本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物及其耐藥逆轉應用，具體涉及通過阻斷代謝方式、將抗腫瘤藥物和代謝阻斷劑共載于納米載體的混合制劑及其用途。

背景技術：

腫瘤相比于正常組織有著獨特的病理特征。正常細胞可根據(jù)所處環(huán)境的氧含量而調節(jié)呼吸方式(在有氧情況下進行有氧呼吸，缺氧時主要依賴無氧糖酵解)。然而，腫瘤細胞則以有氧糖酵解為主要呼吸方式，這種特殊的現(xiàn)象即為瓦博格效應(Warburg effect)。這種非正常的代謝方式為腫瘤的蛋白質合成、核酸合成和脂類合成等生命活動提供能量。對于耐藥細胞而言，非正常的代謝與耐藥性的產(chǎn)生緊密相關，例如，腫瘤細胞通過ATP依賴的轉運蛋白增加對治療藥物的外排能力；線粒體對膜通透的耐受；抗凋亡通路激活(Bcl-2上調)和凋亡抑制(caspase-3下調)等。相關研究表明阻斷代謝能夠增加腫瘤治療的效果，但是很少提到其對耐藥逆轉的作用。而且代謝阻斷劑單獨使用時藥效往往較弱，生物利用度較低。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種聯(lián)合代謝阻斷的納米劑型及其耐藥逆轉應用，兼顧腫瘤細胞的代謝阻斷作用以及克服腫瘤化療的多藥耐藥性。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：一種聯(lián)合代謝阻斷的納米劑型，包括代謝阻斷劑、細胞毒性藥物和納米載體；所述代謝阻斷劑包括抑制細胞糖酵解及三羧酸循環(huán)的抑制劑；所述細胞毒性藥物包括生物堿類、抗生素類、代謝類和鉑類抗腫瘤藥物；所述納米載體包括脂質體，兩親性樹狀分子、聚乳酸。

上述細胞毒性藥物選自阿霉素(抗生素類)、紫杉醇(生物堿類)、喜樹堿(生物堿類)、順鉑(鉑類)、奧沙利鉑(鉑類)或吉西他濱(代謝類)。本發(fā)明將代謝阻斷劑與細胞毒性抗腫瘤藥物聯(lián)用，發(fā)揮兩者的協(xié)同作用，有望提高腫瘤治療的效果。同時，結合納米劑型提高藥物的生物利用度。

針對上述問題，本發(fā)明提供了一種聯(lián)合代謝阻斷的納米劑型與抗腫瘤化療多藥耐藥逆轉策略，以能量代謝通路中各個關鍵蛋白(如，己糖激酶)為靶標，特異性阻斷腫瘤的能量來源，抑制外排能力，同時作用于線粒體，擾亂線粒體膜電位，激活凋亡通路，抑制抗凋亡作用，實現(xiàn)與化療藥物的協(xié)同作用。納米劑型能夠提高代謝阻斷劑的生物利用度，包括提高體內循環(huán)時間、腫瘤組織靶向、細胞攝取和胞內定點釋放等。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種抗腫瘤藥物聯(lián)合代謝阻斷劑。

作為可選方式代謝阻斷劑可以為(STF-31，葡萄糖轉運體1抑制劑)、(Lonidamine，己糖激酶2抑制劑)、(CPI-613，丙酮酸脫氫酶抑制劑)、(AZD3965，單羧酸轉運蛋白1抑制劑)中的一種。

作為可選方式，與代謝阻斷劑聯(lián)用的抗腫瘤藥物(即細胞毒性藥物)可以為阿霉素、紫杉醇、喜樹堿和吉西他濱中的一種。

本發(fā)明還提供了一種納米化的藥物遞送方式。

作為可選方式，包載代謝阻斷劑和抗腫瘤藥物的納米載體可以為脂質體，PLGA，兩親性樹狀分子中的一種。

作為可選方式，可將代謝阻斷劑和抗腫瘤藥物中的一種修飾為兩親性前藥分子，通過組裝形成的納米粒包載另一種藥物，所用于修飾的分子可以為肽類樹狀大分子，聚合物，磷脂中的一種。

本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種新的聯(lián)合治療策略，將抗腫瘤藥物與代謝阻斷劑聯(lián)合使用，針對腫瘤細胞及耐藥腫瘤細胞的代謝特性，以代謝通路中的關鍵蛋白為靶標，利用代謝抑制劑進行分子靶向治療。成功阻斷了腫瘤細胞的物質合成和能量供應，增加腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性，克服多藥耐藥。

本說明提供的納米化的聯(lián)合治療策略，增加也了藥物的水溶性，利用納米粒子被動靶向至腫瘤組織的特性，解決了抗腫瘤藥物及代謝阻斷劑的體內循環(huán)、生物分布和毒副作用等問題。

附圖說明

圖1為示意圖。

圖2a為L-NPs的粒。

圖2b為透射電鏡照片。

圖2c為原子力顯微鏡照片。

圖3為不同環(huán)境中LND的累積釋放曲線。

圖4為MCF7/ADR與不同濃度的Dendrimer、DOX、DOX.HCl、NPs和L-NPs孵育48h后的細胞毒性。

圖5為MCF7/ADR對DiIC₁(5)和DiIC₁(5)-NPs的攝取照片。

圖6為己糖激酶活性測定。

圖7為ATP含量測定。

圖8為藥物外排測定。

圖9為線粒體膜電位測定，分別用流式細胞儀(左)和共聚焦顯微鏡(右)定量和定性測定MCF7/ADR細胞的線粒體膜電位。

圖10為免疫蛋白質印跡法分析不同藥物處理后MCF7/ADR細胞內Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達水平。

圖11a為MCF7/ADR細胞內caspase-3活性測定，通過激光共聚焦顯微鏡照片測定(caspase-3活性與其熒光強度呈正相關)。

圖11b為熒光強度定量分析數(shù)據(jù)。

圖12為凋亡檢測：不同藥物處理后，通過Annexin V-FITC/PI染色，檢測MCF7/ADR細胞凋亡比例。

圖13為體外滲透研究：激光共聚焦觀察游離的DiIC₁(5)和DiIC₁(5)-NPs在MCF7/ADR細胞球內的分布。

圖14為1h、3h、6h和12h時DOX.HCl、NPs和L-NPs在體內的分布。

圖15為離體組織分布照片：利用小動物活體成像儀觀察DOX在各個組織的分布。

圖16為MCF7/ADR腫瘤體積變化。

圖17為治療結束后心、肝、脾、肺和腎的病理切片。

圖18為治療后腫瘤組織的免疫組化切片分析。

圖19為不同時間點DOX.HCl、NPs和L-NPs在體內的血藥濃度。

具體實施方式

以下通過實施例的具體實施方式再對本發(fā)明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應當將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。在不脫離本發(fā)明的精神和原則之內做的任何修改，以及根據(jù)本領域普通技術知識和慣用手段做出的等同替換或者改進，均應包括在本發(fā)明的保護范圍內。

實施例1：兩親性前藥分子(DPs)的制備

將多重敏感的樹狀分子與阿霉素(DOX)通過酸敏感的腙鍵偶聯(lián)。精確稱取0.5g多重敏感的樹狀分子和115.83mg鹽酸阿霉素置于帶有支管的單口瓶中，氮氣保護下加入甲醇溶解，并加入催化量的冰醋酸。室溫反應72小時，減壓濃縮，加入蒸餾水溶解。將溶液置于截留分子量為2000Da的透析袋中透析，然后冷凍干燥得到DPs。

實施例2：將客體分子包載于前藥納米粒子中。

將客體分子(包括親水性或疏水性的分子)與前藥分子共同溶解于DMSO中，充分混合后，在超聲條件下滴入水中，然后用截留分子量為2000Da的透析袋透析，冷凍干燥后得到載藥納米粒子。

將Lonidamine(LND，己糖激酶抑制劑)以LND：DOX＝1:2(質量比)的比例，按照上述方法包載于前藥納米粒子中制備得到LND包載的納米粒子(L-NPs)。

實施例3：L-NPs的表征

配置100μg/mL L-NPs的水溶液，利用動態(tài)光散射激光粒度儀(DLS)測定其粒徑和電位。

將L-NPs的水溶液滴在銅網(wǎng)上室溫揮干，然后用透射電子顯微鏡觀察。

將L-NPs的水溶液滴在云母片上室溫揮干，然后用原子力顯微鏡觀察其納米結構。

如圖2所示，DLS測定L-NPs的粒徑約為130nm。透射電鏡顯微鏡和原子力顯微鏡照片表示L-NPs具有規(guī)整的球型納米結構。

實施例4：L-NPs的體外釋放

將L-NPs溶解于1mLPBS中，分別溶解于1mL pH 7.4、2μg/mL金屬基質蛋白酶-2、10mM DTT、10μM DTT、pH 6.8和pH 5.0的TCNB緩沖液中，并轉移截留分子量為1000Da的透析袋中。在預先設定的時間點取出1mL外液，然后再補加1mL外液。樣品中的LND含量用高效液相色譜測定，DOX含量用熒光光譜測定。

如圖3所示，LND在生理環(huán)境下(pH 7.4)釋放量較低，約為20％，10mMDTT及pH 5.0條件下組裝體解組裝LND快速釋放，12h內釋放量達到80％以上。然而，在腫瘤微環(huán)境條件下(pH 6.8和10μMDTT)釋放較少，約為20％。

實施例5：對耐藥腫瘤細胞的體外抗腫瘤效果

在96孔培養(yǎng)板中接種人乳腺癌阿霉素耐藥細胞系(MCF7/ADR)，細胞密度為1×10⁴細胞/孔。培養(yǎng)24h后加入不同LND濃度的L-NPs(DOX濃度恒定為10μg/mL，LND濃度為0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL)，孵育48h后，用CCK-8法測定細胞毒性。

在96孔培養(yǎng)板中接種人乳腺癌阿霉素耐藥細胞系(MCF7/ADR)，細胞密度為1×10⁴細胞/孔。培養(yǎng)24h后加入不同濃度的LND、DOX、DOX.HCl、NPs和L-NPs，孵育48h后，測定細胞存活率。

如圖3所示，DOX濃度恒定時，LND用量高于5μg/mL后體外腫瘤抑制效果不再提高，因此選擇LND 5μg/mL和DOX 10μg/mL進行后續(xù)研究。

如圖4所示，L-NPs對MCF7/ADR的抑制效果明顯優(yōu)于其他實驗組，IC50為8.4μg/mL，明顯低于DOX(55.7μg/mL)和DOX.HCl(27.4μg/mL)。表明LND與DOX聯(lián)用后能夠有效克服MCF7/ADR的耐藥性，提高藥效。

實施例6：細胞攝取研究

以熒光染料DiIC₁(5)作為模型分子，將其載入NPs內研究客體分子在胞內的遞送過程。

將MCF7/ADR細胞接種于玻底皿中，培養(yǎng)24h。加入包載DiIC₁(5)的NPs(NPs濃度為70μg/mL；DiIC₁(5)為3.5μg/mL)，與MCF7/ADR細胞孵育2h，然后用PBS洗兩次，利用共聚焦顯微鏡觀察藥物DOX和客體分子DiIC₁(5)的攝取量。

如圖5所示，與游離的DiIC₁(5)相比，將DiIC₁(5)包載入NPs后能夠增加細胞對其攝取量。

實施例7：耐藥逆轉機理研究

a)己糖激酶活性測定

LND能夠和己糖激酶結合抑制己糖激酶的活性，從而抑制葡萄糖轉化為6磷酸葡萄糖，阻斷糖酵解通路。

將MCF7/ADR細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，細胞密度為3×10⁵細胞/孔。培養(yǎng)24h后加入LND和L-NPs(LND濃度為1μg/mL、5μg/mL、10；DOX濃度為10μg/mL)，孵育24h。利用己糖激酶活性測定試劑盒(Hexokinase Colorimetric Assay Kit，Sigma)測定酶活。

如圖6所示，L-NPs能夠增加LND對己糖激酶活性的抑制。單獨使用LND時，己糖激酶活性只能降低10％左右。而L-NPs能夠抑制約50％。

b)胞內三磷酸腺苷(ATP)含量測定

將MCF7/ADR細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，細胞密度為3×10⁵細胞/孔。培養(yǎng)24h后加入LND和L-NPs(LND濃度為1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL；DOX濃度為10μg/mL)，孵育24h。利用ATP含量測定試劑盒(ATP assay kit，Beyotime)測定胞內ATP含量。

如圖7所示，L-NPs能夠有效降低胞內ATP的水平，阻斷藥物外排的能量來源。c)藥物外排研究

MCF7/ADR細胞的耐藥機理為藥物外排轉運體的高表達，外排轉運體發(fā)揮功能時需要消耗ATP，因此LND將ATP合成通路阻斷后會抑制外排轉運體功能的發(fā)揮。

將MCF7/ADR細胞接種于12孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)12h。除去培養(yǎng)基，加入DOX.HCl、NPs和L-NPs(5μg/mL LND；10μg/mL DOX)，在無血清條件下孵育2h。將藥物除去后用PBS洗兩遍，加入培養(yǎng)基。在預設的時間點收集各個孔的培養(yǎng)基，然后將細胞裂解。培養(yǎng)基及細胞裂解液中的DOX通過酸堿處理后，利用氯仿將其萃取至有機相，將有機溶劑揮干，用DMSO溶解。通過熒光光譜測定DOX含量。

如圖8所示，外排6h后L-NPs組的外排量較低，為19.2％，而DOX.HCl組接近60％。表明L-NPs能夠抑制耐藥細胞對藥物的外排作用。

d)線粒體膜電位測定

LND能夠作用于線粒體，引起線粒體膜電位的降低，激活凋亡通路。

將MCF7/ADR細胞接種于玻底皿，培養(yǎng)12h。加入DOX、DOX.HCl、LND、NPs和L-NPs(10μg/mL DOX；5μg/mL LND)孵育24h。將細胞用MitoView 633對線粒體染色，通過激光共聚焦觀察熒光強度。線粒體的熒光強度與線粒體膜電位呈正相關。將MCF7/ADR細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，通過相同的處理后用流式細胞儀測定。

如圖9所示，DOX、DOX.HCl和LND對線粒體膜電位影響較小。L-NPs作用后細胞的紅色熒光明顯減弱，且流式分析的結果也與此一致。

e)凋亡蛋白檢測

凋亡通路激活后，引起凋亡相關蛋白(如，Bcl-2、Caspase-3等)的上調或下調。

將MCF7/ADR細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12h。加入DOX、DOX.HCl、LND、NPs和L-NPs(10μg/mL DOX；5μg/mL LND)孵育48h。將細胞收集后通過蛋白印記法定性分析細胞內Bcl-2和Caspase-3蛋白的含量。

如圖10所示，與DOX、DOX.HCl和LND相比，L-NPs能夠提高胞內促凋亡蛋白Caspase-3的水平，同時降低抗凋亡蛋白Bcl-2的水平。

f)Caspase-3活性檢測

將MCF7/ADR細胞接種至玻底皿中，培養(yǎng)12h。加入DOX、DOX.HCl、LND、NPs和L-NPs(10μg/mL DOX；5μg/mL LND)孵育36h。用PBS洗兩次，加入caspase-3活性檢測染料NucView 405。Caspase-3的活性與熒光強度呈正相關。利用LAS X軟件計算每個細胞的平均熒光強度值。

如圖11所示，L-NPs組的綠色細胞明顯多于其他各組，且熒光定量結果也表明L-NPs組的caspase-3活性比空白組提高了6倍。

實施例8：凋亡檢測

將MCF7/ADR細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12h。加入DOX、DOX.HCl、LND、NPs和L-NPs(10μg/mL DOX；5μg/mL LND)孵育36h。將細胞用胰酶消化后收集，離心，用PBS洗兩次。然后加入Annexin V-FITC/PI凋亡檢測液，染色20min，利用流式細胞儀檢測。

如圖12所示，L-NPs引起晚期凋亡的比例達到55.2％，而DOX、DOX.HCl、LND和NPs組的晚期凋亡數(shù)量僅為3.6％、5.1％、0.5％和36.8％。

實施例9：DiIC₁(5)-NPs的滲透效果

利用腫瘤多細胞球作為體外滲透模型。將MCF7/ADR細胞接種于1％瓊脂糖的包覆6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)約10天，腫瘤多細胞球直徑達到約200μm。將細胞球轉移至玻底皿中，加入DiIC₁(5)包載的NPs，孵育2h，用共聚焦顯微鏡觀察各個層面中DOX和DiIC₁(5)的分布。

如圖13所示，與游離的DiIC₁(5)相比DiIC₁(5)-NPs能夠滲透至腫瘤多細胞球的深處，而DiIC₁(5)大部分分布在細胞球的外圍。

實施例10：體內藥物分布

將MCF7/ADR細胞接種于Balb/c裸鼠背部右側腋下皮下位置，接種密度為1×10⁷細胞/只。腫瘤形成后，通過尾靜脈注射生理鹽水、DOX.HCl、NPs和L-NPs(5mg LND/kg；10mg DOX/kg)。利用小動物活體成像，分別觀察1h、3h和12hDOX的熒光分布。觀察結束后將動物處死，收集心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織，觀察離體組織的DOX熒光。然后將腫瘤組織冰凍切片，分別用DAPI和AF594-CD31抗體標記細胞核和腫瘤血管。

如圖14和15所示，NPs和L-NPs能夠富集在腫瘤部位。L-NPs將能量代謝通路抑制后能夠較多的富集在腫瘤部位。

如圖15所示，L-NPs能夠將DOX遞送至腫瘤部位，且分布均勻。

實施例11：體內抗腫瘤效果

腫瘤體積達到50mm³時，通過尾靜脈注射生理鹽水、DOX.HCl、NPs和L-NPs(2.5mg LND/kg；5mg DOX/kg)進行治療，每隔兩天治療一次，共4次。同時測定小鼠的腫瘤體積和體重，每隔兩天測量一次，共測量9次。

治療結束后將小鼠處死，收集心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織，通過H&E染色觀察各個組織的病理變化。利用免疫組織化學法觀察腫瘤組織的凋亡(Tunel)、新生血管(CD-31)和增殖細胞(Ki67)的數(shù)量。

如圖16所示，L-NPs對于MCF7/ADR耐藥腫瘤的抑制效果最好，腫瘤增長緩慢，抑制率達到84％。DOX.HCl的抑制率僅為32％。

如圖17所示，H&E染色結果表明DOX.HCl對小鼠的心臟毒性較大，心臟的病理變化明顯。而NPs和L-NPs對正常組織影響較小。而對于腫瘤組織，L-NPs組腫瘤細胞較稀疏。

如圖18所示，L-NPs能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖(Ki67)，同時凋亡細胞明顯增多(Tunel)。

實施例12：藥物代謝動力學研究

將BALB/c小鼠隨機分為三組每組18只，通過尾靜脈注射DOX.HCl、NPs和L-NPs，藥物濃度為10mg DOX/kg。在給藥后2min,30min,1h,6h和12h，通過小鼠眼球取血，并分離血漿。將血漿利用酸堿處理后，用氯仿/異丙醇(體積比為4:1)將藥物萃取至有機相。有機溶劑揮發(fā)干后加入100μL乙腈，用高效液相色譜分析藥物濃度。如圖19所示，NPs和L-NPs能夠明顯增加藥物的血液循環(huán)時間，避免被內皮網(wǎng)狀系統(tǒng)清除。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，對本發(fā)明而言僅是說明性的，而非限制性的；本領域普通技術人員理解，在本發(fā)明權利要求所限定的精神和范圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護范圍。