本發(fā)明設計醫(yī)藥領域，特別涉及單寧酸、該水解產(chǎn)物或衍生物的一種或幾種組合作為預防和治療血栓的用途。

背景技術：

血栓形成即血液成分在人體局部血管內(nèi)的異常凝集，可以發(fā)生在動脈，也可以發(fā)生在靜脈內(nèi)。動脈血栓形成是造成90％以上的心肌梗死，80％腦卒中的主要原因，動脈栓塞性心血管疾病一直是發(fā)達國家首位的死亡原因；深靜脈血栓和肺栓塞統(tǒng)稱靜脈血栓栓塞病，是發(fā)達國家繼心梗和腦卒中后的第三位的心血管相關性疾病的死亡原因。動脈血栓和靜脈血栓發(fā)生的病理生理基礎不同，充分理解和掌握這種不同，是臨床成功處置血栓性疾病的關鍵。從廣義角度來說，動脈血栓是由于在粥樣斑塊破裂部位富含血小板血栓形成，阻斷血流，造成供血不足所致。對于急性動脈血栓的處置主要是應用抗栓藥物減緩已有血栓的繼續(xù)進展并減少新的血栓形成，此類藥物主要針對的靶點是參與血小板活化和聚集的分子。應用溶栓藥物降解纖維蛋白，再通血管，也是動脈血栓治療的重要措施，但此類藥物的療效主要取決于是否在合理的時間窗內(nèi)應用。

人們對于血小板參與血栓形成的機理的認識有了顯著的提高，但尋找“理想的抗栓藥物”的努力仍在繼續(xù)。理想的抗栓藥物應具備如下特點：首先，該藥物應能抑制病理性的血栓形成，同時不影響正常的止血過程，不會造成出血；半衰期長，無需反復連續(xù)給藥；臨床應用方便，口服吸收良好；治療窗寬，沒有臨床副作用或免疫原性，只需簡單的監(jiān)測；最后，如果一種藥物可以滿足所有要求，它的費用還不應太高。

目前，抗血小板藥主要分4類：(1)影響花生四烯酸代謝的藥物，如阿司匹林；(2)增高環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平的藥物，如西洛他唑等；(3)初級受體拮抗劑：ADP受體拮抗劑、凝血酶受體拮抗劑，如氯吡格雷等；(4)纖維蛋白原受體拮抗劑，如替羅非班、埃替非班、阿昔單抗等。臨床廣泛使用的經(jīng)典抗栓藥物如阿司匹林、噻氯吡啶等，可相應地抑制血小板活化過程中，由血栓烷A2和ADP介導的單一步驟，具有預防血栓形成的作用，但治療作用有限。然而，血小板通過由許多不同的活化途徑組成的復雜網(wǎng)絡而活化，因此單一阻斷該復雜通路中的某一條，并不能完全阻斷血小板聚集。無論血小板活化的最初途徑是通過何種方式觸發(fā)的，血小板聚集的最終共同通路都是活化血小板表面暴露出膜糖蛋白GPIIb/IIIa，并和纖維蛋白原結合。因此，阻斷GPIIb/IIIa形成是開發(fā)抗血栓藥物的一個非常有吸引力的選擇。然而，此類抗栓藥物具有引起臨床出血的危險。最初的血小板粘附，依賴于血小板GPIb/IX/V復合物通過VWF的橋接作用粘附到內(nèi)皮下基質(zhì)，特別是在高剪切力條件下。因此可以基于新的防止血栓形成的策略，開發(fā)新的安全有效的抗血栓藥物，不僅可以保障人類健康、降低社會醫(yī)療成本，而且可以產(chǎn)生良好的經(jīng)濟效益。

多年來，人們對抗血小板、抗血栓機制的研究及其藥物開發(fā)進行了不懈的努力，并有效的應用于血栓性心腦血管疾病的預防、干預和治療，但仍受到療效差和副作用大的限制，特別是出血并發(fā)癥。因此，尋找和開發(fā)新型安全有效的抗血小板藥物仍然是目前的熱點和關鍵問題。目前臨床所用的抗血小板及抗凝藥物作用于血小板活化的不同通路及血栓形成的各個階段，但也帶來了一定的出血風險，限制了其廣泛應用。血小板的質(zhì)膜與大多數(shù)真核細胞一樣，具有磷脂分布不對稱的特點。磷脂酰膽堿(PC)和鞘磷脂(sphingomyelin)主要分布在膜外葉，而腦磷脂(PE)和磷脂酰絲氨酸(PS)則分布在膜內(nèi)葉。質(zhì)膜的不對稱性通常由翻轉酶(flippases)和氨基磷脂特異性移位酶(floppases)維持。在特定刺激下，比如血小板活化過程中，這種不對稱性會遭到破壞，膜內(nèi)葉中的磷脂酰絲氨酸暴露在外膜上，募集并激活一系列凝血因子，促進血液凝固和血栓形成。磷脂拼接酶(PS scramblases)的激活被認為是介導磷脂的雙向跨膜運動的關鍵環(huán)節(jié)。

目前，一種名為TMEM16F的蛋白已被證實具有磷脂拼接酶活性并在血小板膜上表達。而在Scott綜合癥患者(一種先天性出血性疾病)中，TMEM16F突變導致鈣離子激活的脂質(zhì)紊亂及磷脂拼接活性缺陷，患者表現(xiàn)為凝血功能異常。研究人員在TMEM16F基因敲除小鼠模型中發(fā)現(xiàn)其血小板磷脂拼接功能異常，促凝活性下降，并可抵抗頸動脈血栓形成。進一步的電生理研究揭示了TMEM16F具有鈣離子門控離子通道和磷脂拼接酶雙重功能，而后者呈現(xiàn)鈣離子依賴性。同時，TMEM16家族的其他成員，包括TMEM16C、16D、16F、16G、16J，也具有鈣離子依賴的磷脂拼接酶活性。因此，TMEM16F等介導的磷脂拼接有望成為抗血小板及抗栓治療的新靶點。

作為一種小電導鈣激活非選擇性陰離子通道，TMEM16F并不能被常規(guī)的鈣離子激活的非選擇性陽離子通道(CAN)和鈣離子激活的氯離子通道(CaCC)阻斷劑所抑制，包括5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(NPPB)、氟芬那酸(FFA)、尼氟酸(NFA)、N-苯基蒽酸(NPC)和SKF96365。而已知可有效阻斷TMEM16F的物質(zhì)則有釕紅(Ru-Red)、2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯(2APB)、鎘離子、釓離子和單寧酸。

單寧酸作為唯一的天然低毒物質(zhì)，是一種歷史悠久的藥物，曾被用于解毒、收斂、抑菌及工業(yè)生產(chǎn)；單寧酸廣泛存在于咖啡、紅酒、綠茶等飲料中，過量食用可能引起消化道刺激和缺鐵性貧血。最新研究發(fā)現(xiàn)，單寧酸具有天然抗氧化活性，并能抑制平滑肌增生、遷移、收縮，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化、抑制腫瘤生長等效應。大量的臨床觀察也證實了飲用富含單寧酸的咖啡、紅酒和綠茶能夠顯著降低心血管疾病風險。然而，單寧酸在血小板和血栓性疾病中的作用國內(nèi)外尚無報道。

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種單寧酸或其衍生物、水解物、溶劑化物、水合物在制備抗血栓藥物中的應用，該藥物療效顯著、成本低?；瘜W式如下：式(Ⅰ)為五倍子丹寧(或單寧酸，鞣質(zhì)，TANNIC ACID，Tanninum；)，式(Ⅱ)為Gallotannin 23(或1,3,6-三-O-沒食子酰葡萄糖，1-酰-3，6-六羥基聯(lián)苯二甲酰基葡糖，1,2,6-Trigalloyl glucose)，是單寧酸水解化合物，式(Ⅲ)為五倍子丹寧(紅色)(或Gallotannin(red-colored))，是單寧酸聚合物。

進一步的，所述抗血栓藥物為抗血小板聚集的藥物。

進一步的，所述抗血栓藥物為抗血小板活化的藥物。

進一步的，所述藥物中還包括藥學可接受的載體、輔劑或媒介物。

進一步的，所述藥物劑型為片劑或注射劑。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明提供了單寧酸、單寧酸水解產(chǎn)物、單寧酸衍生物在制備抑制血小板活化和/或聚集的藥物中的應用，有效抑制TMEM16、抑制鈣離子通道和質(zhì)膜外翻的活性。單寧酸作為一種天然化合物，在低濃度時即可明顯抑制血小板磷脂拼接、活化和聚集，發(fā)揮顯著的抗血小板和抗血栓作用，同時并不增加出血風險；單寧酸可由植物提取或工業(yè)合成，制造成本低，生產(chǎn)技術成熟，理化性質(zhì)穩(wěn)定，儲存條件簡易，并兼有抗動脈粥樣硬化、靜脈血栓、心肌梗塞或腦卒中的作用，作為一種新型抗血小板藥物開發(fā)，應用前景廣闊，具有巨大的市場潛力與社會價值。

上述說明僅是本發(fā)明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以下以本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。

附圖說明

圖1中的A、B圖示了與空白對照組相比，單寧酸顯著抑制膠原蛋白相關肽(CRP，2μg/ml)刺激的血小板聚集；C、D圖示了與空白對照組相比，單寧酸顯著抑制凝血酶(thrombin，0.1U/ml)刺激的血小板聚集；

圖2中的A、B圖示了與空白對照組相比，單寧酸對CRP(2μg/ml)刺激的血小板選擇素(P-selectin)表達有顯著抑制作用；C、D圖示了與空白對照組相比，單寧酸對thrombin(0.1U/ml)刺激的P-selectin表達有顯著抑制作用；

圖3中的A、B圖示了與空白對照組相比，單寧酸對CRP(2μg/ml)刺激的纖維蛋白原結合有顯著抑制作用；C、D圖示了與空白對照組相比，單寧酸對thrombin(0.1U/ml)刺激的纖維蛋白原(Fibrinogen)結合有顯著抑制作用。

圖4中的A圖示了與空白對照組相比，激光損傷小鼠提睪肌小動脈后，血栓大小隨時間變化的曲線；B圖示了檢測時間內(nèi)，兩組血栓總體面積的對比；C圖示了檢測時間內(nèi)，兩組最大血栓面積的對比；D圖示了兩組峰值血栓的圖像。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例一

單寧酸對離體血小板聚集的抑制作用，具體如下：

(1)制取洗滌血小板

20％檸檬酸-葡萄糖溶液(ACD，pH4.4)(配方：檸檬酸三鈉65mM，檸檬酸70mM,葡萄糖100mM)抗凝取健康志愿者靜脈血，900r/min離心20min制取富含血小板的血漿(PRP)，PRP過已用臺氏液(Tyrode＇s buffer)洗滌平衡過的瓊脂糖凝膠sepharose2BTM柱子，從柱下端接取實驗用洗滌血小板。血小板記數(shù)，用Tyrode＇s buffer調(diào)節(jié)血小板濃度至250×10⁶ml^-1。

(2)CRP刺激的血小板聚集的測定

血小板聚集儀(CHRONO-LOG)于實驗前30min開機預熱。取4只血小板聚集儀(CHRONO-LOG)專用比色杯(CHRONO-LOG，型號P/N312)，分別加入250μL上述制取的洗滌血小板，洗滌血小板中分別加入1μL濃度為10、30和50μM的單寧酸溶液(生理鹽水作為溶劑)以及1μL生理鹽水(0μM，空白對照組)，孵育15分鐘，與膠原蛋白相關肽(collagen related peptide，CRP，2μg/ml)刺激下用血小板聚集儀測量血小板聚積率，結果見附圖1中的A、B，與空白對照組(生理鹽水組)比較，單寧酸溶液在濃度分別為30μM和50μM時顯著抑制CRP(2μg/ml)刺激的血小板聚集。

(3)凝血酶(thrombin)刺激的血小板聚集的測定

血小板聚集儀(CHRONO-LOG)于實驗前30min開機預熱。取4只血小板聚集儀(CHRONO-LOG)專用比色杯(CHRONO-LOG，型號P/N312)，分別加入250μL以上制取的洗滌血小板，洗滌血小板中分別加入1μL濃度為10、30和50μM的單寧酸溶液(生理鹽水作為溶劑)以及1μL生理鹽水(0μM，空白對照組)，孵育15分鐘，于凝血酶(thrombin，0.1U/ml)刺激下用血小板聚集儀測量血小板聚積率，結果見附圖1中的C、D，與空白對照組(生理鹽水組)比較，單寧酸溶液在濃度分別為30μM和50μM時顯著抑制thrombin(0.1U/ml)刺激的血小板聚集。

從附圖1中可以看出，與空白對照組比較，**P值<0.01，***P值<0.001，****P值<0.001，具有顯著統(tǒng)計學差異。

實施例二

單寧酸對離體血小板活化的抑制作用，具體如下：

(1)制取洗滌血小板

20％ACD(pH4.4)(配方：檸檬酸三鈉65mM，檸檬酸70mM,葡萄糖100mM)抗凝取健康志愿者靜脈血，900r/min離心20min制取富含血小板的血漿(PRP)，PRP過已用Tyrode＇s buffer洗滌平衡過的sepharose2BTM凝膠柱子，從柱下端接取實驗用洗滌血小板，血小板記數(shù)，用Tyrode＇s buffer調(diào)節(jié)血小板濃度至250×10⁶ml^-1。

(2)測P-selectin表達實驗

4支上樣管中分別加入上述制取的洗滌血小板100μL，洗滌血小板中分別加入1μL濃度為10、30和50μM的單寧酸溶液(生理鹽水作為溶劑)以及1μL生理鹽水(空白對照組)，在加入熒光PE-P-selectin抗體標記血小板的條件下，37℃孵育10分鐘，再用凝血酶(thrombin，0.1U/mL)或膠原相關肽(Collagen-Related Peptide，CRP，2μg/ml)刺激并37℃孵育10分鐘；隨后在流式細胞儀下觀察P-selectin表達。結果見附圖2中的A、B，與空白對照組(生理鹽水)相比，單寧酸溶液在濃度為10μM、30μM和50μM時對CRP(2μg/ml)刺激的P-selectin表達有顯著的抑制作用；附圖2的C、D中，與空白對照組(生理鹽水)相比，單寧酸溶液在濃度為10μM、30μM和50μM時對thrombin(0.1U/ml)刺激的P-selectin表達有顯著的抑制作用。

從附圖2中可以看出，與空白對照組比較，**P值<0.01，***P值<0.001，****P值<0.001，具有顯著統(tǒng)計學差異。

(3)測Pac-1結合實驗

4支上樣管中分別加入上述制取的洗滌血小板100μL，洗滌血小板中分別加入1μL濃度為10、30和50μM的單寧酸溶液(生理鹽水作為溶劑)以及1μL生理鹽水(空白對照組)，在加入熒光PE-P-selectin抗體標記血小板的條件下，37℃孵育10分鐘，再用凝血酶(thrombin，0.1U/mL)或膠原相關肽(Collagen-Related Peptide，CRP，2μg/ml)刺激并37℃孵育10分鐘；隨后在流式細胞儀下觀察Pac-1結合。結果見圖3的A、B，與空白對照組(生理鹽水)相比，單寧酸溶液在濃度為10μM、30μM和50μM時對CRP(2μg/ml)刺激的纖維蛋白原(Fibrinogen)結合有顯著的抑制作用；圖3的C、D中，與空白對照組(生理鹽水)相比，單寧酸溶液在濃度為10μM、30μM和50μM時對thrombin(0.1U/ml)刺激的Fibrinogen結合有顯著的抑制作用。

從附圖3中可以看出，與空白對照組比較，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.001。

實施例三

單寧酸對激光誘導小鼠提睪肌動脈血栓的影響，具體如下：

給野生型小鼠腹腔注射單寧酸(7.5mg/kg)以及等體積生理鹽水(空白對照組)，半小時后麻醉，靜脈注射DIOC6染料，以激光脈沖損傷游離的提睪肌動脈，在intravital顯微鏡下觀察記錄血栓形成情況。結果見圖4，A顯示血栓大小隨時間變化的曲線，D為形成的最大血栓的顯微放大圖，結果均表明與空白對照組相比，單寧酸在劑量為7.5mg/kg(腹腔注射)時對激光誘導小鼠提睪肌動脈血栓有明顯的抑制作用。圖4的B、C表現(xiàn)為單寧酸給藥組血栓的總體積、峰值體積均小于空白對照組，從附圖4的B、C中可以看出，*P值<0.05,具有顯著統(tǒng)計學差異。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發(fā)明的保護范圍。