本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗用稀釋液。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起豬的一種高度接觸性傳染病，不同年齡、品種和性別的豬均可感染，該病以母豬繁殖障礙、仔豬呼吸道癥狀、免疫抑制、高感染率、高死亡率為特征的一種高致病性疫病。該病已給全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
為了有效地控制豬繁殖與呼吸綜合征，國內(nèi)已開發(fā)多種用于預(yù)防PRRS的疫苗。在PRRS活疫苗研制中，疫苗毒株、病毒培養(yǎng)條件和免疫增強(qiáng)劑是研發(fā)有效疫苗的關(guān)鍵，其中，添加免疫增強(qiáng)劑是提高疫苗效力的有效途徑。疫苗稀釋劑是指用于對(duì)疫苗進(jìn)行稀釋并用于免疫的試劑，不僅可以對(duì)疫苗進(jìn)行稀釋，還可以對(duì)疫苗有保護(hù)作用和提高疫苗的免疫效果。
PRRS活疫苗在使用時(shí)需要用疫苗稀釋劑進(jìn)行稀釋，目前通常選用注射用水或生理鹽水，但這樣稀釋出的疫苗，免疫效價(jià)整齊度不高，不同批次疫苗間的差異較大，且接種發(fā)病豬后存在應(yīng)激反應(yīng)和過敏反應(yīng)，大大降低了PRRS活疫苗的免疫效果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗用稀釋液，該稀釋液可有效減少不同批次疫苗間的差異，提高疫苗抗體效價(jià)整齊度，減少接種發(fā)病豬的應(yīng)激反應(yīng)和過敏反應(yīng)。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明包括磷酸鹽緩沖液以及溶解于磷酸鹽緩沖液的中藥多糖組分，其中每1000ml PH=7的磷酸鹽緩沖液中包含以下中藥多糖組分：桑葉多糖1-8g、云芝多糖0.1-5g、地黃多糖1-5g和胸腺五肽0.1-5g。
進(jìn)一步的，作為優(yōu)選本發(fā)明每1000ml PH=7的磷酸鹽緩沖液中包含以下中藥多糖組分：桑葉多糖2-6g、云芝多糖0.5-2g、地黃多糖1-3g和胸腺五肽0.5-1g。
其中，本發(fā)明中所述桑葉多糖的制備包括以下步驟：
（1）將桑葉粉碎后過70-100目篩，得桑葉粉末，置于干燥環(huán)境中貯存?zhèn)溆茫?/p>
（2）將步驟（1）中所得桑葉粉末按料液比1:20-50g/ml加入75-85℃水中浸提100-120min，每間隔20-30min攪拌一次；
（3）對(duì)步驟（2）中浸提完畢的料液進(jìn)行過濾，收集濾液；對(duì)所得濾液進(jìn)行減壓濃縮得濃縮液，減壓濃縮條件為：溫度50-60℃，轉(zhuǎn)速50r/min,真空度600-700mmHg；
（4）向步驟（3）中所得濃縮液中加入無水乙醇，于4℃冰箱中醇沉20-24h后，以5000-6000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15-20min，收集不溶物；
（5）利用無水乙醚對(duì)步驟（4）中所得不溶物浸洗5-8次，再加入蒸餾水，離心，收集澄清液；
（6）對(duì)步驟（5）中所得澄清液進(jìn)行真空冷凍干燥，得桑葉多糖。
本發(fā)明中所述云芝多糖的制備包括以下步驟：
a. 將干燥的云芝碎片置于90-100℃水中煮提9-10h，過濾，收集濾液；
b．將步驟a中所得濾液濃縮至原體積的1/2，再加入3-4倍體積的95%乙醇，置于25-27℃環(huán)境中靜置沉淀20-24h，得沉淀液；
c．將步驟b中所得沉淀液3000-4000r/min的轉(zhuǎn)速離心15-20min，將所得沉淀物置于常溫下干燥，即得云芝多糖。
本發(fā)明中所述地黃多糖的制備包括以下步驟：
A．稱取地黃，按料液比1：30-40g/ml加入蒸餾水，加熱至90-110℃，浸提2-3h，過濾，收集濾液；
B．將步驟A中所得濾液濃縮至原體積的1/3-1/2，用sevag試劑法除去蛋白，上清液加氯仿離心，水層加80%-90%乙醇沉淀，沉淀物分別用丙酮和乙醇洗滌2 次，真空干燥得地黃多糖。
本發(fā)明中所述pH=7的磷酸鹽緩沖液的制備方法如下：
d．稱取下列原料組分：氯化鈉6-10g、氯化鉀0.05-0.5g、磷酸氫二鈉1-1.2g、磷酸二氫鉀0.05-0.5g、氯化鈣0.05-0.2g和六水氯化鎂0.05-0.2g，混合均勻備用；
e．向步驟d中所得原料組分的混合物中加入1000mL的雙蒸水，充分溶解后，在116℃條件下高壓滅菌30min，即得pH=7的磷酸鹽緩沖液。
中藥多糖是中藥活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖復(fù)合物在生物體內(nèi)不僅是作為能量資源和構(gòu)成材料，更重要的是它存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動(dòng)。多糖類物質(zhì)是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化的能力。本發(fā)明所采用胸腺五肽購于浙江華爾成生物藥業(yè)股份有限公司。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明所提供的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗用稀釋液包括配比科學(xué)合理的多糖組分，不僅可以降低疫苗批間差異性，提高整體免疫水平，還可以提高疫苗的免疫效果，延長疫苗保護(hù)期。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體說明，本發(fā)明中所述實(shí)施例僅用于說明解釋本發(fā)明而不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。本發(fā)明中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
實(shí)施例1:
1、制備桑葉多糖，包括以下步驟：
（1）將桑葉粉碎后過70目篩，得桑葉粉末，置于干燥環(huán)境中貯存?zhèn)溆茫?/p>
（2）將步驟（1）中所得桑葉粉末按料液比1:20g/ml加入75℃水中浸提120min，每間隔20min攪拌一次；
（3）對(duì)步驟（2）中浸提完畢的料液進(jìn)行過濾，收集濾液；對(duì)所得濾液進(jìn)行減壓濃縮得濃縮液，減壓濃縮條件為：溫度50℃，轉(zhuǎn)速50r/min，真空度600mmHg；
（4）向步驟（3）中所得濃縮液中加入無水乙醇，于4℃冰箱中醇沉20后，以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，收集不溶物；
（5）利用無水乙醚對(duì)步驟（4）中所得不溶物浸洗5次，再加入蒸餾水，離心，收集澄清液；
（6）對(duì)步驟（5）中所得澄清液進(jìn)行真空冷凍干燥，得桑葉多糖。
2、制備云芝多糖的制備包括以下步驟：
a. 將干燥的云芝碎片置于90℃水中煮提10h，過濾，收集濾液；
b．將步驟a中所得濾液濃縮至原體積的1/2，再加入3倍體積的95%乙醇，置于25℃環(huán)境中靜置沉淀20h，得沉淀液；
c．將步驟b中所得沉淀液3000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，將所得沉淀物置于常溫下干燥，即得云芝多糖。
3、制備地黃多糖的制備包括以下步驟：
A．稱取地黃，按料液比1：30g/ml加入蒸餾水，加熱至90℃，浸提3h，過濾，收集濾液；
B．將步驟A中所得濾液濃縮至原體積的1/3，用sevag試劑法除去蛋白，上清液加氯仿離心，水層加80%乙醇沉淀，沉淀物分別用丙酮和乙醇洗滌2 次，真空干燥得地黃多糖。
4、配制pH=7的磷酸鹽緩沖液：
d．稱取下列原料組分：氯化鈉6g、氯化鉀0.05g、磷酸氫二鈉1g、磷酸二氫鉀0.05g、氯化鈣0.05g和六水氯化鎂0.05g，混合均勻備用；
e．向步驟d中所得原料組分的混合物中加入1000mL的雙蒸水，充分溶解后，在116℃條件下高壓滅菌30min，即得pH=7的磷酸鹽緩沖液。
5、制備稀釋液
f．稱取中藥多糖組分：桑葉多糖2g、云芝多糖0.5g、地黃多糖1g和胸腺五肽0.5g；
g．將步驟f中所稱取的中藥多糖組分依次加入1000ml pH=7的磷酸鹽緩沖液中，振蕩水化，過濾除菌，即得豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗用稀釋液。
實(shí)施例2：
1、制備桑葉多糖，包括以下步驟：
（1）將桑葉粉碎后過100目篩，得桑葉粉末，置于干燥環(huán)境中貯存?zhèn)溆茫?/p>
（2）將步驟（1）中所得桑葉粉末按料液比1:50g/ml加入85℃水中浸提100min，每間隔30min攪拌一次；
（3）對(duì)步驟（2）中浸提完畢的料液進(jìn)行過濾，收集濾液；對(duì)所得濾液進(jìn)行減壓濃縮得濃縮液，減壓濃縮條件為：溫度60℃，轉(zhuǎn)速50r/min，真空度700mmHg；
（4）向步驟（3）中所得濃縮液中加入無水乙醇,于4℃冰箱中醇沉24h后，以6000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，收集不溶物；
（5）利用無水乙醚對(duì)步驟（4）中所得不溶物浸洗8次，再加入蒸餾水，離心，收集澄清液；
（6）對(duì)步驟（5）中所得澄清液進(jìn)行真空冷凍干燥，得桑葉多糖。
2、制備云芝多糖的制備包括以下步驟：
a. 將干燥的云芝碎片置于100℃水中煮提9h，過濾，收集濾液；
b．將步驟a中所得濾液濃縮至原體積的1/2，再加入4倍體積的95%乙醇，置于25-27℃環(huán)境中靜置沉淀24h，得沉淀液；
c．將步驟b中所得沉淀液4000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，將所得沉淀物置于常溫下干燥，即得云芝多糖。
3、制備地黃多糖的制備包括以下步驟：
A．稱取地黃，按料液比1：40加入蒸餾水，加熱至110℃，浸提2h，過濾，收集濾液；
B．將步驟A中所得濾液濃縮至原體積的1/2，用sevag試劑法除去蛋白，上清液加氯仿離心，水層加90%乙醇沉淀，沉淀物分別用丙酮和乙醇洗滌2 次，真空干燥得地黃多糖。
4、配制pH=7的磷酸鹽緩沖液：
d．稱取下列原料組分：氯化鈉10g、氯化鉀0.5g、磷酸氫二鈉1.2g、磷酸二氫鉀0.5g、氯化鈣0.2g和六水氯化鎂0.2g，混合均勻備用；
e．向步驟d中所得原料組分的混合物中加入1000mL的雙蒸水，充分溶解后，在116℃條件下高壓滅菌30min，即得pH=7的磷酸鹽緩沖液。
5、制備稀釋液
f．稱取中藥多糖組分：桑葉多糖4g、云芝多糖2g、地黃多糖3g和胸腺五肽1g；
g．將步驟f中所稱取的中藥多糖組分依次加入1000ml pH=7的磷酸鹽緩沖液中，振蕩水化，過濾除菌，即得豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗用稀釋液。
實(shí)施例3：
1、制備桑葉多糖，包括以下步驟：
（1）將桑葉粉碎后過85目篩，得桑葉粉末，置于干燥環(huán)境中貯存?zhèn)溆茫?/p>
（2）將步驟（1）中所得桑葉粉末按料液比1:35g/ml加入80℃水中浸提110min，每間隔25min攪拌一次；
（3）對(duì)步驟（2）中浸提完畢的料液進(jìn)行過濾，收集濾液；對(duì)所得濾液進(jìn)行減壓濃縮得濃縮液，減壓濃縮條件為：溫度55℃，轉(zhuǎn)速50r/min，真空度650mmHg；
（4）向步驟（3）中所得濃縮液中加入無水乙醇，于4℃冰箱中醇沉22h后，以550 r/min的轉(zhuǎn)速離心18min，收集不溶物；
（5）利用無水乙醚對(duì)步驟（4）中所得不溶物浸洗6次，再加入蒸餾水，離心，收集澄清液；
（6）對(duì)步驟（5）中所得澄清液進(jìn)行真空冷凍干燥，得桑葉多糖。
2、制備云芝多糖的制備包括以下步驟：
a. 將干燥的云芝碎片置于95℃水中煮提10h，過濾，收集濾液；
b．將步驟a中所得濾液濃縮至原體積的1/2，再加入4倍體積的95%乙醇，置于25℃環(huán)境中靜置沉淀22h，得沉淀液；
c．將步驟b中所得沉淀液3500r/min的轉(zhuǎn)速離心18min，將所得沉淀物置于常溫下干燥，即得云芝多糖。
3、制備地黃多糖的制備包括以下步驟：
A．稱取地黃，按料液液比1：35加入蒸餾水，加熱至100℃，浸提3h，過濾，收集濾液；
B．將步驟A中所得濾液濃縮至原體積的1/2，用sevag試劑法除去蛋白，上清液加氯仿離心，水層加85%乙醇沉淀，沉淀物分別用丙酮和乙醇洗滌2 次，真空干燥得地黃多糖。
4、配制pH=7的磷酸鹽緩沖液：
d．稱取下列原料組分：氯化鈉8g、氯化鉀0.35g、磷酸氫二鈉1.1g、磷酸二氫鉀0.25g、氯化鈣0.12g和六水氯化鎂0.15g，混合均勻備用；
e．向步驟d中所得原料組分的混合物中加入1000mL的雙蒸水，充分溶解后，在116℃條件下高壓滅菌30min，即得pH=7的磷酸鹽緩沖液。
5、制備稀釋液
f．稱取中藥多糖組分：桑葉多糖6g、云芝多糖2g、地黃多糖3g和胸腺五肽5g；
g．將步驟f中所稱取的中藥多糖組分依次加入1000ml pH=7的磷酸鹽緩沖液中，振蕩水化，過濾除菌，即得豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗用稀釋液。
免疫效果對(duì)比試驗(yàn)：
利用本發(fā)明實(shí)施例1至3所制備的3種不同批次（a、b、c）的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗用稀釋液分別將豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗稀釋至1頭份/ml，備用。將50頭28日齡健康斷奶仔豬分為五組，每組10頭，A組注射實(shí)施例1制得的稀釋液稀釋后的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗1.0ml/頭；B組注射實(shí)施例2制得的稀釋液稀釋后的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗1.0ml/頭；C組注射實(shí)施例3制得的稀釋液稀釋后的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗1.0ml/頭；D組注射用pH=7的磷酸鹽緩沖液稀釋后的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗1.0ml/頭；E組作為空白對(duì)照組，注射pH=7的磷酸鹽緩沖液1.0ml/頭。各組均在首免第14 d 、21d、28d、35 d、45d、60d、90d、120d、180d 采血并分離血清，用ELISA方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表1所示。
由表1可以看出，本發(fā)明所制備的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗用稀釋液可以降低疫苗批次間的差異性，提高整體免疫水平，提高豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的免疫效果。另一方面本發(fā)明還可延長疫苗保護(hù)期。
表1 28日齡健康斷奶仔豬免疫試驗(yàn)結(jié)果