本申請是申請?zhí)枮?01180029337.x、申請日為2011年4月21日、名稱為“抗體制劑”的專利申請的分案申請。本發(fā)明涉及一種包含igm的抗體(免疫球蛋白)制劑，所述制劑具有特異性補(bǔ)體活化活性但具有低的非特異性補(bǔ)體活化能力。本發(fā)明還涉及所述抗體制劑在醫(yī)藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：從人類血漿制備的且適合于靜脈內(nèi)施用的免疫球蛋白組合物在本領(lǐng)域中是已知的，且數(shù)十年來在多種疾病的治療中起著重要作用。免疫球蛋白用于例如治療人體感染，并且可以分為具有不同生化和生理性質(zhì)的多種類別。免疫球蛋白g參與抵御病毒抗原，而igm則主要在抗細(xì)菌和抗毒素的免疫應(yīng)答中具有活性。免疫球蛋白溶液包含占各種百分比的igg、iga和igm，且不同的制劑具有不同的治療應(yīng)用，例如，igm百分比較高的制劑用于預(yù)防或治療細(xì)菌感染。免疫球蛋白溶液通常從血漿或血清的組分(例如cohn組分)中制得。隨后對(duì)這些組分進(jìn)行多個(gè)純化步驟來除去包括病毒、變性蛋白、蛋白酶和脂質(zhì)在內(nèi)的污染物。用于組分分離的人類血清采集自數(shù)千供體，盡管對(duì)來源血漿進(jìn)行了全面檢測，但仍可能含有病原體病毒。因此，為了獲得安全的用于醫(yī)藥應(yīng)用產(chǎn)品，用于使病毒滅活或除去病毒的處理步驟必不可少。用于病毒滅活/去除的若干種技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，例如化學(xué)處理、uvc光照射或納米過濾，實(shí)施這些技術(shù)是為了確?？傮w病毒安全性。通過使用生產(chǎn)過程的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模模型驗(yàn)證了這些處理步驟的病毒去除或滅活能力，并且對(duì)每個(gè)步驟都確定了去除或滅活系數(shù)。滅活/去除系數(shù)的提高為藥物產(chǎn)品增添了額外的病毒安全性?，F(xiàn)今，來自主管機(jī)構(gòu)的準(zhǔn)則要求在制造源自血漿的藥物時(shí)至少有兩個(gè)針對(duì)有包膜和無包膜的病毒的有效步驟。雖然若干種方法(例如溶劑/去垢劑處理、辛酸處理、納米過濾和熱處理)可有效地滅活或除去有包膜病毒，但是僅有幾種已知方法可滅活或除去無包膜病毒，例如細(xì)小病毒。這些無包膜病毒大部分都非常小，通常會(huì)穿過孔徑大于20nm的納米過濾器。而該孔徑對(duì)于直徑可高達(dá)30nm的igm分子而言過小。無包膜病毒可被例如β-丙內(nèi)酯等化學(xué)物質(zhì)有效地滅活，但是，這也會(huì)產(chǎn)生功能受到破壞的經(jīng)修飾的免疫球蛋白。另一種有效的處理是uvc照射(ep1842561,caf-dcf)。然而，已知的溶劑/去垢劑處理、辛酸處理和溫和熱處理對(duì)無包膜病毒基本沒有效果。如上所述，除了潛在的病毒以外，還有必要除去例如脂質(zhì)、蛋白酶、蛋白聚集體和變性的免疫球蛋白等其他污染物。為了(1)確保產(chǎn)品符合有關(guān)病毒污染的生物安全性準(zhǔn)則、(2)在靜脈內(nèi)施用后使患者對(duì)產(chǎn)物耐受、(3)使產(chǎn)品在長期儲(chǔ)存過程中穩(wěn)定(任何殘留的蛋白水解活性都可能導(dǎo)致產(chǎn)品在長期儲(chǔ)存(例如2年)過程中降解)和(4)產(chǎn)生所需的化合物混合物/藥物組合物，除去所有上述污染物是必須的。然而，與此同時(shí)，至關(guān)重要的是用來除去污染物的純化步驟不會(huì)干擾免疫球蛋白分子，從而盡可能地使這些免疫球蛋白分子保留其正常生物活性并以高產(chǎn)率保留在溶液中。該平衡難以實(shí)現(xiàn)，因?yàn)樵S多已知的純化步驟還對(duì)免疫球蛋白特別是igm的活性會(huì)有負(fù)面影響；例如，過長時(shí)間的uvc照射可以使在最終免疫球蛋白溶液中所得到的天然的具有活性的igm的產(chǎn)率降低。這不僅導(dǎo)致最終免疫球蛋白溶液的功效降低，而且還使該溶液在體內(nèi)的耐受性變差。對(duì)患者而言，聚集體和變性的免疫球蛋白(其量可能通過某些純化步驟增加)尤其是潛在的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)樗鼈兊姆翘禺愋缘丶せ钛a(bǔ)體的能力很高，從而在接受這些變性免疫球蛋白的患者中產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。非特異性補(bǔ)體活化是指在特異性抗體-抗原復(fù)合物不存在的情況下補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)。應(yīng)嚴(yán)格避免非特異性補(bǔ)體活化，因?yàn)槠淇梢砸鸩缓闲枰母弊饔?，例如高血壓、潮紅、頭痛、發(fā)熱、發(fā)冷、惡心、嘔吐、肌肉痛、呼吸困難和心動(dòng)過速。另一方面，特異性補(bǔ)體活化合乎需要，其僅在免疫球蛋白已結(jié)合其特異性抗原后發(fā)生。非特異性補(bǔ)體活化以所謂的抗補(bǔ)體活性(aca)計(jì)，aca通過《歐洲藥典(europeanpharmacopoeia)》中描述的標(biāo)準(zhǔn)化測試來測量。補(bǔ)體系統(tǒng)在對(duì)病原體的免疫防御中的作用是公知的。補(bǔ)體系統(tǒng)由約20種蛋白組成，這些蛋白依次發(fā)生活化。經(jīng)典補(bǔ)體途徑通常需要特異性抗原抗體復(fù)合物來激活，而旁路途徑可以在無抗體存在的情況下由抗原來激活。補(bǔ)體活化的經(jīng)典途徑和旁路途徑都產(chǎn)生蛋白酶—c3轉(zhuǎn)化酶。c3轉(zhuǎn)化酶切斷并激活補(bǔ)體成分c3，產(chǎn)生c3a和c3b，并且在c5轉(zhuǎn)化酶上引起進(jìn)一步的斷裂和活化事件的級(jí)聯(lián)反應(yīng)以形成c5a和c5b。c5b引發(fā)膜攻擊途徑，該途徑產(chǎn)生由c5b、c6、c7、c8和多聚的c9組成的膜攻擊復(fù)合物。這是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的細(xì)胞溶解性末端產(chǎn)物，其形成跨膜通道，該通道引起靶細(xì)胞(如細(xì)菌)的滲透性溶解。補(bǔ)體活化還導(dǎo)致過敏毒素的形成，包括生物活性蛋白c5a。該過敏毒素是免疫和炎性細(xì)胞的有力趨化劑，并且誘導(dǎo)細(xì)胞活化并使組胺從肥大細(xì)胞中釋放出。在過量或不受控制的和/或非特異性的補(bǔ)體活化的情況下，c5a的過度產(chǎn)生能夠引起對(duì)患者有害的效果。c5a是有效的白細(xì)胞化學(xué)吸引劑，在補(bǔ)體活化的部位引起白血球、尤其是中性粒細(xì)胞的積累。c5a激活白血球，而且是強(qiáng)效的炎癥介質(zhì)。盡管這些功能在特異性抗體-抗原復(fù)合物的反應(yīng)過程中有益，但由于潛在的副作用，必須避免c5a的所有非特異性產(chǎn)生。因?yàn)榕cigg制劑相比igm抗體容易在溶液中聚集，所以對(duì)于igm免疫球蛋白制劑(即，包含至少5％igm的制劑)而言，非特異性補(bǔ)體活化特別成問題。igm制劑難以穩(wěn)定化，尤其是在其相對(duì)于血漿濃度有所富集和儲(chǔ)存在液體溶液中時(shí)。還已知igm是補(bǔ)體的強(qiáng)力活化劑；與抗原結(jié)合的單個(gè)分子即可激活補(bǔ)體。這與igg不同，兩個(gè)以上的igg分子必須在彼此近距離聯(lián)結(jié)的情況下結(jié)合抗原才能激活補(bǔ)體。此外，含igm的免疫球蛋白制劑所治療的主要適應(yīng)證是細(xì)菌感染和敗血病。由于這些患者已經(jīng)患有高血壓，所以非特異性補(bǔ)體活化和c5a的額外的不需要的產(chǎn)生將使患者狀況的臨床惡化。因此，據(jù)已有描述，難以將igm制劑制備成用于靜脈內(nèi)應(yīng)用。本領(lǐng)域中描述了用于從人血漿中制造含igm的免疫球蛋白制劑的若干種方法。已使用經(jīng)典的cohn血漿組分分離法或其公知的變形方法(例如cohn/oncley,kistler/nitschmann)對(duì)人igm溶液進(jìn)行了初步純化。使用冷乙醇沉淀法，將igm組分回收在組分iii或組分i/iii(亦稱為b或b+i)中。已描述了用來從組分iii或i/iii開始對(duì)富集有igm的蛋白溶液進(jìn)行純化的方法。ep0013901描述了從組分iii開始的純化方法，包括使用辛酸的步驟、使用β-丙內(nèi)酯的步驟和使用陰離子交換樹脂的吸收步驟。該方法用于生產(chǎn)——迄今為止唯一的市售靜脈內(nèi)igm產(chǎn)品。β-丙內(nèi)酯是為了使?jié)撛诘牟《緶缁疃糜跍缇襟E的公知化學(xué)物質(zhì)。由于β-丙內(nèi)酯是可引起蛋白化學(xué)修飾的反應(yīng)性很強(qiáng)的物質(zhì)，所以免疫球蛋白的抗病毒活性和抗細(xì)菌活性也會(huì)有大量損失。另一方面，與未經(jīng)化學(xué)修飾的免疫球蛋白相比，該化學(xué)修飾產(chǎn)生了降低的抗補(bǔ)體活性。ep0352500描述了通過以下方法制備具有降低的抗補(bǔ)體活性的用于靜脈內(nèi)應(yīng)用的igm濃縮物：使用陰離子交換層析、β-丙內(nèi)酯、uvc光照射和在升高的溫度(40℃～60℃)下進(jìn)行溫育的步驟。用該方法制造的制劑因所述化學(xué)修飾而在液體溶液中僅在有限的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。igm的濃度超過總免疫球蛋白含量的50％。在ep0413187(biotest，生物測試股份公司)和ep0413188(biotest，生物測試股份公司)中，已描述了未經(jīng)β-丙內(nèi)酯化學(xué)修飾的igm富集的蛋白溶液的制備。這些方法包括從cohn組分iii或ii/iii開始對(duì)適合的蛋白溶液進(jìn)行辛酸處理和陰離子交換層析。在專利ep0413187(biotest，生物測試股份公司)中，辛酸處理通過攪拌15分鐘來進(jìn)行，以除去存在于cohn組分iii中的脂質(zhì)。ep0413187所述的制劑具有低抗補(bǔ)體活性，即0.6～0.8ch50/mg蛋白，但是必須對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定化和用β-丙內(nèi)酯進(jìn)行病毒滅活。根據(jù)針對(duì)免疫球蛋白的ep專論，認(rèn)為低抗補(bǔ)體活性為≤1ch50/mg蛋白。ep0413188b1(biotest，生物測試股份公司)描述了為了降低抗補(bǔ)體活性而使用陰離子交換層析來制備用于靜脈內(nèi)施用的富集有igm的制劑。此外，還描述了在ph4～4.5且在40℃～60℃、優(yōu)選50℃～54℃進(jìn)行熱處理以降低抗補(bǔ)體活性。必須將該制劑凍干以確保該制劑持續(xù)數(shù)月的穩(wěn)定性。未能顯示出液體溶液的長期穩(wěn)定性。m.wickerhauser等的“l(fā)argescalepreparationofmacroglobulin(巨球蛋白的大規(guī)模制備)”(voxsang23,119-125(1972))顯示出，通過peg沉淀分離出的igm制劑在標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中具有高抗補(bǔ)體活性(aca)，并且通過將該igm制劑在ph4.0下于37℃溫育8小時(shí)并隨后將ph重新調(diào)節(jié)至中性，使該aca活性下降10倍。未說明該10倍下降是否足以保證靜脈內(nèi)耐受性。其作者并未評(píng)估他們的igm濃縮物的特異性補(bǔ)體活化潛力，也未在任何動(dòng)物或人模型中評(píng)估安全性。另一種方法描述了在ph4.0～5.0和在40℃～62℃、優(yōu)選45℃～55℃提高利用對(duì)igm制劑的溫和熱處理(ep0450412，miles)來減少非特異性補(bǔ)體活化。在該專利申請中，將辛酸添加到cohn組分iii懸浮液中，從而通過離心除去前激肽釋放酶活化劑和脂蛋白。但是，該溫和熱處理會(huì)導(dǎo)致igm的抗原決定簇部分丟失。這可能會(huì)使產(chǎn)生新生抗原的風(fēng)險(xiǎn)升高，從而導(dǎo)致人體內(nèi)免疫原性增加或活性喪失。ep0835880(us6136312,zlb)中已描述了在辛酸沉淀步驟后使用蛋白酶處理(例如，用胃蛋白酶)來制備用于靜脈內(nèi)應(yīng)用的含igm的蛋白溶液。蛋白酶處理使免疫球蛋白分子發(fā)生部分片段化，從而破壞了fab和fc部分的完整功能活性。因此，經(jīng)蛋白酶處理的免疫球蛋白不能認(rèn)為是未經(jīng)修飾的免疫球蛋白。此外，該制備方法會(huì)產(chǎn)生約5％的分子量小于100kd的片段。用來進(jìn)行辛酸處理的已描述的方法(ep0413187和ep0835880)的缺點(diǎn)在于，辛酸處理在除去和滅活無包膜病毒方面并不有效，且不會(huì)除去幾乎全部的蛋白水解活性。在ep0345543(bayer,miles)中，公開了用于治療用途的含有至少33％igm的高度濃縮的igm制劑，該制劑基本不含同種凝集素效價(jià)(isoagglutinintitre)。在該專利申請中，通過添加辛酸來進(jìn)行辛酸沉淀，并通過synsorb親和層析來除去同種凝集素。最終制劑必須冷凍干燥?？傊?，如果利用化學(xué)手段或酶手段對(duì)免疫球蛋白進(jìn)行修飾，和/或提高層析進(jìn)一步純化，和/或進(jìn)行溫和熱處理，則可以制備出具有低抗補(bǔ)體活性的含igm的制劑。然而，這些方法具有以下缺點(diǎn)：缺少病毒去除/病毒活化(因此缺乏病毒安全性)，減少了天然形態(tài)的免疫球蛋白分子的量，和/或殘余的抗補(bǔ)體活性。因此，仍有需要提供改善的適合于人靜脈內(nèi)施用的含igm的免疫球蛋白制劑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在第一方面，本發(fā)明提供一種適合于人靜脈內(nèi)施用的抗體制劑，所述抗體制劑包含igg抗體、iga抗體和占抗體總量至少5重量％的igm抗體，其中，所述制劑從人血漿制得，其中，所述抗體制劑具有特異性補(bǔ)體活化活性，并且其中，在適合于確定所述抗體制劑的非特異性地激活補(bǔ)體的能力的用人血清進(jìn)行的體外測定中，所述抗體制劑基本不產(chǎn)生c5a且/或基本不產(chǎn)生c3a。本申請人出人意料地發(fā)現(xiàn)，從人血清制造igm抗體制劑是可行的，所述抗體制劑具有特異性補(bǔ)體活化能力且基本不具有非特異性補(bǔ)體活性。該產(chǎn)品是優(yōu)越的，因?yàn)槠湓陟o脈內(nèi)施用后在減少了與非特異性補(bǔ)體活化相關(guān)的不良副作用(例如高血壓)的同時(shí)保持了產(chǎn)品的功效。本發(fā)明的另一方面提供一種從人血漿制造本發(fā)明的抗體制劑的方法，所述方法包括以下步驟：(a)從人血漿制備血漿組分，作為含免疫球蛋白的溶液；(b)將c7～c9的羧酸與所述溶液混合，并用振動(dòng)攪拌器處理經(jīng)混合的溶液以沉淀出污染性蛋白；(c)將沉淀出的蛋白從所述溶液中分離出，以產(chǎn)生含有igm的免疫球蛋白組合物；(d)將所述含有igm的免疫球蛋白組合物在ph3.5～4.5下溫育，以形成經(jīng)溫育的溶液；(e)用uvc照射所述經(jīng)溫育的溶液，從而形成經(jīng)uvc照射的溶液；和(f)在無菌條件下過濾所述經(jīng)uvc照射的溶液，從而形成適合于人靜脈內(nèi)施用的抗體制劑。申請人出人意料地發(fā)現(xiàn)，在將免疫球蛋白溶液與羧酸混合的步驟中使用振動(dòng)攪拌器極其有利。該方法步驟使得可以以更有效地除去不需要的蛋白(包括蛋白酶)，并且產(chǎn)生了對(duì)用來制造免疫球蛋白藥物的下游加工步驟更適合的中間產(chǎn)物；該中間產(chǎn)物使得這些下游加工步驟效率更高。因此，下游加工步驟可以較不嚴(yán)厲，從而有助于得到能夠特異性地激活補(bǔ)體且基本不能非特異性地激活補(bǔ)體的本發(fā)明的抗體制劑。特別而言，從步驟(c)獲得的含有igm免疫球蛋白的組合物可以與其他處理步驟組合，例如用溫和酸條件進(jìn)行的處理和用uvc照射進(jìn)行的處理，從而產(chǎn)生適合于靜脈內(nèi)施用的含有igm的免疫球蛋白產(chǎn)品或抗體制劑，且所述免疫球蛋白產(chǎn)物或抗體制劑具有以下有利性質(zhì)：具有低的抗補(bǔ)體活性；保留了高水平的天然的具有活性的igm；病毒安全，且因此適合于人靜脈內(nèi)施用。此前，未能取得用本文所述的方法所取得的病毒安全水平。其他優(yōu)勢是：具有低的蛋白水解活性(因此在長期儲(chǔ)存過程中穩(wěn)定)，和未經(jīng)化學(xué)修飾。另外，本發(fā)明還提供用于醫(yī)藥應(yīng)用的本發(fā)明的抗體制劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體制劑用于治療免疫紊亂性疾病和細(xì)菌感染。本發(fā)明的另一方面提供一種治療方法，所述方法包括向患者施用本發(fā)明的抗體制劑。本發(fā)明還包含以下項(xiàng)目。1.一種適合于人靜脈內(nèi)施用的抗體制劑，所述抗體制劑包含igg抗體、iga抗體和占抗體總量至少5重量％的igm抗體，其中，所述制劑從人血漿制得，其中，所述抗體制劑具有特異性補(bǔ)體活化活性，并且其中，在適合于確定所述抗體制劑的非特異性地激活補(bǔ)體的能力的用人血清進(jìn)行的體外測定中，所述抗體制劑基本不產(chǎn)生c5a且/或基本不產(chǎn)生c3a。2.如項(xiàng)目1所述的抗體制劑，所述抗體制劑還包含占抗體總量的大于5重量％的iga和大于40重量％的igg。3.如項(xiàng)目1或2所述的抗體制劑，所述抗體制劑包含占抗體總量的至少10重量％的igm。4.如項(xiàng)目3所述的抗體制劑，所述抗體制劑包含占抗體總量的至少15重量％的igm。5.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，其中，經(jīng)調(diào)整igm濃度為1.72mg/ml的所述抗體制劑在60分鐘的所述測定后產(chǎn)生少于200ng/ml的c5a。6.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，其中，經(jīng)調(diào)整igm濃度為1.72mg/ml的所述抗體制劑在60分鐘的所述測定后產(chǎn)生少于6000ng/ml的c3a。7.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，其中，在所述體外血清測定中，與人血清一起的所述抗體制劑產(chǎn)生的c5a和/或c3a的量等于僅用人血清時(shí)的c5a和/或c3a的量±70％。8.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，其中，用于確定所述抗體制劑基本不產(chǎn)生c5a的所述體外血清測定包括以下步驟：(a)將一定量的所述抗體制劑添加到100μl人血清中以產(chǎn)生含有1.72mg/mligm的反應(yīng)混合物，并在持續(xù)攪拌下將所述反應(yīng)混合物于37℃溫育60分鐘；(b)制備所述反應(yīng)混合物的適合用于elisa的稀釋液組；(c)用針對(duì)c5a的一抗和二抗以及顯色物質(zhì)對(duì)所述反應(yīng)混合物的所述稀釋液組進(jìn)行夾心式elisa，其中，所述二抗與酶偶聯(lián)，且所述顯色物質(zhì)是所述酶的底物；和(d)根據(jù)因使所述顯色物質(zhì)與通過所述二抗結(jié)合c5a的所述酶接觸而獲得的顏色變化，確定所述反應(yīng)混合物中的c5a的量。9.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，其中，用于確定所述抗體制劑基本不產(chǎn)生c3a的所述體外血清測定包括以下步驟：(a)將一定量的所述抗體制劑添加到100μl人血清中以產(chǎn)生含有1.72mg/mligm的反應(yīng)混合物，并在持續(xù)攪拌下將所述反應(yīng)混合物于37℃溫育60分鐘；(b)制備所述反應(yīng)混合物的適合用于elisa的稀釋液組；(c)用針對(duì)c3a的一抗和二抗以及顯色物質(zhì)對(duì)所述反應(yīng)混合物的所述稀釋液組進(jìn)行夾心式elisa，其中，所述二抗與酶偶聯(lián)，且所述顯色物質(zhì)是所述酶的底物；和(d)根據(jù)因使所述顯色物質(zhì)與通過所述二抗結(jié)合c3a的所述酶接觸而獲得的顏色變化，確定所述反應(yīng)混合物中的c3a的量。10.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，所述抗體制劑包含少于2％的1200kda以上的聚集體。11.如項(xiàng)目10所述的抗體制劑，所述抗體制劑包含少于1.5％的1200kda以上的聚集體。12.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，其中，所述制劑的抗補(bǔ)體活性低于1.0ch50/mg蛋白。13.如項(xiàng)目12所述的抗體制劑，其中，所述抗補(bǔ)體活性低于0.75ch50/mg蛋白。14.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，所述抗體制劑的免疫球蛋白含量大于總蛋白含量的95％。15.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，所述抗體制劑在未執(zhí)行于40℃以上的溫度進(jìn)行超過10分鐘的熱處理的步驟的情況下從人血清制得。16.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，所述抗體制劑在未執(zhí)行涉及對(duì)所述抗體進(jìn)行化學(xué)修飾或酶修飾的步驟的情況下從人血清制得。17.如項(xiàng)目16所述的抗體制劑，其中，進(jìn)行化學(xué)修飾的所述步驟是使所述抗體與β-丙內(nèi)酯接觸的步驟。18.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，所述抗體制劑通過能夠?qū)崿F(xiàn)無包膜病毒的大于3log10的去除的方法制得。19.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，所述抗體制劑通過包括以下步驟的方法從人血清制得：(a)從人血漿制備血漿組分，作為含免疫球蛋白的溶液；(b)將c7～c9的羧酸與所述溶液混合，并用振動(dòng)攪拌器處理經(jīng)混合的溶液以沉淀出污染性蛋白；(c)將沉淀出的蛋白從所述溶液中分離出，以產(chǎn)生含有igm的免疫球蛋白組合物；(d)將所述含有igm的免疫球蛋白組合物在ph3.5～4.5溫育，以形成經(jīng)溫育的溶液；(e)用uvc照射經(jīng)溫育的溶液，從而形成經(jīng)uvc照射的溶液；和(f)在無菌條件下過濾所述經(jīng)uvc照射的溶液，從而形成適合于人靜脈內(nèi)施用的抗體制劑。20.如項(xiàng)目19所述的抗體制劑，其中，所述方法還包括在步驟(e)的照射之前對(duì)從步驟(d)獲得的經(jīng)溫育的溶液進(jìn)行納米過濾。21.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，其中，所述抗體制劑能夠以115mgigm/kg體重/小時(shí)施用至食蟹猴，并且不存在與治療前水平相比超過10％的動(dòng)脈壓下降。22.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，其中，在所述制劑中至少90％的抗體具有生物活性。23.如前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，其中，在適合于確定fc功能的基于風(fēng)疹抗原的體外測定中，所述抗體制劑的抗體的fc部分的活性等于生物參照制劑的相應(yīng)活性±10％。24.一種從人血清制造前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的抗體制劑的方法，所述方法包括以下步驟：(a)從人血漿制備血漿組分，作為含免疫球蛋白的溶液；(b)將c7～c9的羧酸與所述溶液混合，并用振動(dòng)攪拌器處理經(jīng)混合的溶液以沉淀出污染性蛋白；(c)將沉淀出的蛋白從所述溶液中分離出，以產(chǎn)生含有igm的免疫球蛋白組合物；(d)將所述含有igm的免疫球蛋白組合物在ph3.5～4.5下溫育，以形成經(jīng)溫育的溶液；(e)用uvc照射所述經(jīng)溫育的溶液，從而形成經(jīng)uvc照射的溶液；和(f)在無菌條件下過濾所述經(jīng)uvc照射的溶液，從而形成適合于人靜脈內(nèi)施用的抗體制劑。25.如項(xiàng)目1～23中任一項(xiàng)所述的抗體制劑，所述抗體制劑用于醫(yī)藥應(yīng)用。26.如項(xiàng)目25所述的抗體制劑，所述抗體制劑用于治療免疫紊亂性疾病或細(xì)菌感染。27.如項(xiàng)目26所述的抗體制劑，其中，所述免疫紊亂性疾病是igm缺陷疾病。28.項(xiàng)目1～23中任一項(xiàng)所述的抗體制劑在制造用于治療免疫紊亂性疾病或細(xì)菌感染的藥物中的應(yīng)用。29.一種患者的治療方法，所述治療方法包括施用項(xiàng)目1～23中任一項(xiàng)所述的抗體制劑。30.如項(xiàng)目29所述的治療方法，其中，所述患者患有免疫紊亂性疾病或細(xì)菌感染。31.如項(xiàng)目29或30所述的治療方法，其中，將所述抗體制劑靜脈內(nèi)施用給所述患者。現(xiàn)將結(jié)合附圖僅以實(shí)例方式來更詳細(xì)地描述本發(fā)明。圖1提供了能夠用來形成本發(fā)明的適合于靜脈內(nèi)施用的抗體制劑的各步驟的總覽。突出顯示了采用振動(dòng)混合器設(shè)備的辛酸處理步驟、ph4處理和uvc處理。起始材料從人血漿的標(biāo)準(zhǔn)冷乙醇沉淀過程獲得。圖2提供了顯示出在與igm制劑溫育后的人血清中發(fā)現(xiàn)的時(shí)間相關(guān)的平均c5a濃度的圖。圖3提供了顯示出在與igm制劑溫育后的人血清中發(fā)現(xiàn)的時(shí)間相關(guān)的平均c3a濃度的圖。具體實(shí)施方式抗體制劑如上所述，本發(fā)明提供一種適合于人靜脈內(nèi)施用的抗體制劑，所述抗體制劑包含igg抗體、iga抗體和占抗體總量至少5重量％的igm抗體，其中，所述制劑從人血漿中制得，其中，所述抗體制劑具有特異性補(bǔ)體活化活性，且其中，在適合于確定所述抗體制劑的非特異性地激活補(bǔ)體的能力的用人血清進(jìn)行的體外測定中，所述抗體制劑基本不產(chǎn)生c5a且/或基本不產(chǎn)生c3a。本發(fā)明的抗體制劑包含人血漿蛋白，所述人血漿蛋白中至少90％、優(yōu)選至少95％是由免疫球蛋白(多克隆抗體)構(gòu)成。特別而言，所述制劑包含免疫球蛋白igg、iga和igm，其中，免疫球蛋白的至少5％是igm。igg、iga和igm免疫球蛋白的量可以用濁度測定法或用《歐洲藥典》2.7.1所述的免疫沉淀來確定。所述抗體制劑更優(yōu)選包含至少10％的igm且最優(yōu)選包含至少15％的igm。關(guān)于igg和iga，所述抗體制劑優(yōu)選包含大于5％的iga和/或大于40％的igg。所有百分比是占抗體總量的百分比(例如，igm的克數(shù)/(igg的克數(shù)+iga的克數(shù)+igm的克數(shù))×100)。通過評(píng)估免疫球蛋白分子的fc部分的功能活性來確定抗體制劑具有特異性補(bǔ)體活化活性(即，在抗原存在時(shí)激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的能力)的方法在本領(lǐng)域中是已知的。特別而言，按照歐洲準(zhǔn)則ichs6(cpmp/ich/302/95)，目前的《歐洲藥典》方法描述了適合的方法，其采用風(fēng)疹抗原。關(guān)于特異性補(bǔ)體活化的其他細(xì)節(jié)在下文參照生物活性給出。在適合用來確定人正常血清(例如，來自健康的人的血清)中的非特異性補(bǔ)體活化的體外測定中，所述抗體制劑基本不引起非特異性補(bǔ)體活化(即，在抗原不存在時(shí)由免疫球蛋白引起的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的活化)。特別而言，該測定能夠確定在抗原不存在時(shí)該測定中所產(chǎn)生的c5a和/或c3a的量。如上所述，補(bǔ)體的活化導(dǎo)致了c5a和c3a的產(chǎn)生。由于這兩種蛋白都參與補(bǔ)體系統(tǒng)的末端途徑(而不是參與經(jīng)典/凝集素途徑或旁路途徑)，它們對(duì)確定補(bǔ)體活化而言特別有效。當(dāng)在抗原不存在的情況下在對(duì)人血清的適合的體外測定中使用時(shí)，所述抗體制劑基本不產(chǎn)生c5a和/或基本不產(chǎn)生c3a。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，經(jīng)調(diào)整igm濃度為1.72mg/ml的所述抗體制劑在60分鐘的測定后產(chǎn)生少于200ng/ml的c5a，并且/或者經(jīng)調(diào)整igm濃度為1.72mg/ml的所述抗體制劑在60分鐘的測定后產(chǎn)生少于6000ng/ml的c3a。作為另一選擇或作為補(bǔ)充，在所述測定中，所述抗體制劑產(chǎn)生的c5a和/或c3a的量等于僅用人血清的相同測定中所產(chǎn)生的c5a和/或c3a的量±70％。這優(yōu)選是在60分鐘的測定后發(fā)生。適合的測定在本領(lǐng)域中是已知的。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該測定包括以下步驟：(a)將一定量的抗體制劑添加到100μl人血清中以產(chǎn)生含有1.72mg/mligm的反應(yīng)混合物，并在持續(xù)攪拌下將該反應(yīng)混合物于37℃溫育60分鐘；(b)制備所述反應(yīng)混合物的適合用于elisa的稀釋液組；(c)用針對(duì)c5a或c3a的一抗和二抗以及顯色物質(zhì)對(duì)所述反應(yīng)混合物的稀釋液組進(jìn)行夾心式elisa，其中，所述二抗與酶偶聯(lián)，且所述顯色物質(zhì)是所述酶的底物；和(d)根據(jù)因使所述顯色物質(zhì)與通過所述二抗結(jié)合c5a或c3a的所述酶接觸而獲得的顏色變化，確定所述反應(yīng)混合物中的c5a或c3a的量。在該elisa中，使稀釋液組與包被有所述一抗的檢測板中的孔接觸。在溫育后，清洗這些孔以除去稀釋液樣品，隨后在這些孔中溫育二抗并使之結(jié)合與一抗結(jié)合的任何c3a/c5a，這是因?yàn)樗龆咕哂械膶?duì)c3a/c5a的表位與一抗的不同。在進(jìn)一步清洗除去未結(jié)合的二抗后，溫育色原并使之與偶聯(lián)至二抗的酶反應(yīng)。所得到的顏色變化可以用光度計(jì)通過光密度確定來測量，該顏色變化與稀釋液組中存在的c5a/c3a的濃度成正比。特別而言，在步驟(a)中添加的抗體制劑的量適合于在反應(yīng)混合物中產(chǎn)生1.72mg/ml的igm濃度。步驟(c)和步驟(d)可以包括：(i)將反應(yīng)混合物的稀釋液組添加到包被有針對(duì)c3a/c5a的一抗(即“捕獲抗體”)的檢測板的孔中；(ii)溫育該板以使任何c3a/c5a與一抗結(jié)合；(iii)清洗該板以除去稀釋液中未與一抗結(jié)合的任何物質(zhì)；(iv)添加亦與c3a/c5a結(jié)合的酶聯(lián)二抗(檢測抗體)；(v)溫育該板以使任何二抗與c3a/c5a結(jié)合；(vi)清洗該板以除去未結(jié)合的二抗；(vii)添加可被所述酶轉(zhuǎn)化為顏色信號(hào)的化學(xué)物質(zhì)；和(viii)測量該板的孔的吸收來確定c3a/c5a的存在和量。夾心式elisa根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法和/或根據(jù)制造商的使用說明用市售的試劑盒來進(jìn)行。適合且特別優(yōu)選的市售酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)試劑盒為quidelmicrovuec5apluseia試劑盒；a025和quidelmicrovuec3apluseia試劑盒；a032。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，抗體制劑包含少于2％、優(yōu)選少于1.5％的1200kda以上的聚集體。這是指占免疫球蛋白含量的百分比。聚集體的量可以通過高效尺寸排阻色譜法(hpsec)來確定。這可以用本領(lǐng)域中已知的方法來執(zhí)行。作為另一選擇或補(bǔ)充，可以將抗體制劑的基本不產(chǎn)生非特異性補(bǔ)體活化的能力定義為該制劑的抗補(bǔ)體活性低于1.0ch50/mg蛋白、優(yōu)選低于0.75ch50/mg蛋白。根據(jù)《歐洲藥典》中所描述的方法(方法2.6.17，歐洲藥典，第6版，2008)來進(jìn)行確定此范圍的抗補(bǔ)體活性的測定。該測定的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)在下文的測定部分給出。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在未執(zhí)行對(duì)抗體進(jìn)行化學(xué)修飾或酶修飾的步驟的情況下，從人血清制備了抗體制劑，即，從人血清制造抗體制劑的方法不包括使抗體與會(huì)對(duì)該抗體進(jìn)行酶修飾或化學(xué)修飾的試劑接觸的步驟。特別而言，該方法不包括使抗體接觸β-丙內(nèi)酯(其引起抗體的化學(xué)修飾)或不包括使抗體接觸胃蛋白酶(其會(huì)使抗體發(fā)生酶促性斷裂)。作為另一選擇或補(bǔ)充，在未執(zhí)行將抗體加熱至40℃以上的溫度持續(xù)10分鐘以上的步驟的情況下，從人血清制備了抗體制劑。特別而言，已知加熱步驟能夠使免疫球蛋白變性且引起免疫球蛋白聚集。進(jìn)一步優(yōu)選的是，所述抗體制劑通過以下方法制備：所述方法能夠?qū)崿F(xiàn)無包膜病毒的大于3log10、優(yōu)選大于4log10、最優(yōu)選大于5log10的去除，由此使所述抗體制劑病毒安全。因此，所述抗體制劑比現(xiàn)有技術(shù)的抗體制劑更安全，特別是就有活性的無包膜病毒(例如細(xì)小病毒)而言尤其如此。由此得到了基本不含病毒、特別是基本不含無包膜病毒的抗體制劑。另外，本發(fā)明的方法能夠在不顯著影響抗體制劑的抗補(bǔ)體活性或活性igm的量的情況下實(shí)現(xiàn)所述水平的病毒顆粒去除/滅活。特別而言，所述抗體制劑能夠通過包括以下步驟的方法從人血漿制得：(a)從人血漿制備血漿組分，作為含免疫球蛋白的溶液；(b)將c7～c9的羧酸與所述溶液混合，并用振動(dòng)攪拌器處理經(jīng)混合的溶液以沉淀出污染性蛋白；(c)將沉淀出的蛋白從所述溶液中分離出，以產(chǎn)生含有igm的免疫球蛋白組合物；(d)將所述含有igm的免疫球蛋白組合物在ph3.5～4.5下溫育，以形成經(jīng)溫育的溶液；(e)用uvc照射所述經(jīng)溫育的溶液，從而形成經(jīng)uvc照射的溶液；和(f)在無菌條件下過濾所述經(jīng)uvc照射的溶液，從而形成適合于人靜脈內(nèi)施用的抗體制劑。上述方法優(yōu)選還包括在步驟(e)的照射之前對(duì)從步驟(d)獲得的經(jīng)溫育的溶液進(jìn)行納米過濾。該制造方法的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)和優(yōu)選方面在以下部分描述。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，能夠以115mgigm/kg體重/小時(shí)將抗體制劑施用至食蟹猴，且不存在與治療前水平相比10％以上的動(dòng)脈壓下降。如上所述，非特異性補(bǔ)體活化引起高血壓，因此動(dòng)脈壓缺乏顯著變化表明在健康的猴體內(nèi)基本沒有出現(xiàn)補(bǔ)體的非特異性活化。動(dòng)脈壓可以通過將壓力導(dǎo)管經(jīng)由右股動(dòng)脈插入下腹主動(dòng)脈中來測量。在優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體制劑還包含針對(duì)肺炎球菌糖(pneumococcussaccharide)、大腸桿菌、糞腸球菌、白色念珠菌和衣原體屬中的一種或多種的抗體。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體制劑中至少90％的抗體具有生物活性。術(shù)語“具有生物活性”是指制劑中的抗體處在天然形態(tài)，且特別而言能夠因特異性地結(jié)合抗原而激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)。抗體制劑的生物活性能夠基于本領(lǐng)域已知的用來確定抗體效價(jià)/結(jié)合活性和fc完整性/功能的測定來估算。特別而言，在適合于確定fc功能的基于風(fēng)疹抗原的體外測定中，抗體制劑的抗體的fc部分的活性等于生物參照制劑(biologicalreferencepreparation)的相應(yīng)活性±10％、更優(yōu)選±5％。生物參照制劑被國際醫(yī)藥和保健團(tuán)體采用，其有助于保證醫(yī)藥產(chǎn)品的一致性。因此，適合用于上述測定的生物參照制劑在本領(lǐng)域中是已知的和可獲得的(例如，免疫球蛋白生物參照制劑(immunoglobulinbiologicalreferencepreparation，批次號(hào):3))。特別而言，所述測定可以按照國際上承認(rèn)的《歐洲藥典》2.7.9“用于免疫球蛋白的fc功能的測試”(當(dāng)前版本，2011年4月)來進(jìn)行，其中采用了人類免疫球蛋白生物參照制劑(批次號(hào):3)作為對(duì)照，并以該生物參照制劑為背景確定了抗體制劑的％活性。該測試包括以下步驟：(i)對(duì)經(jīng)鞣酸處理的o型人血紅細(xì)胞加載風(fēng)疹病毒抗原，以產(chǎn)生抗原包被的血細(xì)胞；(ii)將一定量的抗體制劑與該血細(xì)胞一起溫育；添加豚鼠補(bǔ)體以啟動(dòng)補(bǔ)體引發(fā)的血細(xì)胞溶解；(iii)通過541nm處的吸收值隨時(shí)間的變化來測量溶血?jiǎng)恿W(xué)；(iv)使用單位時(shí)間內(nèi)的吸收值最大變化來評(píng)估抗體制劑中的抗體的功能。該抗體制劑的蛋白水解活性還優(yōu)選低于現(xiàn)有技術(shù)中描述的抗體制劑。特別而言，當(dāng)該制劑儲(chǔ)存在2℃～8℃下時(shí)，在其中檢測不到蛋白水解活性。蛋白水解活性可以用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)化測試方法來測量，例如使用下文實(shí)施例6中所述的顯色底物的方法。本發(fā)明的抗體制劑還可以包含穩(wěn)定劑，例如甘氨酸。與本領(lǐng)域已知的制劑一樣，本發(fā)明的抗體制劑可以儲(chǔ)存在5±3℃下。然而，由于用本發(fā)明的方法進(jìn)行了高效的純化，該抗體制劑的穩(wěn)定性極佳。液體形式的最終產(chǎn)品在2℃～8℃下穩(wěn)定至少3個(gè)月、優(yōu)選至少6個(gè)月且最優(yōu)選至少兩年，這意味著：在hpsec測定中igm的片段化或聚合不超過5％，蛋白水解活性沒有增加，針對(duì)大腸桿菌的igm抗體活性和針對(duì)肺炎球菌糖的igm抗體活性的下降不超過25％，且抗補(bǔ)體活性的增加不超過25％，保持低于1ch50/mg蛋白。此外，用相同的標(biāo)準(zhǔn)估算，通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的液體形式的最終產(chǎn)品在室溫(23℃～27℃)下穩(wěn)定至少3個(gè)月、優(yōu)選至少6個(gè)月且最優(yōu)選至少一年。制造抗體制劑的方法如上所述，本發(fā)明提供從包含免疫球蛋白的血漿組分制備含igm的抗體制劑。特備而言，本發(fā)明提供一種從人血漿制造本文所述的抗體制劑的方法，所述方法包括以下步驟：(a)從人血漿制備血漿組分，作為含免疫球蛋白的溶液；(b)將c7～c9的羧酸與所述溶液混合，并用振動(dòng)攪拌器處理經(jīng)混合的溶液以沉淀出污染性蛋白；(c)將沉淀出的蛋白從所述溶液中分離出，以產(chǎn)生含有igm的免疫球蛋白組合物；(d)將所述含有igm的免疫球蛋白組合物在ph3.5～4.5下溫育，以形成經(jīng)溫育的溶液；(e)用uvc照射所述經(jīng)溫育的溶液，從而形成經(jīng)uvc照射的溶液；和(f)在無菌條件下過濾所述經(jīng)uvc照射的溶液，從而形成適合于人靜脈內(nèi)施用的抗體制劑。適合于制備藥物免疫球蛋白組合物的血漿組分及其制造方法在本領(lǐng)域中是公知的。血漿組分優(yōu)選為沉淀的血漿組分，最優(yōu)選為通過cohn組分分離方法或其公知的變形方法(例如kistler-nitschmann)獲得的沉淀的血漿組分。最優(yōu)選的是，所述組分為冷乙醇組分分離產(chǎn)生的組分i/iii或組分iii(亦稱為組分b+i或組分b)。血漿組分的免疫球蛋白優(yōu)選包含至少5％的igm。步驟(a)包括提供血漿組分，作為含免疫球蛋白的溶液。在許多情況下，包含免疫球蛋白的血漿組分會(huì)是固體或半固體形式。因此，該步驟的目的是確保或使得血漿組分的蛋白進(jìn)入溶液，從而使得所述蛋白處在適合于在步驟(b)中與羧酸混合的狀態(tài)。該步驟可以包括將血漿組分與適合的緩沖液混合。所述緩沖液優(yōu)選為低摩爾濃度(即，低于1m)且ph為4.5～5.5，例如，ph為5.05±0.1的0.1m乙酸鈉緩沖液?；旌峡梢允褂脴~混合器或振動(dòng)攪拌器來完成。在步驟(b)中，使用振動(dòng)攪拌器將步驟(a)中形成的溶液與c7～c9的羧酸混合，從而沉淀出污染性蛋白(例如，蛋白酶、病毒等)。所述羧酸可以具有支鏈和/或可以包含不會(huì)顯著改變步驟(b)的效果的取代基。所述羧酸優(yōu)選為辛酸。該酸優(yōu)選以至少0.075kg/kg血漿組分的濃度添加，最多以0.2kg/kg的濃度添加。該酸更優(yōu)選以0.8kg/kg～0.15kg/kg血漿組分添加，最優(yōu)選以0.09kg/kg～0.13kg/kg添加?？梢杂萌魏伪憷哪枬舛鹊乃醽硖峁┱_的濃度?？梢允褂眠m合用于化工/制藥工業(yè)的任何類型的市售振動(dòng)攪拌器。適合的振動(dòng)攪拌器的實(shí)例可以從graber+pfenningergmbh獲得。特別而言，“l(fā)abormodelltyp1”振動(dòng)混合器可以用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的實(shí)驗(yàn)，而“industriemixertyp4”可以用于生產(chǎn)規(guī)模的制備?？梢愿鶕?jù)制造商的操作說明來使用振動(dòng)混合器，特別是在被制造商描述為適合于混合含蛋白的溶液的設(shè)置下進(jìn)行使用。例如，振動(dòng)混合器通?？梢栽诘陀?00hz下以小于10mm的振幅工作，例如，本發(fā)明人在使用230v電源時(shí)在50hz下使用“l(fā)abormodelltyp1”進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的振動(dòng)混合?；旌线^程的振動(dòng)振幅為0～3mm不等，而對(duì)于igm的制備，優(yōu)選使用3mm。使用了直徑為23mm～65mm的攪拌器板來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于生產(chǎn)規(guī)模，使用了直徑為395mm的攪拌器板(孔直徑為13.5mm和16mm)。在步驟(b)中，經(jīng)混合的溶液的ph優(yōu)選為4.5～5.5，更優(yōu)選為4.8～5.3。該步驟可以在乙酸鈉緩沖液中進(jìn)行，例如，用約0.1m的乙酸鈉緩沖液。執(zhí)行步驟(b)的溫度優(yōu)選為10℃～35℃，更優(yōu)選為14℃～30℃。對(duì)使用振動(dòng)攪拌器的混合時(shí)間沒有特別限制，但優(yōu)選為30分鐘至3小時(shí)，更優(yōu)選為40分鐘～110分鐘。低于30分鐘的溫育時(shí)間可以降低病毒滅活水平。在步驟(b)的一個(gè)實(shí)施方式中，將磷酸三鈣與步驟(b)中的溶液混合。優(yōu)選其以0.01kg/kg～0.02kg/kg血漿組分添加(在血漿組分為固體或半固體形式時(shí))。磷酸三鈣可以與羧酸同時(shí)添加、分開添加或依次添加。在優(yōu)選實(shí)施方式中，磷酸三鈣在添加羧酸后至少20分鐘添加。在步驟(c)中，將在步驟(b)中沉淀出的污染性蛋白從溶液中分離出，從而產(chǎn)生含有igm的免疫球蛋白組合物(即，含免疫球蛋白的溶液)。對(duì)該分離步驟沒有特別限制，可以用本領(lǐng)域中已知的任何適合的方法來執(zhí)行該分離步驟。然而，該分離步驟優(yōu)選使用過濾，更優(yōu)選使用超濾來執(zhí)行，因此，步驟(c)的產(chǎn)物是經(jīng)過濾的溶液。如上所述，本發(fā)明的方法在生成方面具有優(yōu)勢，因?yàn)槠滹@示出更高效地沉淀出了污染性蛋白，且步驟(c)因此更容易進(jìn)行。當(dāng)對(duì)步驟(b)產(chǎn)生的混合物進(jìn)行分離時(shí)，獲得了透明清晰的溶液，即含igm的免疫球蛋白組合物。因此過濾更快且更容易。需要進(jìn)一步的加工步驟(d)～(f)來將從步驟(c)獲得的含igm的免疫球蛋白組合物轉(zhuǎn)化為適合于靜脈內(nèi)施用的抗體制劑。步驟(d)包括用溫和酸條件處理從步驟(c)獲得的含有igm的免疫球蛋白組合物，步驟(e)包括對(duì)經(jīng)酸處理的組合物進(jìn)行uvc照射以形成經(jīng)uvc照射的溶液，步驟(f)包括在無菌條件下過濾所述經(jīng)uvc照射的溶液以形成適合于人靜脈內(nèi)施用的抗體制劑。在用溫和酸條件進(jìn)行處理時(shí)，在ph為3.5～4.5、優(yōu)選為3.8～4.2下溫育從步驟(c)獲得的含igm的免疫球蛋白組合物，從而形成經(jīng)溫育的溶液。溫和酸條件可以通過向含igm的免疫球蛋白組合物中添加適合的酸來獲得，例如，可以通過添加0.2m的hcl來調(diào)節(jié)ph。該溫育步驟優(yōu)選在32℃～42℃下、更優(yōu)選在35℃～39℃下進(jìn)行。溫育時(shí)間優(yōu)選為2小時(shí)至24小時(shí)，更優(yōu)選為9小時(shí)至16小時(shí)。在照射步驟中，對(duì)于從上述溫和酸處理中獲得的經(jīng)溫育的溶液用uvc光進(jìn)行處理，從而形成經(jīng)uvc照射的溶液。該步驟可以使用市售的設(shè)備來進(jìn)行，例如設(shè)備(bayertechnologyservices)。為了使?jié)撛诘牟《竞偷鞍酌高M(jìn)一步滅活，優(yōu)選以200j/m2～500j/m2、更特別以200j/m2～300j/m2在254±10nm處理所述經(jīng)溫育的溶液。已注意到，通常要求的在溫和條件下的uvc處理僅對(duì)通過振動(dòng)混合進(jìn)行的辛酸處理后本發(fā)明所獲得的水澄清濾液可行。標(biāo)準(zhǔn)攪拌技術(shù)所通常得到的更乳白或更不透明的溶液會(huì)需要更長的照射時(shí)間，這將導(dǎo)致igm活性的更多變性及更低的病毒滅活率。在步驟(f)中，在無菌條件下將經(jīng)照射的溶液過濾，從而形成適合于人靜脈內(nèi)施用的抗體制劑。所述過濾優(yōu)選為納米過濾，更優(yōu)選為通過孔徑為40nm～50nm的過濾器進(jìn)行的過濾。除了溫和酸處理、uvc照射和過濾步驟外，用來獲得靜脈內(nèi)施用的免疫球蛋白制劑的額外步驟還可以可選地包括一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步的過濾步驟。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以使處理中的蛋白溶液吸收到deae-交聯(lián)葡聚糖凝膠上，隨后通過深度過濾使之與交聯(lián)葡聚糖凝膠分離。例如，可以進(jìn)一步在ph5.8下以75mg/kg蛋白deae交聯(lián)葡聚糖凝膠對(duì)所述蛋白溶液進(jìn)行分批吸收，從而除去不需要的伴隨性血漿銅藍(lán)蛋白。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)從溫和酸處理中獲得的經(jīng)溫育的溶液進(jìn)行deae-交聯(lián)葡聚糖凝膠吸附，隨后通過深度過濾使之與交聯(lián)葡聚糖凝膠分離，然后進(jìn)行uvc照射處理。在另一個(gè)實(shí)施方式中，處理中的免疫球蛋白溶液可以通過納米過濾器來過濾。在處理過程中的各個(gè)階段，可以使用孔徑為75±5nm～35±5nm的過濾器或具有75nm～35nm標(biāo)稱孔徑的過濾器(例如pallultipordv50)。(舉例而言，50nm的標(biāo)稱孔徑意味著對(duì)大小為50nm以上的病毒的截留率≥4log10)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，使從上文所述的deae-交聯(lián)葡聚糖凝膠步驟中獲得的溶液過濾通過0.2μm過濾器，隨后再進(jìn)行uvc照射。由上述方法獲得的最終抗體制劑(即，經(jīng)處理的含igm的免疫球蛋白溶液)可以直接在無菌條件下填充到容器中。作為另一選擇，可以將該抗體制劑配制在ph為4～5.5、優(yōu)選為4.1～4.5的含甘氨酸的緩沖液中。還可以將該抗體制劑稀釋至蛋白濃度為40g/l～80g/l、優(yōu)選為55g/l～70g/l。應(yīng)注意到，也可以用公知的方法(例如陰離子交換層析)來富集抗體制劑中的igm含量。如上文所示，上述方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒顆粒的更高水平的滅活和去除，尤其是對(duì)抗性非常高的無包膜病毒(例如細(xì)小病毒)尤其如此，這些病毒通常不易受到辛酸處理的影響。此外，與常規(guī)的攪拌相比，實(shí)現(xiàn)了改善的蛋白水解活性去除。這些特征是在保持高產(chǎn)率的未經(jīng)化學(xué)修飾的igm的同時(shí)獲得的。上述發(fā)現(xiàn)與下述常規(guī)觀點(diǎn)相反：辛酸處理并不是針對(duì)無包膜病毒的有效步驟，且改善的病毒安全性必須通過用更嚴(yán)厲的方法(例如β-丙內(nèi)酯處理)使病毒滅活來實(shí)現(xiàn)。此外，為人熟知的是，提高例如辛酸的濃度來完全除去蛋白水解活性會(huì)導(dǎo)致igm的大量損失。所述方法的結(jié)果通過使用振動(dòng)模式的混合設(shè)備與辛酸處理結(jié)合而獲得。這特別出人意料，因?yàn)橐阎氖莍gm非常易受剪切應(yīng)力的影響，這種剪切應(yīng)力會(huì)導(dǎo)致不合需要的高抗補(bǔ)體活性。因此，不會(huì)想到使用振動(dòng)混合器來制備igm組合物，且不會(huì)預(yù)料到在處理含igm的溶液期間使用振動(dòng)混合時(shí)會(huì)產(chǎn)生如此有利的效果。此外，使用所述方法，在使用振動(dòng)混合設(shè)備時(shí)增強(qiáng)了通過步驟(c)所實(shí)現(xiàn)的分離，例如，通過過濾從步驟(b)獲得的經(jīng)辛酸處理的溶液來進(jìn)行的澄清化。更容易地實(shí)現(xiàn)了分離，從而減少了處理時(shí)間和制造成本，且步驟(c)產(chǎn)生了清澈的溶液，這為下游加工提供了優(yōu)勢。通過對(duì)經(jīng)辛酸處理的含igm溶液的攪拌后產(chǎn)物進(jìn)行過濾而得到的常規(guī)溶液呈乳白色或不透明。對(duì)從步驟(c)獲得的含igm的組合物優(yōu)選進(jìn)行用溫和酸條件(例如，ph4)處理和uvc照射步驟，從而進(jìn)一步改善病毒安全性并使最終產(chǎn)品穩(wěn)定化。由于對(duì)從步驟(c)獲得的含igm的免疫球蛋白組合物的澄清化有所增強(qiáng)，因此可以降低uvc的必需照射時(shí)間，從而使無包膜病毒的病毒滅活程度大于3或4log10。這在uvc處理過程中產(chǎn)生了更高產(chǎn)率的天然的具有活性的igm。出人意料的是，這些步驟產(chǎn)生了含有未經(jīng)化學(xué)修飾和酶修飾的igm的溶液，所述溶液具有更高產(chǎn)率的天然的具有活性的igm，具有低的抗補(bǔ)體活性和低蛋白水解活性，且具有高的抗細(xì)菌和抗病毒活性，具有關(guān)于有包膜病毒和無包膜病毒的優(yōu)異的病毒安全性；這對(duì)于靜脈內(nèi)施用的藥物而言是關(guān)鍵特征。此外，經(jīng)處理的含igm溶液具有改善的長期穩(wěn)定性，其在2℃～8℃下在液體溶液中持續(xù)超過12個(gè)月均非常穩(wěn)定。醫(yī)藥應(yīng)用本發(fā)明的抗體制劑適合于醫(yī)藥應(yīng)用，并且可以用于治療免疫紊亂性疾病和感染，特別是igm缺陷疾病和細(xì)菌感染。與多價(jià)免疫球蛋白g制劑相比，用于靜脈內(nèi)施用的富集有人igm的多價(jià)免疫球蛋白制劑包含更高的針對(duì)臨床相關(guān)的革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細(xì)菌的抗體效價(jià)、更高的針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素和革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細(xì)菌的外毒素的抗體效價(jià)。特別而言，本發(fā)明的抗體制劑適合于向患者靜脈內(nèi)施用。本發(fā)明還提供患者的治療方法，所述治療方法包括向該患者施用本發(fā)明的抗體制劑的步驟。特別而言，所述患者可以患有免疫紊亂性疾病或細(xì)菌感染。在優(yōu)選實(shí)施方式中，靜脈內(nèi)施用所述抗體制劑?，F(xiàn)將僅以示例方式來進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例測定方法通過對(duì)igm濃縮物進(jìn)行hplc來確定的分子大小分布可以使用以下方法來確定抗體制劑中的％聚集體(如在實(shí)施例8所使用的)。測試溶液：注入約50g/l的未稀釋的樣品，進(jìn)樣體積為10μl(約500μg蛋白加載量)。參照溶液：人免疫球蛋白(例如，intratect,biotestag，生物測試股份公司)標(biāo)準(zhǔn)溶液：bio-rad凝膠過濾標(biāo)準(zhǔn)樣(產(chǎn)品號(hào)151-1901)柱：—尺寸：l＝30mm，—固定相：tosohbiosciencetsk-gelg4000swxl，適于相對(duì)分子質(zhì)量為20000da～7×106da的球蛋白的分級(jí)。流動(dòng)相：將4.873g二水合磷酸氫二鈉、1.741g一水合磷酸二氫鈉、11.688g氯化鈉和50mg疊氮化鈉溶解在1升水中。流速：0.5ml/分鐘檢測：在280nm使用分光光度計(jì)。在用參照溶液獲得的色譜圖中，按照以下方案對(duì)色譜圖進(jìn)行積分，并鑒定出各個(gè)峰：·多聚體(>1200kd)，10分鐘～13分鐘·igm(1200kd～750kd)，13分鐘～19分鐘·二聚體/iga(750kd～350kd)，19分鐘～20分鐘·igg(350kd～100kd)，20分鐘～26分鐘·片段(<100kd)，26分鐘～40分鐘·片段(<100kd)，26分鐘～40分鐘對(duì)非特異性補(bǔ)體活化的確定補(bǔ)體使經(jīng)過溶血素預(yù)處理的綿羊紅血球發(fā)生溶血。憑借樣品中的補(bǔ)體結(jié)合性抗體，溶血得到了抑制。確定了被1mg免疫球蛋白結(jié)合(滅活)了的補(bǔ)體的量。將一定量的免疫球蛋白(10mg)與豚鼠的補(bǔ)體混合，并對(duì)游離的補(bǔ)體進(jìn)行滴定。將抗補(bǔ)體活性表示為相對(duì)于參照溶液中所用補(bǔ)體的已用補(bǔ)體。補(bǔ)體活性的溶血單位(ch50)是導(dǎo)致最佳緩沖條件中的5×108個(gè)紅血球總量中的2.5×108個(gè)最佳制備的紅血球發(fā)生溶血的補(bǔ)體的量。最佳制備的紅血球(8ml來自綿羊的穩(wěn)定化紅血球，用白明膠-巴比妥緩沖液清洗了三次，最后將1ml紅血球沉積物懸浮在24ml白明膠-巴比妥緩沖液中)通過以下方法制得：將20ml紅血球懸浮液與20ml溶血素(調(diào)節(jié)至2mhe/ml—最小溶血單位)混合，并于37℃溫育15分鐘。將10mg當(dāng)量的免疫球蛋白稀釋在白明膠-巴比妥緩沖液(1lph7.3的巴比妥緩沖液含1g白明膠，5倍的巴比妥緩沖溶液：83克氯化鈉、10.192g巴比妥鈉于2升水中，ph7.3)中。將200μl補(bǔ)體100ch50/ml添加至1ml的最終體積中。將試管在37℃下振蕩溫育1小時(shí)。稀釋樣品，并針對(duì)最佳制備的紅血球?qū)悠愤M(jìn)行滴定。在37℃下溫育1小時(shí)后，離心樣品，并使用分光光度計(jì)在541nm處確定光密度。對(duì)蛋白水解活性的確定蛋白水解活性可以通過以下方法來估算：于37℃將顯色底物(特別是對(duì)至少一種絲氨酸蛋白酶敏感的顯色底物)與抗體制劑樣品(通常稀釋在緩沖液中以達(dá)到測定的線性范圍)混合，隨后使用分光光度計(jì)監(jiān)測吸收動(dòng)力學(xué)。該樣品的蛋白水解活性通過使用等式c(u/l)＝313s×δabs/分鐘×f(c＝蛋白水解活性；s＝與顯色底物的特定吸收變化相關(guān)的轉(zhuǎn)換因子；f＝稀釋因子)由起始吸收差(δabs/分鐘)計(jì)算得到。根據(jù)制造商的操作說明來使用該底物。特別而言，蛋白水解活性可以通過以下步驟來估算：(a)將25mg底物s-2288(chromogenix)溶解在7.2ml注射用水中；(b)將抗體制劑樣品稀釋在緩沖液(100mmtris.hcl，ph8.4，106mmnacl)中，以達(dá)到測定的線性范圍，并將溫度調(diào)節(jié)至37℃；(c)將經(jīng)稀釋的抗體制劑與已溶解的底物以等量(例如200μl)混合；(d)使用分光光度計(jì)在405nm處于37℃測量吸收動(dòng)力學(xué)1分鐘～3分鐘；(e)通過使用等式c(u/l)＝313×δabs/分鐘×f(c＝蛋白水解活性；f＝稀釋因子)由起始吸收差(δabs/分鐘)計(jì)算出樣品的蛋白水解活性。該方法的定量測定極限是8u/l；使用本發(fā)明的抗體制劑的樣品，檢測不到蛋白水解活性。因此，本發(fā)明的最終產(chǎn)品中的蛋白水解活性水平低于8u/l。實(shí)施例1—從組分i/iii制備富集有igm的制劑將源自人血漿的冷乙醇組分分離過程的180kgcohn組分i/iii懸浮在720l0.1m的乙酸鈉緩沖液(ph5.05)中，并在達(dá)到懸浮液溫度(22±4℃)后混合15分鐘～30分鐘。通過在室溫下添加19.8kg辛酸(0.110kg/kg所用的糊狀物i/iii)來對(duì)上述溶液進(jìn)行處理，隨后用振動(dòng)混合器(規(guī)格4，graber+pfennigergmbh，將振動(dòng)混合器調(diào)節(jié)至2～3級(jí))將蛋白溶液進(jìn)一步混合80分鐘。歷時(shí)30分鐘緩慢添加辛酸。添加約3kg磷酸三鈣((ca3(po4)2)，隨后再混合蛋白溶液至少15分鐘。利用過濾器壓力通過澄清過濾來除去沉淀。進(jìn)行另外的0.2μm過濾，并用10kd膜對(duì)蛋白溶液進(jìn)行超濾。以0.04mnacl溶液為背景對(duì)蛋白溶液進(jìn)行滲濾，之后將蛋白溶液調(diào)節(jié)至蛋白濃度為40g/l。在使用注射用水進(jìn)行1+1稀釋后，在ph4.0±0.1下處理蛋白溶液。ph調(diào)節(jié)通過使用1mhcl來進(jìn)行，并于37℃±2℃溫育蛋白溶液9小時(shí)。在ph4下溫育之后，用1mnaoh將蛋白溶液調(diào)節(jié)至ph5.8。對(duì)于所得到的蛋白溶液，通過分批添加deae交聯(lián)葡聚糖凝膠(75gdeae交聯(lián)葡聚糖凝膠/kg蛋白)來進(jìn)行進(jìn)一步純化。在攪拌下于室溫溫育蛋白溶液60分鐘以上。通過澄清過濾來除去deae交聯(lián)葡聚糖凝膠。對(duì)蛋白溶液進(jìn)行0.2μm過濾。使蛋白溶液過濾通過0.1μm過濾器和pall,ultiporvfdv50,20"過濾器。使用流動(dòng)通過式處理設(shè)備(bayertechnologyservices/sartoriusstedim)以240j/m2的uvc劑量在254nm處對(duì)濾液進(jìn)行進(jìn)一步的uvc光處理。使用制造商的操作說明來計(jì)算通過uvc反應(yīng)器的流速。通過超濾將經(jīng)照射的蛋白溶液濃縮至蛋白濃度為50g/l～70g/l，并對(duì)其進(jìn)行滲濾(10kd膜，使用0.32mph＝4.3的甘氨酸緩沖液)。使最終產(chǎn)物過濾通過0.2μm過濾器，并在2℃～8℃下儲(chǔ)存。實(shí)施例2—對(duì)辛酸處理步驟中的條件的研究對(duì)于辛酸處理，使用實(shí)施例1中描述的方法檢測了以下實(shí)驗(yàn)范圍，并且還測試了其相互間的組合(結(jié)果未示出)。-辛酸量：0.09kg/kg～0.13kg/kg(與每kg所用組分i/iii對(duì)應(yīng)的辛酸量)(120mm～180mm辛酸)-辛酸處理的ph：ph4.8～5.3-反應(yīng)的溫度范圍：14℃～30℃-溫育時(shí)間：40分鐘～110分鐘所有經(jīng)檢測的條件都產(chǎn)生了易于澄清以用于后續(xù)處理的中間體，并且蛋白水解活性從懸浮的cohn組分i/iii中的數(shù)千u/l發(fā)生了大幅度下降。這些中間體產(chǎn)生了蛋白水解活性低于8u/l(按下文實(shí)施例6所述進(jìn)行計(jì)算得到)的最終產(chǎn)品，8u/l為定量測定的極限。實(shí)施例3—通過振動(dòng)混合器的病毒消減—對(duì)使用和不使用振動(dòng)混合器的辛酸處理確定病毒去除系數(shù)在ph5.05和22℃下，對(duì)250ml懸浮的組分i/iii進(jìn)行30分鐘的勻質(zhì)。將2.6ml病毒原液摻入上述懸浮液中。添加辛酸(110g/kg)，并使用振動(dòng)混合器勻質(zhì)60分鐘。在平行實(shí)驗(yàn)中，通過標(biāo)準(zhǔn)攪拌對(duì)同樣的混合物進(jìn)行勻質(zhì)。60分鐘后，添加磷酸三鈣(0.15g/kg辛酸)，并攪拌懸浮液15分鐘。通過使用濾片進(jìn)行深度過濾來使懸浮液澄清。濾片用70ml～80ml緩沖液預(yù)先沖洗過。過濾后，用80ml緩沖液沖洗濾器。將濾液和洗液合并，并提取樣品進(jìn)行病毒滴定。在針對(duì)sv40、reo和ppv的適合的指示細(xì)胞(cv-1、ccl.7.1和pk13)上確定了在添加辛酸前和進(jìn)行過濾后所采集的樣品中的病毒效價(jià)。最后，按照目前用于病毒驗(yàn)證研究的準(zhǔn)則計(jì)算出去除系數(shù)。在病毒驗(yàn)證研究中，諸如sv40和reo等無包膜病毒分別以大于4log10和大于5log10的量級(jí)被有效去除。此外，超過3log10的ppv被去除。這些值比在無振動(dòng)混合的標(biāo)準(zhǔn)攪拌條件下進(jìn)行相同的辛酸處理時(shí)高出超過10倍至1000倍。表1：對(duì)使用及不使用振動(dòng)混合器時(shí)辛酸處理的病毒消減系數(shù)(log10)的比較。標(biāo)準(zhǔn)攪拌下的辛酸反應(yīng)[log10消減]振動(dòng)混合下的辛酸反應(yīng)[log10消減]ppv2.15±0.323.39±0.36reo2.34±0.385.46±0.28sv402.05±0.44.71±0.34實(shí)施例4—對(duì)uvc處理的評(píng)估對(duì)uvc照射劑量的最佳范圍進(jìn)行了評(píng)估。在實(shí)現(xiàn)至少4log10的無包膜病毒的滅活的最小必需劑量和避免igm分子變性(其致使fab結(jié)合抗原的功能受損且使影響補(bǔ)體活化的fc功能受損)的最大耐受劑量之間存在平衡。在200j/m2～400j/m2范圍內(nèi)，僅能觀察到免疫球蛋白聚集體的略微增加，且觀察不到對(duì)片段含量的顯著影響。在實(shí)驗(yàn)中，利用銷售商提供的來自bts的excel表(用戶主計(jì)算表uvivateclabii，版本號(hào)3.0)，用原始蛋白溶液的光密度(od)來計(jì)算uvivatec實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)中的流速。計(jì)算流速時(shí)，將燈的性能、uv信號(hào)燈傳感器的設(shè)定點(diǎn)和所需的uvc照射劑量考慮在內(nèi)。以5.8l/h的流速將蛋白含量為約55g/l的含igm溶液(批次86gb005be07)泵送通過uvivatec系統(tǒng)，從而為單次流動(dòng)通過實(shí)現(xiàn)200j/m2的劑量。以3.9l/m2的流速將蛋白溶液泵送通過該系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)300j/m2的劑量。以2.9l/m2的流速將蛋白溶液泵送通過該系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)400j/m2。表2：對(duì)濃縮的最終產(chǎn)品中uvc處理前、后的活性和效價(jià)確定的分析結(jié)果在200j/m2～400j/m2范圍內(nèi)，未能觀察到免疫球蛋白含量、蛋白水解活性或aca上的顯著差異。優(yōu)選的劑量范圍設(shè)定為200j/m2～300j/m2，因?yàn)?00j/m2足以使無包膜病毒滅活，而在300j/m2下，未能看到對(duì)聚集體的形成和抗體效價(jià)的顯著影響。優(yōu)選的劑量為225j/m2。以5.8l/h的流速將蛋白含量為8g/l～12g/l的經(jīng)稀釋的含igm溶液(批次86bb059be07)泵送通過uvivatec系統(tǒng)，從而為單次流動(dòng)通過實(shí)現(xiàn)200j/m2～300j/m2的劑量。表3：對(duì)以不同的uvc劑量進(jìn)行uvc照射前、后的igm溶液的分析結(jié)果在此劑量范圍程序內(nèi)，免疫球蛋白類別之間的分布保持不受uv照射的影響。經(jīng)hpsec分析，分子量分布模式亦未發(fā)生變化。經(jīng)cze分析，純度水平保持不變。蛋白水解活性(pa)、前激肽釋放酶活化劑(pka)和抗補(bǔ)體活性(aca)無變化。此外，對(duì)所有免疫球蛋白類別而言，用elisa方法測得的抗細(xì)菌活性均未發(fā)生顯著變化。對(duì)用升高的uv強(qiáng)度照射的等分部分進(jìn)行了進(jìn)一步的處理直至獲得最終產(chǎn)品，并對(duì)其進(jìn)行同樣一套分析測試。在該最終產(chǎn)品中也未能觀察到顯著差異。所有測得的抗體效價(jià)始終處于未經(jīng)uvc處理的對(duì)照制劑的100±10％的范圍內(nèi)。實(shí)施例5—使用振動(dòng)混合器/ph4處理和uvc處理后的總體病毒消減—對(duì)病毒去除系數(shù)的確定使用以下模型病毒對(duì)通過振動(dòng)混合進(jìn)行的辛酸處理、ph4處理和uvc處理(215j/m2)這三個(gè)步驟的病毒去除/滅活進(jìn)行了驗(yàn)證：牛病毒性腹瀉病毒(bvdv)(作為丙型肝炎病毒的模型病毒)，假性狂犬病病毒(prv)(作為人類皰疹病毒的模型病毒)，人免疫缺陷病毒(hiv-1)，馬動(dòng)脈炎病毒(eav)(作為冠狀病毒的模型病毒)，sindbis病毒(sinv)(作為黃病毒的模型病毒)，鼠腦脊髓炎病毒(mev)(作為甲型肝炎病毒的模型病毒)，呼腸孤病毒(reo)(作為其他無包膜病毒的模型病毒)，豬細(xì)小病毒(ppv)(作為人細(xì)小病毒b19的模型病毒)。對(duì)辛酸處理、ph4處理和uvc處理這三個(gè)步驟的研究的結(jié)果在下表2中列出。表4：igm產(chǎn)生方法所致的總病毒消減模型病毒bvdvprvhiv-1eavsinvmevreoppv總消減(log10)>12.5>10.1>12.7>8.4a>13.7a9.2>11.0>8.4a在沒有uvc照射步驟的驗(yàn)證數(shù)據(jù)的情況下的消減系數(shù)用標(biāo)稱孔徑為約50nm的過濾器進(jìn)行的可選的納米過濾通過將總消減提升至超過17log10(視病毒尺寸而定)而增加了額外的安全性。例如，隨后對(duì)hiv-1的去除達(dá)到了>17.5log10，然而納米過濾并未進(jìn)一步除去ppv。因此，本發(fā)明的純化程序產(chǎn)生了優(yōu)異的病毒安全的igm制劑，該制劑具有迄今為止此類含igm制劑未達(dá)到的大于8log10的病毒滅活/消減率。這對(duì)于無包膜病毒(如mev、reo和ppv)來說尤其重要，通常，這些病毒因其尺寸小和缺乏脂質(zhì)包膜而對(duì)病毒滅活和去除程序更具抗性。實(shí)施例6—對(duì)使用和不使用振動(dòng)混合器的辛酸處理的殘留蛋白水解活性的確定如實(shí)施例1中那樣進(jìn)行了辛酸處理，并在未使用振動(dòng)混合器而是使用槳式攪拌器進(jìn)行強(qiáng)烈的標(biāo)準(zhǔn)攪拌的平行實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了辛酸處理。在進(jìn)行了辛酸/磷酸三鈣處理和超濾/滲濾后，根據(jù)制造商的操作說明，使用顯色底物s-2288(chromogenix)確定了樣品中的蛋白水解活性。將25mg底物s-2288(chromogenix)溶解在7.2ml注射用水中。將樣品稀釋在緩沖液(100mmtris/hcl，ph8.4，106mmnacl)中以達(dá)到測定的線性范圍，例如將200μl緩沖液與200μl樣品(混合并調(diào)節(jié)溫度至37℃)和200μl顯色底物溶液混合。使用分光光度計(jì)于37℃在405nm處測量吸收動(dòng)力學(xué)(1分鐘～3分鐘)。通過使用等式c(u/l)＝313×δabs/分鐘×f(c＝蛋白水解活性；f＝稀釋因子)由起始吸收差(δabs/分鐘)計(jì)算出樣品的蛋白水解活性。表5：辛酸處理所致的蛋白水解活性下降在使用振動(dòng)混合時(shí)，辛酸處理后的濾液清澈。在對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，使用漿式攪拌器進(jìn)行辛酸處理后的濾液非常不透明且難以過濾。實(shí)施例7：本發(fā)明的igm制劑中的抗細(xì)菌效價(jià)為了與唯一的市售靜脈內(nèi)耐受的含igm的制劑pentaglobin進(jìn)行比較，在三批該成熟藥物中進(jìn)行了抗細(xì)菌活性分析，并將該活性與本發(fā)明的制劑進(jìn)行比較。通過elisa，對(duì)igm制劑中針對(duì)抗細(xì)菌或抗真菌抗原的iga或igm類的抗體進(jìn)行了確定。用對(duì)應(yīng)的抗原包被微量滴定板，并將其與標(biāo)準(zhǔn)樣或所述igm制劑一起溫育。用抗人iga偶聯(lián)物或抗人igm偶聯(lián)物檢測與抗原結(jié)合的抗體。該檢測使用酶底物來進(jìn)行。發(fā)生的顏色變化與存在于igm制劑中的抗體的量對(duì)應(yīng)。表6對(duì)本發(fā)明的制劑和市售的pentaglobin中的igm抗細(xì)菌結(jié)合活性的比較表7對(duì)本發(fā)明的制劑和市售的pentaglobin中的iga抗細(xì)菌結(jié)合活性的比較新制劑中igm和iga所介導(dǎo)的活性通常是pentaglobin中的至少1.5倍高，這可以用pentaglobin中的igm和iga已被β-丙內(nèi)酯化學(xué)修飾這一事實(shí)來解釋。這一步驟被本發(fā)明中的更溫和的程序替代?？偠灾@些數(shù)據(jù)表明最終制劑中的igm分子的結(jié)合區(qū)在功能上具有完整活性。實(shí)施例8對(duì)液體igm產(chǎn)品的儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究將未經(jīng)uvc處理的實(shí)施例1的產(chǎn)品儲(chǔ)存在2℃～8℃的10ml或100ml玻璃小管(填充體積為5ml或50ml)中，并就規(guī)范中的所有參數(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果示于表8中。與顯示出穩(wěn)定性相關(guān)的參數(shù)是：用高效尺寸排阻色譜法(hpsec)測得的聚集體和片段含量，蛋白水解活性(pa)，和抗補(bǔ)體活性(aca)。這些參數(shù)對(duì)靜脈內(nèi)耐受性至關(guān)重要，并且可能在長期儲(chǔ)存過程中發(fā)生變化。在2℃～8℃下，這些參數(shù)無顯著變化。甚至在室溫(23℃～27℃)下儲(chǔ)存時(shí)，這些值仍在規(guī)范范圍內(nèi)，但在室溫下在24個(gè)月之后片段會(huì)略有增加。還確定了其他參數(shù)，例如著色、乳白度、ph值，這些參數(shù)在整個(gè)研究期間保持不變。在2℃～8℃下，針對(duì)各種細(xì)菌的igm和iga效價(jià)保持穩(wěn)定超過2年。將經(jīng)uvc處理的實(shí)施例1的產(chǎn)品也儲(chǔ)存在2℃～8℃和室溫下的10ml或100ml玻璃小管(填充體積為5ml或50ml)中，并就規(guī)范中的所有參數(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果示于表9中。在仍在進(jìn)行的該穩(wěn)定性研究中，目前獲得的12個(gè)月的數(shù)據(jù)顯示出該產(chǎn)品與未經(jīng)uvc處理時(shí)的產(chǎn)品相同的穩(wěn)定性特征，這使得可以外推至24個(gè)月的穩(wěn)定性。表8在2℃～8℃下測試的批次a586067的穩(wěn)定性水平位置填充量：5mln.t.＝未測試表9在2℃～8℃下測試的批次a586057的穩(wěn)定性水平位置填充量：50ml實(shí)施例9用igm產(chǎn)品進(jìn)行的體外非特異性補(bǔ)體活化實(shí)施例9a—對(duì)c5a水平的確定使用因子c5a作為末端補(bǔ)體途徑的活化的標(biāo)志物分析了igm制劑的在體外非特異性地激活補(bǔ)體的潛力。出于此目的，將人血清與免疫球蛋白產(chǎn)品或緩沖液一起溫育120分鐘。在溫育了0分鐘、5分鐘、15分鐘、60分鐘和120分鐘后取樣。為了展示體外系統(tǒng)的適合功能，示出了補(bǔ)體系統(tǒng)的完全抑制和完全活化。使用市售的酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)試劑盒(quidelmicrovuec5apluseia試劑盒；a025)，用光度計(jì)通過光密度確定來測量了補(bǔ)體因子的濃度。在37℃下快速融解人血清(quidelnhs；a113)并立即置于冰上。每個(gè)單樣品由包含血清的反應(yīng)批料組成(100μl)。首先用吸量管加入添加劑，隨后添加人血清，從而使每個(gè)反應(yīng)批料中的反應(yīng)開始。不含任何添加劑的人血清充當(dāng)空白，并顯示出實(shí)驗(yàn)設(shè)置所致的基線補(bǔ)體活化。添加熱聚集的igg(haagquidel；a114；1.3μl)來充當(dāng)人血清補(bǔ)體的強(qiáng)活化劑，從而展示該體外系統(tǒng)的應(yīng)答性。為了在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間和實(shí)驗(yàn)處理期間完全抑制補(bǔ)體活化，在人血清中添加了edta(終濃度10mm)。調(diào)節(jié)igm制劑、pentaglobin(如ep0013901所述)和ep0413187所述的igm制劑，使得每個(gè)反應(yīng)中的igm濃度為1.72mg/ml。使用相應(yīng)體積的配制緩沖液作為陰性對(duì)照。于37℃在持續(xù)攪拌下溫育0分鐘、5分鐘、15分鐘、60分鐘和120分鐘，之后，通過添加穩(wěn)定化溶液(quidel樣品穩(wěn)定劑a9576；140μl)來使所有反應(yīng)停止。按照制造商的操作規(guī)程，進(jìn)行了后續(xù)的樣品稀釋和elisa分析。該實(shí)驗(yàn)在兩個(gè)獨(dú)立的平行測定中進(jìn)行，并計(jì)算了平均值。結(jié)果示于表10和圖2中。添加活化劑(熱聚集的igg)導(dǎo)致了c5a在15分鐘內(nèi)的明顯增加，從而表明了該體外系統(tǒng)檢測補(bǔ)體活化的靈敏應(yīng)答。添加作為抑制劑的edta導(dǎo)致了在整個(gè)溫育期間未變化的值，說明補(bǔ)體活化是特異性的，而不是由于樣品操作或制備所致的人為假象。于37℃溫育人血清并暴露于人造表面引發(fā)了輕微的補(bǔ)體活化，將其記錄為空白值。ep0413187所述的igm參照制劑在60分鐘后導(dǎo)致了最高超過1000ng/ml的補(bǔ)體活化(表10)。市售的經(jīng)化學(xué)修飾的參照制劑pentaglobin(ep0013901)與ep0413187產(chǎn)品相比仍顯示出一半的補(bǔ)體活化潛力。用本發(fā)明的igm制劑處理過的血清中的c5a的濃度與在不含添加劑的血清(空白)或用配制緩沖液(300mm甘氨酸、ph4.3，或0.45％nacl/2.5％葡萄糖、ph6.8)處理過的血清中測得的c5a濃度相當(dāng)。因此，在該體外測試系統(tǒng)中，本發(fā)明的igm制劑中的免疫球蛋白在人血清中基本不非特異性地激活補(bǔ)體。表10在用含有igm的免疫球蛋白處理過的人血清中檢測到的平均c5a濃度實(shí)施例9b對(duì)c3a水平的確定使用因子c3a作為補(bǔ)體途徑的活化的標(biāo)志物分析了igm制劑的在體外非特異性地激活補(bǔ)體的潛力。出于此目的，將人血清與免疫球蛋白產(chǎn)品或緩沖液一起溫育120分鐘。在溫育0分鐘、5分鐘、15分鐘、60分鐘和120分鐘后取樣。為了展示體外系統(tǒng)的適合功能，示出了補(bǔ)體系統(tǒng)的完全抑制和完全活化。使用市售的酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)試劑盒(quidelmicrovuec3apluseia試劑盒；a032)，用光度計(jì)通過光密度確定來測量了補(bǔ)體因子的濃度。在37℃下快速融解人血清(quidelnhs；a113)并立即置于冰上。每個(gè)單樣品由包含血清的反應(yīng)批料組成(100μl)。首先用吸量管加入添加劑，隨后添加人血清，從而使每個(gè)反應(yīng)批料中的反應(yīng)開始。不含任何添加劑的人血清充當(dāng)空白，并顯示出實(shí)驗(yàn)設(shè)置所致的基線補(bǔ)體活化。添加眼鏡蛇毒因子(cvfquidel；a600；20u/ml)來充當(dāng)人血清補(bǔ)體的強(qiáng)活化劑，從而展示該體外系統(tǒng)的應(yīng)答性。為了在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間和實(shí)驗(yàn)處理期間完全抑制補(bǔ)體活化，在人血清中添加了edta(終濃度10mm)。調(diào)節(jié)igm制劑和pentaglobin(如ep0013901所述)，使得每個(gè)反應(yīng)中的igm濃度為1.72mg/ml。使用相應(yīng)體積的配制緩沖液作為陰性對(duì)照。于37℃在持續(xù)攪拌下溫育0分鐘、5分鐘、15分鐘、60分鐘和120分鐘，之后，通過添加穩(wěn)定化溶液(quidel樣品穩(wěn)定劑a9576；140μl)來使所有反應(yīng)停止。按照制造商的操作規(guī)程，進(jìn)行了后續(xù)的樣品稀釋和elisa分析。該實(shí)驗(yàn)在兩個(gè)獨(dú)立的平行測定中進(jìn)行，并計(jì)算了平均值。結(jié)果示于表11和圖3中。添加活化劑(cvf)導(dǎo)致了c3a在15分鐘內(nèi)的明顯增加，從而表明了該體外系統(tǒng)檢測補(bǔ)體活化的靈敏應(yīng)答。添加作為抑制劑的edta導(dǎo)致了在整個(gè)溫育期間未變化的值，說明補(bǔ)體活化不是由于樣品操作或制備所致的人為假象。于37℃溫育人血清并暴露于人造表面引發(fā)了輕微的補(bǔ)體活化，將其記錄為空白值。市售的經(jīng)化學(xué)修飾的參照制劑pentaglobin(ep0013901)顯示出的c3活化潛力為空白值的三倍高。用本發(fā)明的igm制劑處理過的血清中的c3a的濃度與在不含添加劑的血清(空白)或用配制緩沖液(300mm甘氨酸、ph4.3，或0.45％nacl/2.5％葡萄糖、ph6.8)處理過的血清中測得的c3a濃度相當(dāng)。因此，在該體外測試系統(tǒng)中，本發(fā)明的igm制劑中的免疫球蛋白在人血清中基本不以顯著的量非特異性地激活補(bǔ)體。表11在用含有igm的免疫球蛋白處理過的人血清中檢測到的平均c3a濃度實(shí)施例10用igm產(chǎn)品進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為了確認(rèn)安全性和耐受性，在8只有意識(shí)的食蟹猴中研究了在歷時(shí)5天反復(fù)進(jìn)行靜脈內(nèi)輸注后igm制劑對(duì)動(dòng)脈血壓的影響。以190mg/igm/kg/日的劑量施用了按本文所述的方法制備的igm制劑。向一些猴施用了市售的靜脈內(nèi)耐受的含igm制劑pentaglobin，以作為對(duì)比物質(zhì)。以施用相同igm劑量的方式施用pentaglobin。在注射后確定了血壓，從而確定施用是否與不可耐受的非特異性補(bǔ)體活化相關(guān)。在施用免疫球蛋白制劑前數(shù)小時(shí)，向這些動(dòng)物施用對(duì)照劑量的0.9％nacl。通過將壓力導(dǎo)管經(jīng)由右股動(dòng)脈插入下腹主動(dòng)脈中來確定血壓。通過遙測術(shù)傳送了結(jié)果。施用igm制劑(15ml/kg/日)對(duì)動(dòng)脈血壓(收縮壓和舒張壓的平均值)僅有微小的影響。在每次輸注后長達(dá)4小時(shí)，與預(yù)先測試的值的差異不超過4mmhg?？梢哉J(rèn)為這些差異在生物學(xué)上不相關(guān)。表12a施用igm制劑后的c3a水平[ng/ml]表12b施用參照制劑pentaglobin后的c3a水平[ng/ml]在注射后采集的血漿樣品中確定了c3a水平，以作為補(bǔ)體途徑的非特異性活化的標(biāo)志物。施用igm制劑(15ml/kg體重)僅使c3a水平[ng/ml]略微升高，且該c3a水平甚至低于施用具有等量igm的市售參照制劑pentaglobin后的c3a水平。血樣采集在治療后約6小時(shí)進(jìn)行。沒有明顯的毒理學(xué)結(jié)果可以歸因于igm制劑，而且沒有在使用pentaglobin時(shí)未觀察到的相關(guān)變化。由于pentaglobin的安全性已在多年臨床實(shí)踐中得到充分確認(rèn)，因此可以合理斷定，這些變化不具有任何臨床相關(guān)性。在24位健康男性和女性志愿者中，在人i期研究中也證實(shí)了igm制劑的良好耐受性和安全性。在以0.5ml/分鐘輸注了91mg～274mgigm制劑/kg體重/日后，施用后的前4個(gè)小時(shí)內(nèi)的平均收縮血壓僅下降了約9％(11.9mmhg)。這與安慰劑0.9％nacl溶液的值(9.4％，11.7mmhg)在相同的范圍內(nèi)。沒有記錄到嚴(yán)重的不良事件，而且所有的非嚴(yán)重不良事件都是自約束的。此外，如pct測定所示，沒有傳染原傳播的證據(jù)。應(yīng)注意的是，由于免疫原性和獲自人血漿的igm制劑中的預(yù)先形成的gal抗體，用相關(guān)疾病的動(dòng)物模型進(jìn)行的功效研究的有效性有限。然而，鑒于pentaglobin在疾病治療中的應(yīng)用的相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)知識(shí)和按照本發(fā)明的方法制備的igm制劑的抗細(xì)菌抗體效價(jià)(如實(shí)施例7所示)，可以斷定該igm制劑具有臨床功效。實(shí)施例11抗體制劑的fc部分的功能完整性使用目前的《歐洲藥典》方法(2.7.9“用于免疫球蛋白的fc功能的測試”，《歐洲藥典》，當(dāng)前版本，2011年4月)，按照針對(duì)igg制劑的歐洲準(zhǔn)則ichs6(cpmp/ich/302/95)(對(duì)源自生物技術(shù)的藥品的臨床前安全性評(píng)估的準(zhǔn)則的注釋)，分析了用本文所述的方法制備的抗體制劑中的抗體的fc部分的功能完整性。歐洲藥典的針對(duì)免疫球蛋白的專論(01/2005:20709)提出了針對(duì)免疫球蛋白fc功能的基于風(fēng)疹抗原的測試。特別而言，對(duì)經(jīng)鞣酸處理的o型人血紅細(xì)胞加載風(fēng)疹病毒抗原。將特定體積的抗體制劑與抗原包被的血細(xì)胞一起溫育。通過添加豚鼠補(bǔ)體來啟動(dòng)補(bǔ)體引發(fā)的血細(xì)胞溶解。通過541納米處的吸收值隨時(shí)間的變化，測量了隨后的溶血?jiǎng)恿W(xué)。使用單位時(shí)間內(nèi)的吸收值最大變化來進(jìn)行評(píng)估。使用人免疫球蛋白生物參照制劑(brp批次號(hào)3)作為對(duì)比。在7批含igm的抗體制劑中確定了抗體分子的fc部分的活性，而且在所有批次中，該活性均在生物參照制劑(brp)的活性的96.5％至103.3％之間，從而證明了含igm的抗體制劑的功能性。當(dāng)前第1頁12