本發(fā)明屬于獸用藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蒲地藍消炎顆粒及其制備方法和產(chǎn)品質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù)：
雞傳染性支氣管炎(InfectiousBronchitis，IB)是由冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）的傳染性支氣管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus，IBV)引起的一種高度接觸性傳染病，是集約化養(yǎng)雞場的重要疫病之一。IBV對環(huán)境的抵抗力強，能持久地存在于周圍的環(huán)境中，一旦感染，很難根除。其特征是病雞咳嗽、噴嚏和氣管發(fā)生哆音；雛雞還可以出現(xiàn)流涕，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋減少和質(zhì)量變劣。該病具有高度的傳染性，因病原具有多血清型，而使免疫接種復(fù)雜化。感染雞生長受阻，耗料增加、產(chǎn)蛋和蛋質(zhì)下降、死淘率增加，給養(yǎng)雞業(yè)造成大經(jīng)濟損失。
IB一年四季均可發(fā)生，在寒冷、高熱季節(jié)發(fā)病率更高。炎熱、寒冷、擁擠、通風(fēng)不良及維生素、礦物質(zhì)、微量元素的缺乏都可促使本病的發(fā)生。IBV主要是經(jīng)空氣飛沫和呼吸道傳給易感雞，傳播速度快，往往整棟雞舍同時發(fā)病。此外，IBV還可通過泄殖腔和被污染的飼料、飲水、用具等經(jīng)消化道使易感雞感染發(fā)病。病雞康復(fù)后仍能排毒長達140天之久。
疫苗預(yù)防是減少IB發(fā)病的主要方法，但IB并未得到有效控制。具體原因有：①國內(nèi)流行的血清型傳染性支氣管炎病毒不同于其它國家或地區(qū)；②外來血清型的傳染性支氣管炎病毒不斷傳入我國，使得我國該病毒血清型眾多，難于防治；③國內(nèi)雞群同時有不同型和變異的禽傳染性支氣管炎病毒共同存在和流行。
目前尚無治療IB的特效藥，當(dāng)前對IB采取的防制措施主要有以下四方面：①強化飼養(yǎng)管理，減少人流、物流等因素導(dǎo)致外來病源入侵，如禁止從疫區(qū)或不安全的雞場引種，種蛋用甲醛薰蒸2次才能孵化等；②規(guī)范環(huán)境消毒，交替使用醛類、酚類、酸類、堿類、表面活性劑類、氧化劑類等消毒劑，快速消除養(yǎng)殖環(huán)境中有害病源；③嚴(yán)格執(zhí)行疫苗接種程序，保護雞群不受IBV的侵害；④發(fā)現(xiàn)IBV病情，及時采取應(yīng)對措施；如呼吸型給予化痰平喘藥，腎型給予利尿藥物或補充電解質(zhì)，減少對腎臟的損傷等；⑤經(jīng)驗中藥組方應(yīng)對。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明的目的旨在提供一種蒲地藍消炎顆粒及其制備方法和產(chǎn)品質(zhì)量控制方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
一種蒲地藍消炎顆粒，由下述重量百分比的原料藥制成：蒲公英20-40%、黃芩15-30%、黃連10-20%、苦地丁10-20%、板藍根10-20%、連翹5-10%、石膏5-10%、甘草5-10%。
本發(fā)明處方機理：方中蒲公英清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋之功效，故為君藥；黃芩、黃連、板藍根性味苦寒，清熱解毒，涼血利咽，用以為臣藥，以加強君藥清熱解毒，利咽消腫之功；連翹疏散風(fēng)熱，清熱解毒，散癰消腫；石膏與之配伍，借石膏清氣分熱，阻睪透氣機作用，可使里熱及半表半里之熱盡透發(fā)而解；用甘草補脾益氣，滋咳潤肺，緩急解毒，調(diào)和百藥。諸藥合用，共奏清熱解毒，抗炎消腫，從而扭轉(zhuǎn)病機，截斷病勢，切斷向營血的傳變。本產(chǎn)品可從抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗應(yīng)激等多方位調(diào)節(jié)和治療，從而使熱清、邪散、腫消等諸病得以緩解。
根據(jù)中獸藥理論進行組方后，本發(fā)明處方在于治療雞傳染性支氣管炎之外，具有更強的清熱解毒，抗炎消腫能力，臨床使用更有效。本發(fā)明蒲地藍消炎顆粒呈棕黃色至棕褐色的顆粒；味微苦，主要用于治療和預(yù)防雞傳染性支氣管炎，顆粒劑使用方便，利于吸收。用法用量：混飲，每1L水加蒲地藍消炎顆粒2-8g，連用3-5天。
制備方法，步驟如下：
按比例取各原料藥，分別制成粗粉；將黃芩粗粉加6-8重量倍的60-70%乙醇提取數(shù)次，每次1-2h，濾過，合并濾液，回收乙醇并濃縮至60℃相對密度1.30-1.32的稠膏，備用；將板藍根粗粉加6-8重量倍的水和占其重量百分比2-4%的復(fù)合酶，攪勻，加熱至50-70℃溫浸數(shù)次，每次1-2h，濾過，合并濾液，濾液經(jīng)膜分離后得澄清液即板藍根水浸液，備用；剩余其它原料藥粗粉加6-8重量倍的水在沸騰狀態(tài)下連續(xù)逆流式提取0.5-1.5h，濾過，濾液經(jīng)膜分離后得澄清液，加入板藍根水浸液，濃縮成60℃相對密度1.30-1.32的稠膏；與黃芩稠膏混勻，加入輔料，混勻，制成顆粒，干燥，即得蒲地藍消炎顆粒。
所述連續(xù)逆流式提取為藥材與溶劑在浸出容器中沿相反方向運動，連續(xù)而充分地進行接觸提取的一種方法。正向進料、反向進溶劑，物料與溶劑的流動為逆向連續(xù)動態(tài)流動，使藥材和溶媒能保持相對運動，使料液濃度擴散更新持續(xù)作用，進而保證了料液浸出速度快。
較好地，所述復(fù)合酶的重量百分比組成為：纖維素酶20-40%、胰蛋白酶20-40%、淀粉酶10-30%。
較好地，兩處所述膜分離均為超濾分離，材質(zhì)為聚丙烯或聚砜，截留分子量為6萬-10萬。
較好地，所述輔料的重量百分比組成為：蔗糖60-70%、糊精30-40%。
產(chǎn)品質(zhì)量控制方法：采用TLC法對所得蒲地藍消炎顆粒中的蒲公英、黃芩、黃連、苦地丁、板藍根和連翹進行鑒別；水分、粒度、溶化性、裝量和微生物限度檢查均符合《中華人民共和國獸藥典》2010年版二部附錄顆粒劑項下；采用HPLC法測定黃芩苷的含量和黃酮苷類化合物總含量。
有益效果：本發(fā)明方法中，將原料藥破碎成粗粉，有利于有效成分的溶出，比飲片提取縮短提取時間；復(fù)合酶提取溫度低，提取收率高；連續(xù)逆流式提取有諸多優(yōu)點：提取速度快、有效成分提取充分、提取收得率高、溶劑耗量少、藥液濃度高、減少了蒸發(fā)濃縮等后續(xù)處理藝、滾筒內(nèi)藥材粗粉移動速度可調(diào)節(jié)，從而可根據(jù)藥材特點調(diào)節(jié)提取時間的長短、藥材在溫和的動態(tài)環(huán)境下進行提取，加熱溫度較低、有效成分破壞較少，使藥液中雜質(zhì)含量少，屬于連續(xù)式生產(chǎn)，處理能力大?？傮w上，蒲地藍消炎顆粒，符合國家發(fā)布的新獸藥范疇；通過技術(shù)改造，去除了不必要的雜質(zhì)，增加了有效成分含量，利于禽的吸收，從而提高治療療效。此外，本發(fā)明顆粒劑組方合理、吸收率高，可以通過飲水添加，使用方便，通過飲水添加，大大降低了勞動強度，有利于集約化、規(guī)模化養(yǎng)殖。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此。
實施例1
一種蒲地藍消炎顆粒，其由下述重量百分比原料藥制成：蒲公英30%、黃芩20%、黃連10%、苦地丁10%、板藍根10%、連翹10%、石膏5%、甘草5%。
制備方法：按比例取各原料藥，分別制成粗粉；將黃芩粗粉加7重量倍的60v%的乙醇先提取2h，濾過，藥渣再加7重量倍的60v%的乙醇提取1h，濾過，合并兩次提取濾液，回收乙醇并濃縮至60℃相對密度1.31的稠膏，備用；將板藍根粗粉加7重量倍的水和占其重量百分比3%的復(fù)合酶，攪勻，加熱至60℃溫浸2h，濾過，藥渣再加7重量倍的水和占其重量百分比3%的復(fù)合酶，攪勻，加熱至60℃溫浸2h，濾過，合并兩次溫浸濾液，濾液經(jīng)膜分離后得澄清液即板藍根水浸液，備用；剩余其它原料藥粗粉加7重量倍的水在沸騰狀態(tài)下連續(xù)逆流式提取1h，濾過，濾液經(jīng)膜分離后得澄清液，加入板藍根水浸液，濃縮成60℃相對密度1.31的稠膏；與黃芩稠膏混勻，加入輔料，混勻，制成顆粒，干燥，即得蒲地藍消炎顆粒；其中，所述復(fù)合酶的重量百分比組成為：纖維素酶35%、胰蛋白酶35%、淀粉酶30%，纖維素酶的酶活為20000U/g、胰蛋白酶的酶活為4000U/g、淀粉酶的酶活為30000U/g；所述輔料的重量百分比組成為：蔗糖65%、糊精35%；兩處所述膜分離均為超濾分離，材質(zhì)為聚丙烯，截留分子量為8萬。
實施例2
一種蒲地藍消炎顆粒，其由下述重量百分比原料藥制成：蒲公英40%、黃芩15%、黃連10%、苦地丁10%、板藍根10%、連翹5%、石膏5%、甘草5%。
制備方法：按比例取各原料藥，分別制成粗粉；將黃芩粗粉加6重量倍的65v%的乙醇先提取2h，濾過，藥渣再加6重量倍的65v%的乙醇提取1h，濾過，合并兩次提取濾液，回收乙醇并濃縮至60℃相對密度1.30的稠膏，備用；將板藍根粗粉加6重量倍的水和占其重量百分比2%的復(fù)合酶，攪勻，加熱至60℃溫浸2h，濾過，藥渣再加6重量倍的水和占其重量百分比2%的復(fù)合酶，攪勻，加熱至60℃溫浸2h，濾過，合并兩次溫浸濾液，濾液經(jīng)膜分離后得澄清液即板藍根水浸液，備用；剩余其它原料藥粗粉加6重量倍的水在沸騰狀態(tài)下連續(xù)逆流式提取1h，濾過，濾液經(jīng)膜分離后得澄清液，加入板藍根水浸液，濃縮成60℃相對密度1.30的稠膏；與黃芩稠膏混勻，加入輔料，混勻，制成顆粒，干燥，即得蒲地藍消炎顆粒；其中，所述復(fù)合酶的重量百分比組成為：纖維素酶30%、胰蛋白酶40%、淀粉酶30%，纖維素酶的酶活為20000U/g、胰蛋白酶的酶活為4000U/g、淀粉酶的酶活為30000U/g；所述輔料的重量百分比組成為：蔗糖60%、糊精40%；兩處所述膜分離均為超濾分離，材質(zhì)為聚丙烯，截留分子量為6萬。
實施例3
一種蒲地藍消炎顆粒，其由下述重量百分比原料藥制成：蒲公英20%、黃芩20%、黃連15%、苦地丁10%、板藍根10%、連翹10%、石膏10%、甘草5%。
制備方法：按比例取各原料藥，分別制成粗粉；將黃芩粗粉加8重量倍的70v%的乙醇先提取2h，濾過，藥渣再加8重量倍的70v%的乙醇提取1h，濾過，合并兩次提取濾液，回收乙醇并濃縮至60℃相對密度1.32的稠膏，備用；將板藍根粗粉加8重量倍的水和占其重量百分比4%的復(fù)合酶，攪勻，加熱至60℃溫浸2h，濾過，藥渣再加8重量倍的水和占其重量百分比4%的復(fù)合酶，攪勻，加熱至60℃溫浸2h，濾過，合并兩次溫浸濾液，濾液經(jīng)膜分離后得澄清液即板藍根水浸液，備用；剩余其它原料藥粗粉加8重量倍的水在沸騰狀態(tài)下連續(xù)逆流式提取1h，濾過，濾液經(jīng)膜分離后得澄清液，加入板藍根水浸液，濃縮成60℃相對密度1.32的稠膏；與黃芩稠膏混勻，加入輔料，混勻，制成顆粒，干燥，即得蒲地藍消炎顆粒；其中，所述復(fù)合酶的重量百分比組成為：纖維素酶40%、胰蛋白酶40%、淀粉酶20%，纖維素酶的酶活為20000U/g、胰蛋白酶的酶活為4000U/g、淀粉酶的酶活為30000U/g；所述輔料的重量百分比組成為：蔗糖70%、糊精30%；兩處所述膜分離均為超濾分離，材質(zhì)為聚丙烯，截留分子量為10萬。
對照例1
該對照例與實施例1的不同之處在于：僅由蒲公英、黃芩、苦地丁、板藍根四味藥材制成，并且這四味藥材之間的重量比例同實施例1，即蒲公英∶黃芩∶苦地丁∶板藍根=3∶2∶1∶1。
制備方法：同實施例1。
產(chǎn)品質(zhì)量控制例1
性狀 本品為棕黃色至棕褐色的顆粒；味微苦。
鑒別
（1）為方中蒲公英的薄層色譜鑒別：
供試品溶液的制備：取本品5.0g，研細，加甲醇30ml，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30ml使溶解，濾過，濾液用三氯甲烷振搖提取3次，每次15ml，棄去三氯甲烷液，水層用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣用甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。
對照品溶液的制備：取咖啡酸對照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。
陰性溶液的制備：按照處方藥材比例與制法，制備缺蒲公英藥材的陰性樣品，同供試品溶液制法操作，作為陰性對照溶液。
固定相：硅膠G薄層板。
展開劑：醋酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5，體積比）。
點樣量：5-10μl。
展開距離：8-10cm。
檢視：展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。
結(jié)論：實施例1~3供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點，缺蒲公英陰性樣品色譜在相應(yīng)的位置上無干擾。
（2）為方中黃芩的薄層色譜鑒別：
供試品溶液的制備：取本品5.0g，研細，加甲醇40ml，超聲處理20分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10ml微熱使溶解，放冷，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1～2，加乙酸乙酯振搖提取2次，每次15ml，合并提取液，蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液。
對照品溶液的制備：取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。
陰性溶液的制備：按照處方藥材比例與制法，制備缺黃芩藥材的陰性樣品，同供試品溶液制法操作，作為陰性對照溶液。
固定相：硅膠G薄層板
展開劑：乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1，體積比）。
點樣量：5-10μl。
展開距離：8-10cm。
檢視：展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，置日光下檢視。
結(jié)論：實施例1~3供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，缺黃芩陰性樣品色譜在相應(yīng)的位置上無干擾。
（3）為方中黃連的薄層色譜鑒別：
供試品溶液的制備：取本品5.0g，加硅藻土2 g，研細，加甲醇50ml，加熱回流1小時，濾過，濾液，濾液濃縮至2ml，作為供試品溶液。
對照品溶液的制備：取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。
缺黃連陰性溶液的制備：按照處方藥材比例與制法，制備缺連翹的陰性對照樣品，取缺黃連的陰性樣品5.0g，按供試品溶液制備方法，制得缺連翹陰性溶液。
展開條件的選擇：吸取上述三種溶液各5-10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-濃氨試液-甲醇（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5，體積比）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，預(yù)飽和30分鐘，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。
結(jié)論：實施例1~3供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，缺黃連陰性樣品色譜在相應(yīng)的位置上無干擾。
（4）為方中連翹的薄層色譜鑒別：
供試品溶液的制備：取本品5.0g，研細，加水20ml，超聲20分鐘，濾過，濾液，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇5ml使溶解，加在中性氧化鋁柱（100-200目，6g，內(nèi)徑1cm）上，用70v%乙醇50ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。
對照品溶液的制備：取連翹苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。
缺連翹陰性溶液的制備：按照處方藥材比例與制法，制備缺連翹的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法，制得缺連翹陰性溶液。
展開條件的選擇：吸取上述三種溶液各5-10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（5∶1，體積比）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至班點顯色清晰。
結(jié)論：實施例1~3供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，缺連翹陰性樣品色譜在相應(yīng)的位置上無干擾。
（5）為方中苦地丁的薄層色譜鑒別：
供試品溶液的制備：取本品5.0g，加濃氨試液濕潤，加三氯甲烷30ml，放置過夜，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷1ml使溶解，作為供試品溶液。
對照品溶液的制備：取紫堇靈對照品，加甲醇制成每1m1含1mg的溶液，作為對照品溶液。
陰性溶液的制備：按照處方藥材比例與制法，制備缺苦地丁藥材的陰性樣品，同供試品溶液制法操作，作為陰性對照溶液。
固定相：0.4%NaOH溶液制備的硅膠G薄層板。
展開劑：環(huán)己烷-三氯甲烷-甲醇（7∶2∶1，體積比）
點樣量：5-10μl。
展開距離：8-10cm。
檢視：展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，日光下檢視。
結(jié)論：實施例1~3供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，缺苦地丁陰性樣品色譜在相應(yīng)的位置上無干擾。
（6）為方中板藍根的薄層研究
供試品溶液的制備：取本品5.0g，研細，加乙醇20ml，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘渣加稀乙醇1ml溶解，作為供試品溶液。
對照品溶液的制備：取精氨酸對照品，加乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。
陰性溶液的制備：按照處方藥材比例與制法，制備缺板藍根藥材的陰性樣品，同供試品溶液制法操作，作為陰性對照溶液。
固定相：硅膠G薄層板。
展開劑：正丁醇-冰醋酸-水（19∶5∶5，體積比）
點樣量：5-10μl。
展開距離：8-10cm。
檢視：展開，取出，熱風(fēng)吹干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。
結(jié)果：實施例1~3供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照樣品在相應(yīng)的位置上無干擾。
產(chǎn)品質(zhì)量控制例2
按《中國獸藥典》2010版二部附錄顆粒劑要求及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案，對產(chǎn)品進行了性狀、粒度、水分、溶化性、裝量、微生物限度及裝量檢查。結(jié)果見下表1。
產(chǎn)品質(zhì)量控制例3--測定黃芩苷的含量
測定方法定為：
【儀器與試藥】高效液相色譜儀：Agilent Technologies 1260，安捷倫色譜數(shù)據(jù)工作站，紫外可變波長檢測器（安捷倫科技有限公司）。
對照品：黃芩苷，批號：110715-201318，含量為93.3%，購自中國食品藥品檢定研究院。
蒲地藍消炎顆粒：實施例1、實施例2、實施例3的產(chǎn)品。
甲醇、乙腈為色譜純，其它試劑都采用分析純。
【色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗】用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；以0.6％（g/mL）磷酸溶液－甲醇（53∶47，體積比）為流動相；檢測波長為278nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計應(yīng)不低于2000。
【對照品溶液的制備】 取黃芩苷對照品（批號：110715-201318，含量為93.3%，購自中國食品藥品檢定研究院）適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。
【供試品溶液的制備】本品研細，取約3 g，精密稱定，加70%乙醇40 mL，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液置100 mL量瓶中，用70%乙醇分次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。
【測定法】 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
產(chǎn)品含量測定結(jié)果如表2。
動物實驗例
1 材料與方法
1.1 試驗藥物
試驗第1組～試驗第3組：實施例1蒲地藍消炎顆粒高、中、低劑量三個組。
試驗第4組為藥物對照組1：對照例1蒲地藍消炎顆粒。
試驗第5組為藥物對照組2：麻杏石甘散，四川恒通動物制藥有限公司，批號：20160305。
1.2 試驗動物和病毒
1日齡廣西富鳳雞，雄性，購于南寧市良鳳農(nóng)牧有限責(zé)任公司。飼養(yǎng)至15日齡供試驗用。免疫程序為：1日齡時雞馬立克氏病疫苗肌肉注射，7日齡時雞新城疫Ⅳ系疫苗滴鼻點眼，14日齡時雞傳染性法氏囊弱毒苗滴鼻點眼，各疫苗分別按照各自的產(chǎn)品說明書接種免疫即可。飼料為市售雛雞全價飼料，不含抗病毒藥物。
雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）：M41標(biāo)準(zhǔn)毒株，購自中國獸藥監(jiān)察所，批號：AV1511。實驗室測定其EID50為10-6.68/0.2mL。
將M41標(biāo)準(zhǔn)毒株用生理鹽水稀釋濃度為100×EID50，稀釋好的病毒液加青霉素和鏈霉素雙抗至病毒液中青霉素的濃度為100U/mL、鏈霉素的濃度為0.1mg/mL，4℃冰箱過夜，經(jīng)尿囊腔接種于7日齡SPF雞胚，每個雞胚接種0.2mL，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，棄去24h內(nèi)死亡胚，孵至72h，用雞胚尿囊液傳至第3代，用無菌注射器采集雞胚尿囊液于潔凈滅菌平板中，備用。
1.3 試驗方法
1.3.1 試驗動物分組及處理
采用隨機原則分組，將15日齡供試雞210只分為7組，每組30只。其中第1～3組為高、中、低劑量三個組，第4組為藥物對照組1，第5組為藥物對照組2，第6組為感染對照組，第7組為空白對照組。
第1～6組每只雞用100×EID50 IBV第3代雞胚尿囊液滴鼻點眼染毒，0.2mL/只。第7組為空白對照組，不做任何處理。
攻毒后待試驗雞出現(xiàn)精神沉郁，食欲下降，羽毛松亂，怕冷，扎堆，張口呼吸，氣喘，氣管啰音，口腔流粘液，咳嗽，打噴嚏，飲水量增加等雞傳染性支氣管炎臨床癥狀后，按表3所列的用法用量給藥。停藥后對動物的臨床表現(xiàn)進行跟蹤觀察，觀察時間持續(xù)到停藥后第7天。于感染前及觀察結(jié)束后對試驗雞稱體重。
1.3.2 臨床療效的觀察
（1）觀察時間：首次用藥開始觀察，停止給藥后繼續(xù)觀察7天。
（2）臨床癥狀及記錄：試驗期間，每天觀察并記錄雞的臨床表現(xiàn)，如精神、食欲、呼吸道癥狀、口腔是否流粘液，飲水量等。于試驗結(jié)束時解剖試驗雞，觀察記錄肺臟、氣管、支氣管、鼻竇和鼻腔等處的病理變化。
1.3.3 療效評價標(biāo)準(zhǔn)
治愈率：試驗期間，經(jīng)用藥后臨床癥狀消失，精神及采食情況恢復(fù)正常判為治愈。每組治愈雞數(shù)占每組試驗雞數(shù)的百分率為治愈率。
有效率：試驗期間，經(jīng)用藥后臨床癥狀減輕，精神及采食情況改善判為有效。每組有效雞數(shù)占每組試驗雞數(shù)的百分率為有效率。
病毒分離率：于試驗結(jié)束時解剖試驗雞，隨機抽取部分雞的肺臟、氣管及氣管下端分叉部，按現(xiàn)有技術(shù)分離病毒，計算病毒分離率。病毒分離率=分離到病毒的樣本數(shù)/樣本總數(shù)。
1.3.4 療效綜合判定
依據(jù)臨床療效、病理解剖變化等的差異性分析，對該藥物的療效做出綜合評定。
1.4 數(shù)據(jù)分析與處理
采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析與處理。計數(shù)資料采用X2檢驗；計量資料采用t檢驗或方差分析，P ＜0.05為差異顯著；P ＜0.01為差異極顯著。
1.5 結(jié)果與分析
1.5.1 臨床癥狀
試驗雞于攻毒后48 h陸續(xù)發(fā)病，各攻毒組的發(fā)病率均為100%，迅速波及全群，但均無雞只死亡，72 h后開始出現(xiàn)明顯臨床癥狀，病雞主要表現(xiàn)為精神萎靡，不安，喜叫，食欲減退，飲欲增加，扎堆，甩頭，抓鼻，流淚，流涕，部分雞鼻竇腫脹，個別雞出現(xiàn)拉稀現(xiàn)象。夜間能聽到明顯的咳嗽聲和呼吸啰音。
通過給予不同劑量的本發(fā)明實施例1蒲地藍消炎顆粒3天后與感染對照組比較，病情減輕，精神以及食欲好轉(zhuǎn)，夜間觀察咳嗽和啰音減少，其中以蒲地藍消炎顆粒高劑量組最佳。用藥結(jié)束后第一天，觀察各用藥組試驗雞的精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，臨床癥狀明顯減輕，夜間觀察僅有零星咳嗽聲，啰音已消失。給藥后第6天觀察，各用藥組試驗雞的精神狀態(tài)基本恢復(fù)正常，僅有少許的雞出現(xiàn)不同頻率的甩頭現(xiàn)象。
于給藥后第7天，每組隨機抽取15只試驗雞，頸靜脈放血處死，解剖觀察各組試驗雞內(nèi)臟器官的病變。結(jié)果：感染對照組雞口腔和鼻竇中有大量的黏液，有的黏液呈膠凍樣，氣管都有明顯的出血，充血現(xiàn)象；肺部有明顯的充血，出血現(xiàn)象。各治療組試驗雞的解剖病變較陽性對照組的輕。
1.5.2 治療效果
給藥5天后的療效結(jié)果見表4：本發(fā)明實施例1各劑量蒲地藍消炎顆粒的效果要明顯優(yōu)于對照例1的蒲地藍消炎顆粒，其中本發(fā)明實施例1低劑量蒲地藍消炎顆粒的療效與麻杏石甘散基本相當(dāng)，但本發(fā)明實施例1中、高劑量的蒲地藍消炎顆粒的療效明顯優(yōu)于麻杏石甘散。結(jié)果表明，本發(fā)明蒲地藍消炎顆粒對人工感染雞傳染性支氣管炎病治療效果明顯，可用于雞傳染性支氣管炎病的治療。