本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，涉及一種樹鼩自由落體腦外傷模型的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：神經(jīng)系統(tǒng)疾病是指發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)的以感覺、運動、意識、自主神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為主要表現(xiàn)的疾病。神經(jīng)疾病的發(fā)生和發(fā)展十分復(fù)雜，以人作為實驗對象來深入探討疾病的發(fā)生機制，推動醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展過程緩慢，臨床積累的經(jīng)驗不僅在時間和空間上都存在局限想，而且許多實驗在倫理上和方法上受到限制。而借助于動物模型的間接研究，可以有意識地改變那些在自然條件下不能或不易排出的因素，以便更準確的觀察模型的實驗結(jié)果比較研究，有助于更方便、更有效地認識人類疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，研究防治措施。腦外傷是常見且嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，是醫(yī)學(xué)研究的難點和熱點。為了有效評估后干預(yù)措施的效果，需要理想的復(fù)制人類的實驗動物模型，腦外傷模型在中較為常用。而樹鼩比大小鼠更加接近人類，可以更好的復(fù)制人類疾病。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明針對上述的問題，提供了一種樹鼩自由落體腦外傷模型的構(gòu)建方法，本實驗制備樹鼩的腦外傷模型，建立模型制備技術(shù)規(guī)范，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究奠定基礎(chǔ)。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種樹鼩自由落體腦外傷模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)成年雄性樹鼩16只，隨機分為假手術(shù)組8只和TBI組8只；將樹鼩提前3天單獨喂養(yǎng)，術(shù)前禁食8小時，實驗時用質(zhì)量百分含量為3.6％水合氯醛以1ml每100g劑量腹腔內(nèi)注射麻醉，俯臥位固定于腦立體定位儀支架上；(2)消毒皮膚，正中剪開，剝離骨膜，暴露右頂骨；用牙科鉆在冠狀縫后1.5mm，中線后2.5mm處鉆直徑為5mm骨窗，保持硬膜完整；(3)將撞桿置于硬膜上，用60g砝碼于10cm高度墜落，撞擊撞桿從而撞擊硬膜；(4)打擊后切口內(nèi)滴注4萬單位硫酸慶大霉素4-5滴，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮；(5)于恒溫烤箱旁護理，假手術(shù)組僅開顱窗后用骨蠟封閉，不施加打擊；(6)觀察記錄得分；(7)術(shù)后護理：術(shù)后將動物按一只一籠飼養(yǎng)，自然光、通風(fēng)；加強營養(yǎng)，喂食雞蛋、葵花籽，將飼料、飲水置于動物可及范圍；嚴密觀察動物精神狀態(tài)、飲食、排尿排便、有無肢體水腫壓傷、有無泌尿系統(tǒng)血性分泌物等情況，腹腔注射青霉素20萬u每次，每日2次；預(yù)防腸梗阻。進一步地，成年雄性樹鼩的大小為6-8個月，體重為190-210g。進一步地，撞擊撞桿的沖擊力大小為600g·cm。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：1)本模型腦組織局部損傷重，多位于同側(cè)大腦半球，非損傷區(qū)尤其是對側(cè)半球無明顯損傷。打擊部位位于頂葉支配運動和軀體感覺的“后肢”區(qū)域，此區(qū)相對平坦且操作方便。該區(qū)受損后可產(chǎn)生損傷對側(cè)肢體的神經(jīng)功能障礙，如活動受限、行動遲緩等。2)此模型死亡率低，未發(fā)現(xiàn)低位腦干及延髓損傷，可能與作用力方向向上的腦干壓縮損傷少有關(guān)。3)本模型與臨床腦外傷力學(xué)機制最相似，充分模擬臨床局灶性創(chuàng)傷性腦外傷及腦水腫，對損傷機制、生物學(xué)效應(yīng)及相關(guān)病生藥效學(xué)研究有重要價值。當然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術(shù)效果。附圖說明此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：圖1是本發(fā)明樹鼩顱腦打擊器；圖2是本發(fā)明樹鼩創(chuàng)傷性腦外傷打擊部位；圖3是本發(fā)明樹鼩檢測反應(yīng)箱；圖4是本發(fā)明翹尾附圖；圖5是本發(fā)明樹鼩跳高附圖；圖6是本發(fā)明樹鼩創(chuàng)傷性腦外傷意識評分結(jié)果，p<0.05；圖7是本發(fā)明樹鼩創(chuàng)傷性腦外傷最大速度評分結(jié)果，p<0.05；圖8是本發(fā)明樹鼩創(chuàng)傷性腦外傷直線行走評分結(jié)果，p<0.05；圖9是本發(fā)明樹鼩創(chuàng)傷性腦外傷翹尾評分結(jié)果，p<0.05；圖10是本發(fā)明樹鼩創(chuàng)傷性腦外傷跳高評分結(jié)果，p<0.05。具體實施方式以下將配合實施例來詳細說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。實施例1樹鼩自由落體腦外傷模型的構(gòu)建方法成年雄性樹鼩16只(6-8個月)，體重(200±10)g，隨機分為假手術(shù)組(n＝8)和TBI組(n＝8)。用瑞沃德生產(chǎn)的標準顱腦打擊器，以不同程度打擊力制作樹鼩腦外傷模型。該模型裝置(如圖1所示)由撞桿、下落擊錘和外周導(dǎo)管組成。撞桿頭端直徑4.5mm，高度2.5mm。外周導(dǎo)管高40cm，每隔1cm有一氣孔，以防擊錘下落時導(dǎo)管內(nèi)空氣壓縮阻力的影響。通過調(diào)節(jié)撞擊錘的重量和下落的高度來復(fù)制不同程度的腦皮質(zhì)挫傷模型(圖1)。在輕度損傷的情況下，這個模型類似于創(chuàng)傷性顱腦損傷的腦震蕩而并不出現(xiàn)明顯的挫傷或局灶性損害。如果進行更大力度的打擊，這個模型就可以制造類似于臨床見到的腦挫傷的局灶性損傷。該模型具體制作步驟為：(1)將樹鼩提前3天單獨喂養(yǎng)，術(shù)前禁食8小時。實驗時用質(zhì)量分數(shù)為3.6％(質(zhì)量百分數(shù)即3.6g溶入100ml蒸餾水)水合氯醛以1ml每100g劑量腹腔內(nèi)注射麻醉，俯臥位固定于腦立體定位儀支架上；(2)消毒皮膚，正中剪開，剝離骨膜，暴露右頂骨；用牙科鉆在冠狀縫后1.5mm，中線后2.5mm處鉆直徑為5mm骨窗，保持硬膜完整(圖2)；(3)將撞桿置于硬膜上，用60g砝碼于10cm高度墜落，撞擊撞桿從而撞擊硬膜，沖擊力大小為600g·cm；(4)打擊后切口內(nèi)滴注4萬單位硫酸慶大霉素4-5滴，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。(5)于恒溫烤箱旁護理。假手術(shù)組僅開顱窗后用骨蠟封閉，不施加打擊。(6)觀察記錄得分。(7)術(shù)后護理：術(shù)后將動物按一只一籠飼養(yǎng)，自然光、通風(fēng)；加強營養(yǎng)，喂食雞蛋、葵花籽，將飼料、飲水置于動物可及范圍；嚴密觀察動物精神狀態(tài)、飲食、排尿排便、有無肢體水腫壓傷、有無泌尿系統(tǒng)血性分泌物等情況，腹腔注射青霉素20萬u每次，每日2次；預(yù)防腸梗阻。實施例2樹鼩創(chuàng)傷性腦損傷術(shù)后行為學(xué)評價一、實驗方法1、平面速度和距離的測定1.1儀器與裝置實驗裝置由反應(yīng)箱(圖3)和數(shù)據(jù)自動采集、處理系統(tǒng)兩部分組成(SMART3.0.04，Panlab)，樹鼩反應(yīng)箱高40cm，底邊長100cm，內(nèi)壁涂黑，地面鋪純白色防水墻紙，正上方2m處架一數(shù)碼攝像頭，其視野可覆蓋整個反應(yīng)箱內(nèi)部。光照為全人工照明，可人為設(shè)定“白天”和“黑夜”，實驗室背景噪音控制在65dB以下。在反應(yīng)箱頂部蓋上1.5m*0.8m的鐵絲網(wǎng)；反應(yīng)箱的底邊包括四個頂角(A、B、C和D)。1.2檢測方法A)意識將樹鼩從A點放入(圖3)，正常警覺性,有強的攻擊性和逃離傾向0分有意識但情緒稍低落,尚有較強的攻擊性1分有意識且有較弱的攻擊性2分有意識但情緒低落且不反抗3分昏昏欲睡,聲音刺激能睜眼4分輕度昏迷,僅有反射運動5分深度昏迷,沒有運動6分B)最大速度將樹鼩從A點放入(圖3)，采集并處理樹鼩2min內(nèi)最大速度。最大速度≥2.5m/s0分；最大速度≥1.5m/s1分；最大速度≥0.5m/s2分；最大速度<0.5m/s3分。C)直線行走將樹鼩從A點放入(圖3)，選取三人觀察記錄樹鼩2min內(nèi)行走情況。正常行走0分；不能走直線1分；偏癱側(cè)打圈2分；向癱側(cè)跌倒無法走3分。G)翹尾正常樹鼩在反應(yīng)相中大都會出現(xiàn)翹尾現(xiàn)象，TBI后樹鼩翹尾現(xiàn)象基本消失。將樹鼩從A點放入(圖3)，記錄樹鼩2min內(nèi)是否有翹尾現(xiàn)象(圖4)。翹尾0分，不翹尾1分。2、跳躍高度檢測2.1儀器與裝置樹鼩反應(yīng)箱高150cm，底邊長100cm，擋板：高度20cm(六塊)、10cm(一塊)、5cm(一塊)、1cm(一塊)。2.2檢測方法將擋板架放入反應(yīng)箱30cm處，先在擋板架中放入20cm高擋板1塊，觀察并記錄樹鼩能否跳出，能跳出再放入20cm擋板一塊，觀察能否跳出，按照此依次放入共六塊。可根據(jù)實際情況決定是否放入10cm、5cm、1cm擋板。如需測攀爬根據(jù)實際情況將10cm擋板或其他高度擋板放入擋板架中，看樹鼩能否爬上去。如需檢測激惹反應(yīng)可采用敲打反應(yīng)箱壁的方法或者用刺激棒刺激樹鼩(如圖5)。跳高翻越60cm擋板0分，跳高未翻越60cm擋板1分，跳高未翻越40cm擋板2分，跳高未翻越20cm擋板3分。二、實驗結(jié)果2.1樹鼩創(chuàng)傷性腦外傷意識評分結(jié)果術(shù)后第一天Sham組樹鼩意識正常，TBI組樹鼩有意識但情緒低落且不反抗。術(shù)后第三天Sham組樹鼩意識正常，TBI組樹鼩有意識且有較弱的攻擊性。術(shù)后第五天Sham組樹鼩意識正常，TBI組樹鼩有意識但情緒稍低落,尚有較強的攻擊性。術(shù)后第七天Sham組樹鼩意識正常，TBI組樹鼩樹鼩意識正常(表1，圖6)。表1樹鼩創(chuàng)傷性腦外傷術(shù)后意識結(jié)果天數(shù)ShamTBI1d0.583.003d0.602.505d0.201.087d0.000.002.2樹鼩創(chuàng)傷性腦外傷最大速度評分結(jié)果Sham組第一天得分均值為0.3分，第三天得分均值為0.16分，第五天以后得分均值均為0分。TBI組第一天得分均值為1分，第三天得分均值為1分，第五天以后得分均值均為0.53分，第七天得分均值為0分(表2，圖7)。表2樹鼩創(chuàng)傷性腦損傷術(shù)后最大速度結(jié)果天數(shù)ShameTBI1d0.313d0.1615d00.537d002.3樹鼩創(chuàng)傷性腦外傷直線行走評分結(jié)果Sham組第一天得分均值為0.1分，第三天得分均值為0.38分，第五天以后得分均值均為0分。TBI組第一天得分均值為1.85分，第三天得分均值為1.33分，第五天以后得分均值均為0.56分，第七天得分均值為0.16分(表3，圖8)。表3樹鼩創(chuàng)傷性腦外傷直線行走評分結(jié)果天數(shù)ShamTBI1d0.101.853d0.381.335d0.000.567d0.000.162.4樹鼩創(chuàng)傷性腦外傷后翹尾評分結(jié)果Sham組第一天得分均值為0.38分，第三天得分均值為0.26分，第五天得分均值均為0.20分，第七天得分均值為0分。TBI組第一天得分均值為0.92分，第三天得分均值為0.65分，第五天以后得分均值均為0.41分，第七天得分均值為0分(表4，圖9)。表4樹鼩創(chuàng)傷性腦外傷術(shù)后翹尾評分結(jié)果天數(shù)ShamTBI1d0.380.923d0.260.655d0.200.417d0.000.002.5樹鼩創(chuàng)傷性腦外傷后跳高評分結(jié)果Sham組第一天平均得分0.5分，第三天平均得分0.25分，第五天平均得分0，TBI組第一天平均得分1.33分，第三天平均得分0.43分。第七天兩組得分均為0分(表5，圖10)。表5樹鼩創(chuàng)傷性腦損傷術(shù)后跳高評分實驗結(jié)果天數(shù)ShamTBI1d0.501.333d0.250.435d0.000.057d0.000.00上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應(yīng)當理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。當前第1頁1 2 3