本發(fā)明屬于醫(yī)用敷料領(lǐng)域，涉及一種凝膠敷料及其制備方法，特別是涉及一種可促進傷口愈合基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料及其制備方法。

背景技術(shù)：

傷口是正常皮膚在外界因素如外科手術(shù)、熱、外力、電流、低溫等作用下所造成的損傷。若處理不及時，傷口可能會感染，或者進一步惡化。傳統(tǒng)上常使用的敷料是紗布、棉料等材料，但是這些敷料在止血、保濕、防止傷口感染和促進傷口愈合等方面的效果差強人意。

膠原蛋白是動物結(jié)締組織的主要成分，也是哺乳動物體內(nèi)含量最多的功能性蛋白。由于其低免疫原性、降解性、生物相容性及凝血性等特性，膠原蛋白已被廣泛地作為生物材料。相較于其它的傷口敷料，含膠原蛋白的凝膠敷料制備簡便、耗時短和生物活性好，對傷口愈合具有良好效果。

已存在的凝膠敷料主要還存在以下幾個問題：I.制備方面，凝膠的合成還存在制備復(fù)雜、耗時長等不足。II.性能方面，凝膠機械強度較差且具有一定的生物毒性。III傷口愈合方面，部分敷料存在透氣性差及傷口愈合時間長。因此，制備出簡便、有效的凝膠敷料用于傷口的快速愈合，將具有重要的研究意義和應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明的目的在于解決了凝膠敷料的制備繁雜問題，克服了凝膠敷料透氣性差、愈合時間長、生物相容性差的不足；選用可降解的、生物相容性好的G-四聯(lián)體和膠原蛋白作為原料，制備得到的基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料具有良好的機械性能，保持對傷口的保濕、黏附并避免感染，有效地、快速地促進傷口的愈合。

本發(fā)明制備可促進傷口愈合的G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料的反應(yīng)機理如圖1所示：

鳥嘌呤核苷與鄰近的鳥嘌呤核苷因為氫鍵的作用結(jié)合在一起，這樣相連的四個鳥嘌呤核苷與一個K+配位，形成G-四聯(lián)體；G-四聯(lián)體之間通過硼酸根橋連在一起，形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)加入膠原蛋白時，膠原蛋白會嵌入其中，最終形成基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠。

根據(jù)上述原理，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料的制備方法，包括以下步驟：

(1)將鳥嘌呤核苷、硼酸與氫氧化鉀加入水中，加熱，待鳥嘌呤核苷完全溶解，得到G-四聯(lián)體溶液；

(2)待步驟(1)中的G-四聯(lián)體溶液冷卻后，加入膠原蛋白，使膠原蛋白分散，得到所述基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料。

其中，所述步驟(1)中，

所述鳥嘌呤核苷還可以用腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷替代。

所述氫氧化鉀還可以用氫氧化鈉、氫氧化鋰替代。

所述鳥嘌呤核苷、硼酸與氫氧化鉀的摩爾比為1～3：1：1；優(yōu)選地為，2：1：1。

所述水為去離子水。

所述加熱的溫度為90～98℃；優(yōu)選地為95℃。

所述加熱的時間為15-25；優(yōu)選地為15-20分鐘。

其中，所述步驟(2)中，

所述冷卻的溫度為35～40℃。

所述膠原蛋白可以來自但不限于羅非魚魚皮、鱈魚魚皮。

所述膠原蛋白分散后的濃度為2～10mg/mL；優(yōu)選地為5mg/mL。

具體地，所述步驟包括：

(1)將鳥嘌呤核苷、硼酸與氫氧化鉀按照1～3：1：1的摩爾比加入到去離子水中，震蕩5～10分鐘，水浴加熱到90～98℃，保持恒溫15～25分鐘，待鳥嘌呤核苷完全溶解，得到G-四聯(lián)體。

(2)將上述步驟(1)的溶液緩慢冷卻到35～40℃之間，水浴保持恒溫，加入膠原蛋白，使膠原蛋白在溶液中的濃度為2～10mg/mL，搖晃使其迅速分散，冷卻到室溫，制得基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料。

其中，步驟(1)中，在加入鳥嘌呤核苷后，先加入硼酸，再加入氫氧化鉀，且加入硼酸或氫氧化鉀后，迅速搖晃20s，這樣有助于鳥嘌呤核苷的溶解。

其中，步驟(1)中，鳥嘌呤核苷、硼酸與氫氧化鉀的摩爾比為2：1：1，水浴加熱溫度為95℃反應(yīng)條件最佳；上述步驟(2)中的膠原蛋白的濃度為5mg/mL時敷料效果最佳。

本發(fā)明還提出了由上述制備方法制備得到的基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料。

本發(fā)明的基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料組成簡單、制備方便，透氣性能好，黏附性強，機械性能好，生物相容性好。

本發(fā)明還提出了所述基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料在促進傷口處細胞的增殖、分化中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出了所述基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料在制備促進傷口愈合的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料可以作為一種生物材料。

本發(fā)明中，所述基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料可以加速傷口的愈合。

本發(fā)明中，所述基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料用于小鼠傷口愈合，具有如下特征：①止血快，吸收組織分泌液，增強在傷口的黏附力；②維持傷口相對濕潤的環(huán)境，降低感染機率；③加速細胞增殖、分化，促進皮膚的再生。

本發(fā)明中，所述基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料，包括但不限于作為傷口敷料。

本發(fā)明中，所述基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料，包括但不限于用于小鼠傷口的愈合。

本發(fā)明中，所述基于G四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料，包括但不限于用于藥物的負載。

本發(fā)明所提供的基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料的制備方法，反應(yīng)條件簡單，合成步驟少，耗時短，生產(chǎn)成本低。本發(fā)明所提供的基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白凝膠敷料用于傷口愈合，具有生物相容性好、透氣性好、黏附性強、含水量高的優(yōu)點，維持傷口濕潤的環(huán)境，使傷口不易結(jié)痂。本發(fā)明所述的基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料不含任何刺激性成分，無毒副作用。本發(fā)明所提供的基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料用于加速傷口愈合，具有潛在的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1是本發(fā)明制備基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料的反應(yīng)機理圖。

圖2是實施例2中制備的凝膠。

圖3是對照組、治療組(實施例2中制備的凝膠)傷口在第0、3、5、7天的愈合情況。

圖4是對照組、治療組(實施例2中制備的凝膠)在第0、3、5、7天的傷口面積差異。

圖5是對照組、治療組(實施例2中制備的凝膠)在第3、5、7天的組織學(xué)情況。

圖6是對照組、治療組(實施例2中制備的凝膠)的細胞毒性實驗。

具體實施方式

結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明。實施本發(fā)明的過程、條件、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

實施例1

(1)將鳥嘌呤核苷、硼酸與氫氧化鉀按照1：1：1的摩爾比加入到去離子水中，震蕩5分鐘，水浴加熱到90℃，恒溫20分鐘，待鳥嘌呤核苷完全溶解。

(2)將上述溶液緩慢冷卻到37℃，水浴保持恒溫，加入膠原蛋白，使膠原蛋白在溶液中的濃度為5mg/mL，搖晃使其迅速分散，冷卻到室溫，制得基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料。

實施例2

(1)將鳥嘌呤核苷、硼酸與氫氧化鉀按照2：1：1的摩爾比加入到去離子水中，震蕩10分鐘，水浴加熱到95℃，保持恒溫15分鐘，待鳥嘌呤核苷完全溶解。

(2)將上述的溶液緩慢冷卻到40℃之間，水浴保持恒溫，加入膠原蛋白，使膠原蛋白在溶液中的濃度為7mg/mL，搖晃使其迅速分散，冷卻到室溫，制得基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料。制備的凝膠見圖2所示。將制備好的凝膠倒立放置時，凝膠會粘在瓶壁上，不像水溶液會流下去；且經(jīng)過15天后，凝膠倒立放置仍會粘在瓶壁上。這說明了基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料具有良好的機械性能。

實施例3：

以實驗例2中制備的凝膠用于小鼠傷口的愈合，作為治療組。

本實驗采用手術(shù)方法在ICR小鼠背部制作創(chuàng)傷性疤痕模型。通過在創(chuàng)傷表面涂抹凝膠，每天觀察表面疤痕平復(fù)情況，評價產(chǎn)品對疤痕的修復(fù)功效。

(1)造模

在1％戊巴比妥鈉5mL/kg腹腔注射麻醉下，對小鼠背部進行剪毛，用4％硫化鈉脫毛，平行脊椎兩側(cè)分別作直徑約為1.5cm的圓形切口。如輕微出血則以無菌棉球擦拭止血后，送回鼠盒中。

(2)動物分組

將造模成功的ICR小鼠隨機分為a、b、c組，每組3只。

A對照組：將小鼠右側(cè)的傷口作為對照組。

B治療組：將小鼠左側(cè)的傷口作為治療組。

對照組不做任何處理，讓其正常愈合。將凝膠敷料涂抹在治療組創(chuàng)面上，每天涂抹一次，每天觀察表面疤痕修復(fù)情況。當(dāng)實驗進行至第3天時，對a組小鼠進行處理，將傷口制作成切片，用于組織學(xué)表征，觀察傷口表層細胞的生長情況。當(dāng)實驗進行至第5天時，對b組小鼠進行處理，將傷口制作成切片，用于組織學(xué)表征，觀察傷口表層細胞的生長情況。當(dāng)實驗進行至第7天時，對c組小鼠進行處理，將傷口制作成切片，用于組織學(xué)表征，觀察傷口表層細胞的生長情況。

(3)結(jié)果

如圖3所示，將凝膠敷料涂抹到小鼠傷口，敷料會黏附在傷口上，不會像液體脫落，這說明敷料較強的粘附性；經(jīng)過4h后，敷料會風(fēng)干，說明透氣性好。手術(shù)第3天時，小鼠傷口發(fā)生一定的收縮及結(jié)痂現(xiàn)象，但是明顯可以觀察對照組與治療組小鼠傷口的愈合有明顯的區(qū)別。由于，對治療組進行凝膠敷料涂抹治療的疤痕愈合速率明顯好于對照組。到第7天，治療組小鼠傷口面積極小，基本愈合完全，恢復(fù)效果好。

如圖4所示，通過對照組、治療組傷口面積在不同時間段的比較，明顯觀察到治療組的傷口愈合速率遠勝于對照組，說明基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料用于傷口愈合具有良好的效果。

如圖5所示，由于對治療組進行了凝膠敷料的涂抹，膠原蛋白促進了傷口處細胞的增殖、分化。從組織學(xué)觀察到治療組的細胞上皮化程度優(yōu)于對照組，促使治療組小鼠皮膚的再生明顯快于對照組。到第7天，治療組小鼠皮膚基本上已經(jīng)再生完全。

實施例4細胞毒性實驗

用0.22μm無菌濾膜對實驗例2中制備的凝膠進行過濾，除去凝膠中的細菌。將除菌的凝膠用于纖維母細胞毒性實驗，作為治療組；空白作為對照組。

本實驗采用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)法測定細胞的活力。通過測定凝膠對細胞的毒性，進而評價凝膠的生物相容性。

(1)用無菌PBS充填96孔板的邊緣孔；收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸浮濃度為50000個/mL，每孔加入100μL細胞懸液。

(2)5％CO₂，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底，加入10μL 5mg/mL凝膠。

(3)細胞放入培養(yǎng)箱，在5％CO₂，37℃孵育24h，倒置顯微鏡下觀察。

(4)每孔加入20μL 5mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h。

(5)終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；每孔加入150μL二甲基亞砜，搖床低速振蕩10分鐘，之后用酶標(biāo)儀檢測OD490nm各孔的吸光值。

(6)同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、同濃度的凝膠、培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)。

(7)計算細胞存活率(cell viability)：

細胞存活率＝(凝膠組A值-調(diào)零孔A值)/(對照孔A值-調(diào)零孔A值)×100％

如圖6所示，用纖維母細胞進行細胞毒性實驗。實驗結(jié)果顯示：對照組和治療組的細胞存活率都接近于100％。這說明凝膠敷料對纖維母細胞的毒性非常小，也就是說明凝膠敷料的生物相容性好。

如上所述僅為本發(fā)明的幾個具體實施例，并不用于限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，采用與其相同或相似方法所得到的基于G-四聯(lián)體/膠原蛋白的凝膠敷料用于傷口愈合，均在本發(fā)明保護范圍內(nèi)。