本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物領域，具體涉及一種含辣椒素和索拉非尼的藥物組合物及其應用。

背景技術(shù)：

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅著人類的健康。在中國，由于存在著較為嚴重的乙型肝炎病毒感染等致癌風險因素，肝癌的發(fā)病率和死亡率態(tài)勢尤為嚴峻。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2014年發(fā)布的統(tǒng)計報告，2012年中國肝癌新發(fā)病例數(shù)超過40萬，約占全球新發(fā)病例總數(shù)的55％。肝癌起病隱匿，多數(shù)患者首次確診時已處于中晚期，失去手術(shù)治療的最佳時機。射頻消融、肝動脈化療栓塞術(shù)等局部療法在應對微小轉(zhuǎn)移灶方面亦受到限制。因此，系統(tǒng)化療是臨床上亟需的治療手段。

靶向藥物索拉非尼(sorafinib)是近年來在美國、歐盟和中國等多個國家批準應用于臨床的肝癌和腎癌系統(tǒng)化療藥物。索拉非尼通過雙重機制發(fā)揮抗腫瘤作用：一方面通過抑制腫瘤細胞RAF/MEK/ERK信號傳導通路，直接抑制腫瘤生長；另一方面，它又可通過抑制血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)和血小板衍生生長因子受體(PDGFR)而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接抑制腫瘤細胞的生長。索拉非尼是肝癌分子靶向藥物治療中的一座里程碑式的發(fā)現(xiàn)，在晚期肝癌綜合性治療方案中發(fā)揮著無法替代的治療作用。盡管如此，索拉非尼的臨床療效尚不能令人十分滿意。臨床實踐發(fā)現(xiàn)肝癌對索拉非尼存在不同程度的先天性耐藥，經(jīng)索拉非尼治療的患者只有43％的病例能夠得到短期控制。因此探索能夠增強索拉非尼療效的藥物，特別是天然存在的對人體毒副作用小的藥食同源物質(zhì)，具有十分重要的意義。

CN103933039A公開了索拉非尼和一種天然藥物水飛薊賓的組合物，二者在抑制肝癌細胞生長增殖方面具有協(xié)同作用。CN102836160A公開了索拉非尼和一種化學合成小分子物質(zhì)ABT-263的組合物，二者聯(lián)合用藥在抗腫瘤效果上具有協(xié)同和增效作用。

辣椒是人們廣泛食用的一種蔬菜和調(diào)味品，其辛辣感源于其中所含有的辣椒素類物質(zhì)，包括辣椒素(capsaicin)、二氫辣椒素(dihydrocasaicin)、降二氫辣椒素(nordihydrocapsaicin)等。辣椒素是辣椒素類物質(zhì)中含量最高的組分，約占總量的69％。辣椒素具有許多藥理活性，可用于鎮(zhèn)痛和抗炎等。近年來的研究表明，辣椒素還具有一定的抗腫瘤活性，對肝癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和膀胱癌等惡性腫瘤細胞具有抑制增殖和誘導凋亡的作用。辣椒素的抗腫瘤作用與下列因素有關：增加細胞膜通透性、抑制線粒體呼吸；上調(diào)抗癌基因p53表達和抑制細胞信號轉(zhuǎn)導通路JNK；增加細胞內(nèi)活性氧的含量。

CN104447777A公開了一種辣椒素-喜樹堿類抗癌藥物偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物在體內(nèi)能夠以水解的方式直接釋放辣椒素和喜樹堿類藥物，二者具有協(xié)同的抗腫瘤作用。CN104983900A公開了辣椒提取物與原青花素聯(lián)合使用能夠預防癌癥化療引起的惡心嘔吐，同時起到輔助抑制腫瘤的作用。

目前，尚無將辣椒素與索拉非尼聯(lián)合用藥治療惡性腫瘤的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提出一種含辣椒素和索拉非尼的藥物組合物及其應用，提高了抗腫瘤效果。

技術(shù)方案：為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提出了一種含辣椒素和索拉非尼的藥物組合物，其中，所述藥物組合物中辣椒素與索拉非尼的摩爾比為5:1～10:1。

作為優(yōu)選，所述含辣椒素和索拉非尼的藥物組合物中，辣椒素和索拉非尼的摩爾比為10:1。

其中，所述含辣椒素和索拉非尼的藥物組合物還包括藥學上可接受的載體，所述藥學上可接受的載體可以為本領域技術(shù)人員公知的藥用載體。

本發(fā)明還提出了上述藥物組合物在制備用于治療惡性腫瘤的藥物上的用途。

其中，所述惡性腫瘤為原發(fā)性肝癌和腎癌中的任意一種。

本發(fā)明的藥物組合物可以以藥劑學中常用的各種口服劑型給藥。上述藥劑學上常用的各種口服劑型可以是片劑、膠囊、顆粒劑、口服液等。

另外，還可按照常規(guī)方法將藥物組合物中的單味活性藥物或藥物組合物制成緩控釋制劑，如緩釋片、微丸或控釋片。

藥理學試驗表明，本發(fā)明的含辣椒素和索拉非尼的藥物組合物具有協(xié)同治療原發(fā)性肝癌等惡性腫瘤的功用，所述的惡性腫瘤優(yōu)選為原發(fā)性肝癌和腎癌。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的含辣椒素和索拉非尼的藥用組合物的抗腫瘤作用顯著強于單一藥物，辣椒素和索拉非尼聯(lián)合使用可使藥效產(chǎn)生協(xié)同作用。特別地，當辣椒素與索拉非尼的摩爾比為10:1的時候，二者的協(xié)同作用最好。

附圖說明

圖1索拉非尼聯(lián)合辣椒素對腫瘤細胞增殖的抑制作用

圖2索拉非尼聯(lián)合辣椒素對腫瘤細胞形態(tài)的影響

圖3索拉非尼聯(lián)合辣椒素對腫瘤細胞Caspase 3/7活性的影響

具體實施方式

以下實施例所用的腫瘤細胞株來源如下：肝癌細胞PLC/PRF/5和腎癌細胞OS-RC-2來源于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

藥物與試劑：索拉非尼購自美國Selleck Chemicals公司；辣椒素購自英國Tocris公司。兩種藥物均用二甲基亞砜(DMSO)溶解，于-80℃保存，實驗時稀釋至工作濃度(DMSO濃度<0.5％)。MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)、Hoechst33258、Propidium Iodide(PI)及Caspase 3/7檢測試劑均購自美國ThermoFisher公司。

實施例1索拉非尼與辣椒素對腫瘤細胞半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)的測定。

本實施例采用MTT法測定辣椒素和索拉非尼對肝癌細胞PLC/PRF/5和腎癌細胞OS-RC-2的抑制作用。細胞以5×10⁴/mL的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，培養(yǎng)過夜待細胞貼壁后加入藥物。索拉非尼設置5個藥物濃度，分別是0.3、1、3、10、30μM；辣椒素設置5個藥物濃度，分別是10、30、100、300、1000μM。細胞與藥物溶液在培養(yǎng)箱中孵育72小時后，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃孵育4小時，棄培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，37℃放置1小時，然后用酶標儀在490nm處測定各孔的吸光度(OD)，計算藥物對細胞的抑制率。細胞抑制率計算公式為：抑制率(％)＝(對照組OD值–試驗組OD值)/(對照組OD值–空白組OD值)×100％。

結(jié)果表明，索拉非尼和辣椒素均能劑量依賴性地抑制腫瘤細胞的增殖。索拉非尼對PLC/PRF/5和OS-RC-2細胞的半數(shù)抑制濃度分別為7.6和17.0μM。辣椒素對PLC/PRF/5和OS-RC-2細胞增殖的半數(shù)抑制濃度分別為137.0和169.8μM。

實施例2索拉非尼聯(lián)合辣椒素對腫瘤細胞增殖的抑制作用。

將對數(shù)生長期的PLC/PRF/5和OS-RC-2細胞以5×10⁴/mL的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，培養(yǎng)過夜待細胞貼壁后加入藥物。實驗分組如下：陰性對照組、辣椒素組、索拉非尼組、辣椒素和索拉非尼聯(lián)合給藥組。辣椒素組分別給予10、50、100μM的辣椒素；索拉非尼組給予10μM的索拉非尼；聯(lián)合用藥組按1:1、5:1、10:1的比例同時加入辣椒素和索拉非尼(聯(lián)合用藥組1：辣椒素10μM+索拉非尼10μM；聯(lián)合用藥組2：辣椒素50μM+索拉非尼10μM；聯(lián)合用藥組3：辣椒素100μM+索拉非尼10μM)。細胞與藥物溶液在培養(yǎng)箱中孵育72小時后，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃孵育4小時，棄培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，37℃放置1小時，然后用酶標儀在490nm處測定各孔的吸光度，計算藥物對腫瘤細胞增殖的抑制率。用Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法判定索拉非尼和辣椒素相互作用的類型(拮抗、相加或協(xié)同效應)。用CompuSyn軟件計算藥物聯(lián)合效應指數(shù)(combination index,CI)，當CI值在0.90-1.10范圍內(nèi)時判定為相加作用，當CI值小于0.90時判定為協(xié)同作用，當CI值大于1.1時判定為拮抗作用。

實驗結(jié)果如圖1所示，辣椒素濃度為10μM時不能顯著增強索拉非尼對PLC/PRF/5和OS-RC-2細胞的抑制作用(聯(lián)合用藥組1，p>0.05)，但在50和100μM時則能明顯增強索拉非尼的抗增殖作用(聯(lián)合用藥組2和組3，p<0.01)，提示辣椒素與索拉非尼的摩爾比為5:1～10:1時，藥物組合物的療效可明顯優(yōu)于單一藥物。進一步計算兩種藥物的聯(lián)合效應指數(shù)CI，結(jié)果如下：在PLC/PRF/5細胞，辣椒素與索拉非尼的摩爾比為5:1和10:1時，CI值分別為1.09和0.55，提示前者為相加效應而后者為協(xié)同效應；在OS-RC-2細胞，辣椒素和索拉非尼的摩爾比為5:1和10:1時，CI值分別為0.43和0.32，提示在這兩種比例下藥物的相互作用均為協(xié)同效應，但后者的協(xié)同效應更加明顯。以上結(jié)果表明，辣椒素與索拉非尼的摩爾比在5:1時即可獲得相加或協(xié)同的抗腫瘤效應，當其摩爾比在10:1時對兩種細胞均呈現(xiàn)出協(xié)同的抗腫瘤效應。

實施例3辣椒素聯(lián)合索拉非尼對腫瘤細胞形態(tài)的影響。

將對數(shù)生長期的PLC/PRF/5和OS-RC-2細胞以1×10⁵/mL的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，培養(yǎng)過夜待細胞貼壁后加入藥物。實驗分組如下：陰性對照組、辣椒素組、索拉非尼組、辣椒素和索拉非尼聯(lián)合給藥組。辣椒素組給予100μM辣椒素；索拉非尼組給予10μM索拉非尼；聯(lián)合用藥組同時給予100μM辣椒素和10μM索拉非尼。細胞與藥物在培養(yǎng)箱中孵育24小時后用倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)。

肝癌PLC/PRF/5細胞經(jīng)過不同藥物處理后的照片如圖2A所示：陰性對照組細胞自然鋪展于孔底，外觀柔和飽滿，形態(tài)正常；索拉非尼處理組，細胞皺縮，部分細胞脫壁，胞質(zhì)中黑色顆粒狀物質(zhì)增多并出現(xiàn)空泡，提示細胞在藥物作用下出現(xiàn)凋亡的跡象；辣椒素處理組，細胞中顆粒狀物質(zhì)增加，部分細胞細胞膜有皺縮的現(xiàn)象；辣椒素和索拉非尼聯(lián)合處理組，大量細胞脫壁變圓，部分細胞破碎，提示細胞發(fā)生凋亡。腎癌OS-RC-2細胞經(jīng)藥物處理后形態(tài)的變化類似于PLC/PRF/5細胞。本實驗結(jié)果表明，辣椒素聯(lián)合索拉非尼對腫瘤細胞外觀形態(tài)的影響最大，并提示細胞在藥物的處理下可能發(fā)生了凋亡。

實施例4索拉非尼聯(lián)合辣椒素誘導腫瘤細胞凋亡。

采用Hoechst 33258和PI雙染法檢測索拉非尼、辣椒素及二者聯(lián)用對PLC/PRF/5細胞凋亡的影響。將PLC/PRF/5細胞以5×10⁴/mL的濃度接種于24孔培養(yǎng)板，每孔2mL，培養(yǎng)過夜待細胞貼壁后加入藥物。給藥方案設計如下：辣椒素組給予100μM辣椒素；索拉非尼組給予10μM索拉非尼；聯(lián)合用藥組同時給予100μM辣椒素和10μM索拉非尼。細胞與藥物在培養(yǎng)箱中孵育24小時，收集細胞，分別進行Hoechst 33258和PI染色，然后用免疫熒光顯微鏡觀察，在5個不同的區(qū)域隨機拍照，計數(shù)發(fā)生凋亡的細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算細胞凋亡率。

Hoechst 33258和PI雙染實驗結(jié)果表明，陰性對照組細胞凋亡率為0.41％，辣椒素組細胞凋亡率為4.22％，索拉非尼組細胞凋亡率為9.76％，辣椒素和索拉非尼聯(lián)用組細胞凋亡率為30.58％。聯(lián)合用藥組細胞凋亡率顯著高于索拉非尼組和辣椒素組(p<0.05)。

實施例5辣椒素聯(lián)合索拉非尼對凋亡相關蛋白Caspase 3/7活性的影響

Caspase蛋白級聯(lián)激活能夠直接導致細胞凋亡。本實施例采用熒光顯微鏡檢測辣椒素聯(lián)合索拉非尼對肝癌PLC/PRF/5細胞Caspase 3/7活性的影響。將PLC/PRF/5細胞以2.5×10⁵/mL的濃度接種于24孔培養(yǎng)板，每孔400μL，培養(yǎng)過夜待細胞貼壁后加入藥物。給藥方案設計如下：辣椒素組藥物濃度為100μM；索拉非尼組藥物濃度為10μM；聯(lián)合用藥組同時加入辣椒素和索拉非尼(濃度同上)。細胞與藥物在培養(yǎng)箱中孵育24小時，棄培養(yǎng)基，加入Caspase 3/7檢測試劑CellEvent^TMCaspase-3/7Green Detection Reagent，37℃孵育20分鐘，熒光顯微鏡觀察。Caspase 3/7活化的細胞顯現(xiàn)綠色熒光，每孔隨機取5個視野，計數(shù)并取平均值。

結(jié)果如圖3所示，聯(lián)合用藥組顯現(xiàn)綠色熒光的細胞數(shù)顯著多于索拉非尼或辣椒素單獨用藥組(p<0.05)，提示聯(lián)合用藥可以更加有效的激活PLC/PRF/5細胞中的Caspase 3/7，從而誘導細胞發(fā)生凋亡。