豬胎盤水提液中水溶性蛋白含量測定

用蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到30 mg BSA（牛血清白蛋白）中，充分溶解后配制成濃度為0.5 mg·ml^-1的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。

按50體積BCA（蛋白濃度測定試劑盒）試劑A加1體積BCA試劑B（50︰1）配制適量BCA工作液混勻，避光保存。

將標(biāo)準(zhǔn)品按0，1，2，4，8，12，16，20 μl加到96孔板中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋補(bǔ)足到20 μL。

加10 μL樣品到96孔板的樣品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到20 μL。

各孔加入200 μL BCA工作液，37℃放置20 min。

測定A₅₆₂，測定結(jié)果見下表：

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以每個標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度所對應(yīng)的吸光度平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析。線性回歸方程為A=0.3871C+0.0934，R²=0.9953 。

取以上850g稀釋的豬胎盤水提液適量，適當(dāng)稀釋后在562nm波長下測定吸光度A值，由此吸光度值和稀釋度計算的850g稀釋的豬胎盤水提液中水溶性蛋白含量為0.5084%。

三、豬胎盤水提液中水溶性蛋白的SDS-PAGE分離和分子量測定

精密稱取制備的豬胎盤水提液，分別用去離子水配成5、10、15 mg·ml^-1的溶液，分別取20 μL加入5 μL蛋白緩沖液（含2%SDS、0.1%溴酚藍(lán)、10%甘油的水溶液），混勻，微沸5 min，4℃保存；稱取Tris-base 15.1g，甘氨酸94 g，加入10%SDS 50mL，混溶后加去離子水定容至1 L，測定pH為8.3即為電泳緩沖液；稱取0.25g考馬斯亮藍(lán)R250，加入甲醇︰水︰冰乙酸為45︰45︰10的混合液至100 mL即為考馬斯亮藍(lán)R250染色液。

電泳膠的配制：組裝電泳玻璃板，用夾子夾住，密封底部和兩側(cè)，插入梳子后在距離梳子底部1 cm的地方做好標(biāo)記，檢漏3次后按照表1分離膠配比自上而下順序依次配制分離膠，移液槍往返吸入混勻，沿玻璃內(nèi)側(cè)緩緩加入至標(biāo)記處，再沿玻璃來回移動輕加去離子水，靜置30 min使分離膠凝固，將水傾出；再按表1濃縮膠配比自上而下順序依次配制濃縮膠，混勻后立即灌入玻璃板夾縫中，與玻璃板齊平，然后插入梳子，靜置至膠凝固，用保鮮膜包裹，4 ℃?zhèn)溆谩?SDS-PAGE凝膠配方見下表：

加樣：將SDS-PAGE凝膠移入電泳槽，加滿電泳緩沖液，緩緩拔出梳子，選形態(tài)平整槽孔加樣，樣品上樣量為20 μl，Marker為5 μl，做好標(biāo)記。

電泳：接好電極，濃縮階段電壓：110 V，待溴酚藍(lán)移到分離膠后電壓轉(zhuǎn)為140 V，當(dāng)溴酚藍(lán)移動到距離膠塊底部0.5 cm時，斷開電源，電泳結(jié)束。

染色及脫色：取出玻璃板內(nèi)膠塊，考馬斯亮藍(lán)R250染色液搖床染色30 min后轉(zhuǎn)至含40%甲醇和10%冰乙酸的水溶液中脫色至背景透明，經(jīng)全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)Tanon 2500掃描，見圖1。

圖1顯示了豬胎盤水提液蛋白SDS-PAGE的電泳圖，其中A、B、C分別為樣品蛋白溶液濃度為5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL的電泳分離結(jié)果。

由圖1可見有十多個蛋白電泳條帶，選取分離度較好且含量較高的1至7電泳條帶進(jìn)行分析鑒定。

當(dāng)被分離蛋白分子量在15～200 KD范圍時，其遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系：

上式中K、b均為常數(shù)。

將Maker蛋白電泳產(chǎn)生的6組遷移率對其分子量作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品蛋白遷移率可求得對應(yīng)分子量。本實驗選取SDS-PAGE電泳中最清晰的1～7條帶（對應(yīng)蛋白含量較高）經(jīng)Tanon 2500全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)確認(rèn)其分子量依次為77.27、68.21、57.85、53.57、46.44、37.16、15 KD，具體見下表。

^*注：本實驗用蛋白Maker僅含有六個純化好的不同分子量蛋白。

四、豬胎盤提取液中水溶性蛋白的質(zhì)譜鑒定

1、膠內(nèi)酶解：

①脫色：將實例4中SDS-PAGE電泳1～7條帶分別定向切下1 mm³置于1.5 mL的EP管中，加入200 μL脫色液（ACN（乙腈）︰50 mM NH₄HCO₃溶液=1︰1），60 ℃搖勻15 min，用槍頭吸出洗液，重復(fù)脫色1次，再用去離子水反復(fù)漂洗至藍(lán)色褪盡。

②脫水干燥：向脫色后的1～7條帶EP管分別加入200 μL的ACN搖勻，10 min后棄上清液，重復(fù)該步驟至凝膠成乳白色，吸除ACN，室溫風(fēng)干膠粒。

③酶解：向干燥后的1～7條帶EP管分別加入15 μL酶液（胰蛋白酶0.01 μg/μL），4 ℃放置30 min，再加25 mM NH₄HCO₃溶液20 μl至浸沒膠塊，37℃放置15 h。

④提取：向酶解后的1～7條帶EP管分別加入20 μl萃取液（含50%ACN，0.1%TFA（三氟乙酸）的水溶液），60 ℃搖勻10 min，超聲1 min，吸出萃取液到新EP管中，重復(fù)萃取步驟，合并兩次萃取液，冷凍干燥8 h。

2、質(zhì)譜鑒定：

將上述凍干后的蛋白再加3 μL萃取液溶解，取0.7 μL，與用萃取液配制的α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）基質(zhì)飽和溶液等體積充分混合，點到不銹鋼MALDI靶板上，室溫下自然干燥，以5800串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，激光源為200 Hz(355 nm波長)的Nd:YAG激光器，加速電壓為20 kV，MS采用反射正離子模式，質(zhì)量范圍800-4000 m/z，每個圖譜采集4000次。每個樣品最多選擇20個MS峰，最小信噪比20，分辨率200。MS/MS采用正離子模式，碰撞能量2 KV，CID關(guān)閉，每個圖譜累積3000次。荷質(zhì)比（m/z）在800～4000范圍內(nèi)，采集豬胎盤蛋白質(zhì)1～7電泳條帶蛋白指紋圖譜（PMF），各圖譜信號較強(qiáng)，出峰情況較好，1～7條帶分別呈現(xiàn)132、849、189、790、848、886、496個信號峰，見圖2至圖8。

3、蛋白數(shù)據(jù)庫檢索：

用MASCOT軟件進(jìn)行蛋白檢索，數(shù)據(jù)庫NCBInr，檢索種屬為哺乳動物，最大允許漏切位點為1，酶為胰蛋白酶，質(zhì)量誤差范圍設(shè)置：MS100 ppm，MS/MS0.6 Da，蛋白電荷數(shù)為1+，固定修飾：Carbamidomethyl(C)，可變修飾：Oxidation(M)，Oxidation(HW)，Deamidated(NQ)，檢索蛋白信息。

檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫后，每個條帶都有很多匹配蛋白結(jié)果，即在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中找到豬胎盤蛋白質(zhì)酶切片段的肽段與庫中同樣的酶切片段的各個肽段的分子量信息最為匹配的蛋白質(zhì)，多個匹配結(jié)果的蛋白之間相似度也很高，選擇庫中與豬胎盤同源的野豬（Sus scrofa）的匹配蛋白信息，用Mascot軟件進(jìn)行蛋白檢索比對。蛋白得分大于60為顯著性結(jié)果（P<0.05），得到匹配蛋白的名稱、編號、分子量、蛋白得分等信息，見下表。

根據(jù)匹配蛋白的gi編號在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索蛋白信息，與豬胎盤蛋白1~7條帶匹配的肽段及其氨基酸序列覆蓋率，序列覆蓋率分別占16%、16%、20%、9%、34%、33%、59%。因此，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78、熱休克蛋白8、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3前體、脯氨酰4-羥化酶β多肽、β細(xì)胞骨架肌動蛋白、醛糖還原酶、β血紅蛋白亞基分別與條帶1～7匹配。

電泳1～7條帶均歸屬于與細(xì)胞代謝、免疫、細(xì)胞活動等相關(guān)的蛋白：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78具免疫活性，對細(xì)胞增殖、抗凋亡起重要作用；熱休克蛋白8是熱休克蛋白家族一員，可提高細(xì)胞抗氧化抗炎，應(yīng)激反應(yīng)后恢復(fù)細(xì)胞正常環(huán)境；蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3前體蛋白能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中調(diào)控蛋白質(zhì)合成，催化二硫鍵，形成蛋白質(zhì)天然構(gòu)象；脯氨酰4-羥化酶β多肽是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，其表達(dá)水平與腦瘤細(xì)胞中一種RNA水平呈倒數(shù)關(guān)系；β細(xì)胞骨架肌動蛋白能維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并且能夠調(diào)控體內(nèi)肌肉的收縮運(yùn)動；醛糖還原酶是一種代謝酶，該酶的活性與糖尿病及其并發(fā)癥有關(guān)；β血紅蛋白亞基存在于紅細(xì)胞中，具有攜氧和運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)的功能。

五、功效凝膠劑的功效實驗

1、功效凝膠劑清除二苯代苦味?；杂苫―PPH）能力的測定

取3mg的功效凝膠劑加入去離子水適當(dāng)稀釋后，逐漸加至DPPH 95%乙醇溶液使其褪色，室溫靜置30 min，于波長519 nm處測定吸光度記為A1；空白以95%乙醇溶液代替功效凝膠測得吸光值記為A0；以0.2 mg.ml^-1 維生素C作為對照。

DPPH的清除率公式如下：

此時DPPH清除率平均值為82%，與0.2 mg.ml^-1的維生素C溶液2mL相當(dāng)。

2、功效凝膠劑清除超氧陰離子能力的測定

按照抗超氧陰離子自由基測定試劑盒說明書步驟操作測定功效凝膠劑抑制超氧陰離子自由基的能力，以相當(dāng)量的維生素C作為標(biāo)準(zhǔn)對照，重復(fù)三次取平均值。

其公式為：

測得1g功效凝膠劑抗超氧陰離子活力為32.6U.L^-1，與1mg的維生素C相當(dāng)。

3、功效凝膠劑清除羥自由基能力的測定

按照羥自由基測定試劑盒說明書的步驟測定功效凝膠劑抑制羥自由基能力，以相當(dāng)量的維生素C作為標(biāo)準(zhǔn)對照，重復(fù)三次取平均值。

其公式為：

測得1g功效凝膠劑抑制羥自由基活力為35.30 u.ml^-1 ，與0.001 mg.ml^-1的維生素C溶液相當(dāng)。

4、功效凝膠劑抗衰老能力的實驗：

1）將48只小鼠分為衰老組（n =40）和正常對照組（n =8），適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，衰老組小鼠頸背部皮下注射20% D-半乳糖1 g.kg^-1.d^-1，正常對照組注射2 ml.kg^-1.d^-1 生理鹽水，造模時間共42天。

從造模第11天起，將衰老組小鼠隨機(jī)分成功效凝膠高、中、低劑量組、陽性對照組、模型組，每組8只，經(jīng)皮給藥劑量分別為30，20，10 mg.kg^-1.d^-1、維生素E 20 mg.kg^-1.d^-1及生理鹽水 20 ml.kg^-1.d^-1；正常對照組給予20 ml.kg^-1.d^-1的生理鹽水，連續(xù)給藥32天。

2）標(biāo)本收集及處理：

①小鼠給藥期間每隔一周稱重；處死后取其腹部皮膚酒精消毒，去除皮下脂肪，取0.5cm×0.5cm大小皮膚于-80℃保存。準(zhǔn)確稱取剩余動物皮膚重量（g）︰生理鹽水體積=1︰3，冰水浴條件下機(jī)械勻漿制成33.3%的勻漿液。取一半勻漿液3000r.min^-1，10min離心得上清液。

②小鼠眼眶靜脈叢取血，將血置于肝素管中，于3000 r/min離心15 min，取上清液300 μl，置于1.5 ml離心管中，加入乙腈0.6 ml，渦旋混合2 min，于3000 r/min離心15 min，吸取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，待測。

3）指標(biāo)檢測：

（1）一般情況觀察 ：

觀察各組小鼠的精神狀態(tài)，活動情況，毛發(fā)光澤度，體重等等。

（2）皮膚切片：

取0.5cm×0.5cm大小的皮膚，冷凍切片后用AFF液（40%甲醛15 ml，95%乙醇80 ml，冰醋酸5 ml）固定1 min，HE染色，封片。

（3）SOD含量測定：

按照SOD試劑盒說明書步驟測定皮膚上清液在波長550 nm處的吸光度。計算公式：

（4）MDA含量測定 按照MDA試劑盒說明書步驟測定皮膚勻漿液在波長532 nm處的吸光度，計算公式：

4）統(tǒng)計學(xué)處理：

計量結(jié)果用表示，應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用單因素方差分析并做多重比較。以P<0.05，P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

5）結(jié)果：

（1）一般情況比較：

正常組食欲佳，精神好，毛色光澤，反應(yīng)靈敏，動作敏捷。

20 mg.kg^-1.d^-1、30 mg.kg^-1.d^-1功效凝膠組、VE組食欲佳，精神好，毛色光澤，反應(yīng)靈敏。

10 mg.kg^-1.d^-1功效凝膠組食欲一般，毛色暗淡，反應(yīng)遲鈍，不喜運(yùn)動。

衰老組小鼠食欲欠佳，怕冷，掉毛，反應(yīng)遲鈍，不喜運(yùn)動，死亡一只。

（2）各組小鼠體重的比較：

正常組小鼠的體重持續(xù)增長，其他各組小鼠的體重均有所增長，實驗結(jié)束時，模型組小鼠體重與正常組比較已有顯著差異（P<0.01，P<0.05），其中功效凝膠高、中、低劑量組在功效凝膠干預(yù)后與模型組相比均有顯著差異（P<0.01，P<0.05）見下表（, n=8）。

注：與正常組比較，a：P<0.05， b：P<0.01；與模型組比較，c：P<0.05，d： P<0.01。

（3）各組小鼠皮膚組織SOD含量、MDA含量的比較：

模型組的小鼠皮膚組織SOD含量明顯小于正常組，MDA含量明顯高于正常組（P<0.01，P<0.05），經(jīng)過功效凝膠干預(yù)后，功效凝膠高、中、低劑量組與模型組相比均有顯著差異（P<0.01，P<0.05）見下表。

功效凝膠對衰老小鼠SOD含量、MDA含量的影響（, n=8）

注：與正常組比較，a：P<0.05， b：P<0.01；與模型組比較，c：P<0.05，d： P<0.01。

（4）各組小鼠血清SOD和MDA含量的比較：

模型組的小鼠血清中SOD含量明顯小于正常組，MDA含量明顯高于正常組（P<0.01，P<0.05），經(jīng)過功效凝膠干預(yù)后，功效凝膠高、中、低劑量組及陽性對照組與模型組相比均有顯著差異（P<0.01，P<0.05），見下表（, n=8）

注：與正常組比較，a：P<0.05， b：P<0.01；與模型組比較，c：P<0.05，d： P<0.01。

（5）各組小鼠皮膚組織切片比較：

HE病理染色可見正常組小鼠表皮層規(guī)則，厚度正常，細(xì)胞排列整齊。與正常組相比，模型組表皮不規(guī)則，厚度變薄，細(xì)胞排列紊亂；經(jīng)過功效凝膠干預(yù)之后，功效凝膠高、中、低劑量組表皮層規(guī)則，厚度增加，細(xì)胞排列整齊，見附圖9至圖14所示。

根據(jù)自由基學(xué)說，機(jī)體內(nèi)過量的自由基毒害性攻擊染色體、線粒體、細(xì)胞膜和結(jié)締組織等生物組織而導(dǎo)致機(jī)體衰老。本實驗分別測定了清除二苯代苦味?；杂苫―PPH）能力、清除超氧陰離子能力、清除羥自由基能力來評價功效凝膠體外抗氧化能力。SOD在生物體內(nèi)的水平高低可以直觀評價衰老與死亡，它可對抗與阻斷氧自由基對細(xì)胞造成的損害，并及時修復(fù)損傷細(xì)胞。MDA 是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)后得到的終產(chǎn)物，可間接反應(yīng)細(xì)胞損傷程度。因此可以通過測定體內(nèi)SOD含量、MDA含量來評價體內(nèi)抗氧化能力。本實驗以維生素E作為陽性對照，觀察功效凝膠對衰老小鼠體重，皮膚組織內(nèi)SOD含量、MDA含量，皮膚組織病變程度等指標(biāo)的影響來評價功效凝膠體內(nèi)抗氧化能力。實驗結(jié)果表明：應(yīng)用20% D-半乳糖注射小鼠，1周后小鼠體重并未增長，6周后模型組小鼠的體重、SOD含量、MDA含量較正常組均有顯著差異，皮膚表皮層明顯變薄，提示衰老小鼠模型制作成功。小鼠給予30，20，10 mg.kg^-1.d^-1功效凝膠6周后，雖然低劑量組小鼠的體重、SOD含量、MDA含量沒有顯著差異，但是高、中劑量組小鼠的體重、SOD含量均有明顯上升（P<0.05，P<0.01），MDA含量有明顯下降（P<0.05，P<0.01）；三組小鼠的皮膚表皮層均有所增厚。

通過以上實驗結(jié)果顯示：功效凝膠體外具有清除自由基的能力，從而減輕自由基對生物組織的傷害，還具有延緩機(jī)體衰老的功能。功效凝膠干預(yù)治療衰老小鼠之后，體內(nèi)SOD含量增加，阻礙了氧自由基對細(xì)胞的損害，并及時修復(fù)損傷細(xì)胞；體內(nèi)MDA 含量的減少也反應(yīng)了細(xì)胞損傷程度的降低。