本發(fā)明涉及生物治療領(lǐng)域，特別涉及一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：間充質(zhì)干細(xì)胞是多能干細(xì)胞的一種，具有多向分化的潛能，在體外誘導(dǎo)的條件下可以分化為肌肉、神經(jīng)、骨、軟骨、脂肪、心肌和類肝組織等多種組織和細(xì)胞。在長(zhǎng)期傳代后仍然具有增殖復(fù)制能力，是一種理想的組織器官工程的種子細(xì)胞。目前在臨床上也有越來(lái)越多的人使用間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于組織器官的修復(fù)和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)。淋巴細(xì)胞(lymphocyte)也稱淋巴球，是白細(xì)胞的一種，由淋巴器官產(chǎn)生，是機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分。淋巴細(xì)胞包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等亞類，分別介導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫、體液免疫和對(duì)腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的殺傷作用等免疫學(xué)功能。由于肝硬化患者體內(nèi)免疫功能亢進(jìn)，間充質(zhì)干細(xì)胞回輸后僅能維持較短時(shí)間，需要頻繁回輸以達(dá)到治療目的，并且在很多情況下并不能控制病情發(fā)展，治療效果有限。因此，研究一種對(duì)肝硬化具有良好療效的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員需要解決的技術(shù)問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明公開(kāi)了一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用，所述干細(xì)胞制劑對(duì)肝硬化有良好的療效。本發(fā)明公開(kāi)了一種干細(xì)胞制劑，包括：間充質(zhì)干細(xì)胞制劑和免疫細(xì)胞制劑；所述間充質(zhì)干細(xì)胞制劑包括：間充質(zhì)干細(xì)胞、白蛋白和溶劑；所述免疫細(xì)胞制劑包括：免疫細(xì)胞和溶劑。在本發(fā)明的一些技術(shù)方案中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的含量為1×105～1×107個(gè)/ml。優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的含量為1×106個(gè)/ml。在本發(fā)明的一些技術(shù)方案中，所述白蛋白含量為1％～8％(w/v)。優(yōu)選地，所述白蛋白的含量為3％(w/v)。在本發(fā)明的一些技術(shù)方案中，所述免疫細(xì)胞的含量為1×105～1×107個(gè)/ml。優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞的含量為5×106個(gè)/ml。優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞為淋巴細(xì)胞。優(yōu)選地，所述溶劑為生理鹽水。本發(fā)明還公開(kāi)了所述干細(xì)胞制劑的制備方法，包括以下步驟：a)、間充質(zhì)干細(xì)胞、白蛋白和溶劑混合，得到所述間充質(zhì)干細(xì)胞制劑；b)、免疫細(xì)胞和溶劑混合，得到所述免疫細(xì)胞制劑。優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞按照以下步驟獲得：c1)、將骨髓進(jìn)行離心分離，得到原代間充質(zhì)干細(xì)胞；c2)、重懸所述原代間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)；c3)、換液除去未貼壁細(xì)胞，加入培養(yǎng)基繼續(xù)對(duì)所述原代間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；c4)、對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化，得到所述間充質(zhì)干細(xì)胞。優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞按照以下步驟獲得：d1)、將臍血進(jìn)行離心分離，取中間白膜層；d2)、將所述白膜層接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；d3)、收集培養(yǎng)的細(xì)胞，得到所述免疫細(xì)胞。本發(fā)明還公開(kāi)了所述干細(xì)胞制劑或所述制備方法制得的干細(xì)胞制劑在制備治療肝硬化藥物中的應(yīng)用。綜上所述，本發(fā)明公開(kāi)了一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用，該干細(xì)胞制劑包括間充質(zhì)干細(xì)胞制劑和免疫細(xì)胞制劑，通過(guò)將間充質(zhì)干細(xì)胞制劑和免疫細(xì)胞制劑進(jìn)行混合回輸，可以誘導(dǎo)患者免疫耐受，從而使間充質(zhì)干細(xì)胞不會(huì)受到免疫排斥，存活時(shí)間更長(zhǎng)，效果維持的時(shí)間也更久，對(duì)肝硬化具有良好的療效。附圖說(shuō)明圖1示1周后實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和對(duì)比例組的細(xì)胞數(shù)；圖2示4周后實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和對(duì)比例組的細(xì)胞數(shù)；圖3示8周后實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和對(duì)比例組的細(xì)胞數(shù)；圖4示1周后實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和對(duì)比例組的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果；圖5示4周后實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和對(duì)比例組的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果；圖6示8周后實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和對(duì)比例組的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開(kāi)了一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用，該干細(xì)胞制劑能誘導(dǎo)患者免疫耐受，對(duì)肝硬化具有良好的療效。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明中所涉及原料均可由市場(chǎng)購(gòu)得。其中，白蛋白購(gòu)買(mǎi)自鄭州萊士。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和干細(xì)胞制劑的制備1、取無(wú)菌條件下抽取的小鼠骨髓10ml，加入等體積的DMEM-LG培養(yǎng)基(購(gòu)買(mǎi)自gibco)稀釋混勻后，1000r/min離心5min，去除上層的脂肪及上清；2、用含10％FBS和1×雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml接種到15cm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移至5％CO2、37℃、飽和濕度為95％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3、培養(yǎng)48h后換液除去未貼壁雜細(xì)胞，此后每隔2～3d換液1次；4、待細(xì)胞數(shù)達(dá)到1×108個(gè)后，將1/10細(xì)胞培養(yǎng)基體積的Hoechst染料溶液(購(gòu)買(mǎi)自江蘇凱基生物)加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，在37℃培養(yǎng)細(xì)胞10～20分鐘。5、棄去上清液，用PBS或合適的緩沖液洗細(xì)胞兩次。加入8ml0.25％(質(zhì)量體積比)的胰酶(購(gòu)買(mǎi)自sigma)消化細(xì)胞；5、待細(xì)胞變圓松動(dòng)后，加入兩倍于胰酶體積的含10％FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基終止消化；6、倒出細(xì)胞懸液，離心棄去上清，生理鹽水清洗2遍，得到用于制備干細(xì)胞制劑的間充質(zhì)干細(xì)胞(間充質(zhì)干細(xì)胞表型鑒定為CD90+＞95％，CD73+＞95％，CD105+＞95％，CD45+＜0.2％，CD34+＜0.2％)；7、用含有3％白蛋白的生理鹽水重懸步驟6制備的間充質(zhì)干細(xì)胞，使細(xì)胞密度為5×106個(gè)/ml，制成干細(xì)胞制劑注射液。實(shí)施例2免疫細(xì)胞的分離培養(yǎng)和免疫細(xì)胞制劑的制備1、取10ml臍血，添加等體積的生理鹽水稀釋，稀釋液添加至Ficoll分離液(按照稀釋后的臍血體積的三分之一添加Ficoll分離液)，700g離心20-30min，升降速降為零，吸取中間白膜層；2、將白膜層用生理鹽水清洗兩遍，對(duì)白膜層的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果加入含有10％FBS、20ng/mlIL-2的1640培養(yǎng)基，調(diào)整接種密度為1×106個(gè)/ml，放入5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3、之后按照細(xì)胞數(shù)量補(bǔ)充含有10％FBS、20ng/mlIL-2的1640培養(yǎng)基，保持細(xì)胞密度在1×106個(gè)/ml；5、收集培養(yǎng)到14天的免疫細(xì)胞(流式鑒定為CD3+和CD56+＞40％)用生理鹽水重懸細(xì)胞密度為5×106個(gè)/ml，總共需要1ml的細(xì)胞懸液。實(shí)施例3動(dòng)物試驗(yàn)將購(gòu)買(mǎi)自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的肝硬化模型的36只昆明小鼠分為三組。組1為治療組，治療組用實(shí)施2制備的免疫細(xì)胞制劑0.2ml每次、多點(diǎn)注射(每次注射0.2ml，是注射5次共1ml)于小鼠的皮下，總共注射1ml。24小時(shí)后通過(guò)尾靜脈注射1ml實(shí)施例1制備的干細(xì)胞制劑，每天注射一次，連續(xù)注射3天。組2為對(duì)照組，對(duì)照組用生理鹽水0.2ml每次、多點(diǎn)注射于小鼠的皮下，總共注射1ml。24小時(shí)后通過(guò)尾靜脈注射1ml生理鹽水，每天注射一次，連續(xù)注射3天。組3為對(duì)比例組，通過(guò)尾靜脈注射實(shí)施例1制備的干細(xì)胞制劑1ml，每天注射一次，連續(xù)注射3天。在治療后1周、4周、8周每組各隨機(jī)選取2只小鼠，抽血通過(guò)Elisa試劑盒檢測(cè)AST、ALT指標(biāo)(試劑盒購(gòu)買(mǎi)自南京金益柏生物科技有限公司)，然后處死取肝部組織制作石蠟切片，熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)Hoechst熒光染料在該部位的細(xì)胞染色情況。1周后細(xì)胞數(shù)見(jiàn)表1、圖1；4周后細(xì)胞數(shù)見(jiàn)表2、圖2；8周后細(xì)胞數(shù)見(jiàn)表3、圖3；1周后血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4、圖4；4周后血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5、圖5；8周后血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6、圖6。表11周后細(xì)胞數(shù)(106)實(shí)驗(yàn)組4.2**##對(duì)照組0對(duì)比例組2.2***示與對(duì)照組相比具有顯著差異(P＜0.05)；**示與對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；#示與對(duì)比例組相比具有顯著差異(P＜0.05)；##示與對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；1周后的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)為4.2×106，而對(duì)照組為0，實(shí)驗(yàn)組明顯多于對(duì)照組和對(duì)比例組，具有極顯著差異(P＜0.01)，說(shuō)明1周后體內(nèi)存留的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)組極顯著大于對(duì)照組。表24周后細(xì)胞數(shù)(106)實(shí)驗(yàn)組2.8**##對(duì)照組0對(duì)比例組0.3***示與對(duì)照組相比具有顯著差異(P＜0.05)；**示與對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；#示與對(duì)比例組相比具有顯著差異(P＜0.05)；##示與對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；4周后的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)為2.8×106，而對(duì)照組為0，實(shí)驗(yàn)組明顯多于對(duì)照組和對(duì)比例組，具有極顯著差異(P＜0.01)，說(shuō)明4周后體內(nèi)存留的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)組極顯著大于對(duì)照組和對(duì)比例組。表38周后細(xì)胞數(shù)(106)實(shí)驗(yàn)組1.5**##對(duì)照組0對(duì)比例組0*示與對(duì)照組相比具有顯著差異(P＜0.05)；**示與對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；#示與對(duì)比例組相比具有顯著差異(P＜0.05)；##示與對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；8周后的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)為1.5×106，而對(duì)照組為0，實(shí)驗(yàn)組明顯多于對(duì)照組和對(duì)比例組，具有極顯著差異(P＜0.01)，說(shuō)明8周后體內(nèi)存留的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)組極顯著大于對(duì)照組和對(duì)比例組。表4*示與對(duì)照組相比具有顯著差異(P＜0.05)；**示與對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；#示與對(duì)比例組相比具有顯著差異(P＜0.05)；##示與對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；ALT和AST是檢測(cè)肝功能的兩項(xiàng)指標(biāo)，數(shù)值的正常范圍在0-40之間，在肝功能受損的情況下數(shù)值會(huì)升高，并且數(shù)值越高，表明肝功能受損越嚴(yán)重。從數(shù)據(jù)中可以得出實(shí)驗(yàn)組的肝功能水平要好于對(duì)照組合對(duì)比例組，而對(duì)比例組又要好于對(duì)照組，且均具有極顯著差異(P＜0.01)。表5*示與對(duì)照組相比具有顯著差異(P＜0.05)；**示與對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；#示與對(duì)比例組相比具有顯著差異(P＜0.05)；##示與對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；從數(shù)據(jù)中可以得出實(shí)驗(yàn)組的肝功能水平要好于對(duì)照組合對(duì)比例組，而對(duì)比例組又要好于對(duì)照組，且均具有極顯著差異(P＜0.01)。表6*示與對(duì)照組相比具有顯著差異(P＜0.05)；**示與對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；#示與對(duì)比例組相比具有顯著差異(P＜0.05)；##示與對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；從數(shù)據(jù)中可以得出實(shí)驗(yàn)組的肝功能水平要好于對(duì)照組合對(duì)比例組，而對(duì)比例組又要好于對(duì)照組，且均具有極顯著差異(P＜0.01)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3