本發(fā)明屬于抗癡呆藥物領(lǐng)域，具體涉及一種法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑在制備易化膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。隨著世界人口進(jìn)入老齡化，AD的發(fā)病率快速上升，幾乎每7秒鐘就有一人患病，預(yù)測(cè)到2050年將增加到9000萬(wàn)人。由于缺乏有效的預(yù)防和治療措施，AD已被列為第四位死亡原因。血管性癡呆(VD)是指由缺血性卒中、出血性卒中和造成記憶、認(rèn)知和行為等腦區(qū)低灌注的腦血管疾病所致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征。我國(guó)血管性癡呆的患病率為1.1％～3.0％，年發(fā)病率在5～9/1000人。帕金森病(PD)為老年期常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，≥65歲人群中的發(fā)病率約2％。帕金森病是一種緩慢發(fā)生的選擇性的中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元喪失和紋狀體多巴胺含量顯著減少，導(dǎo)致錐體外系的一系列癥狀。帕金森病的非運(yùn)動(dòng)障礙癥狀，特別是帕金森病患者中癡呆的發(fā)生率高達(dá)24％～31％，是普通老年人群癡呆發(fā)生率的2～6倍。但是，迄今仍然缺乏療效高、副作用少、長(zhǎng)期使用不產(chǎn)生耐藥性的抗癡呆藥物。

有一些胞內(nèi)蛋白翻譯后需經(jīng)法尼基化修飾，才能結(jié)合于細(xì)胞膜并發(fā)揮其傳導(dǎo)信號(hào)的作用。法尼基化修飾就是在法尼基轉(zhuǎn)移酶的作用下，把法尼基基團(tuán)加到蛋白質(zhì)分子上。法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(farnesyltransferase inhibitors，F(xiàn)TI)是一類(lèi)正在試驗(yàn)中的靶向抗腫瘤藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明提供一種法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(farnesyltransferase inhibitors，F(xiàn)TI)在制備易化膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)方案：法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑在制備易化膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)藥物中的應(yīng)用。

所述法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑為

(1)FTI-276，trifluoroacetate salt(三氟乙酸鹽)

N-[4-[2-(R)-Amino-3-mercaptopropyl]amino-2-phenylbenzoyl]methionine trifluoroacetate salt

經(jīng)驗(yàn)分子式(希爾表示法)C₂₁H₂₇N₃O₃S₂·C₂HF₃O₂，分子量547.61

(2)FTI-277trifluoroacetate salt(三氟乙酸鹽)

N-[4-[2(R)-Amino-3-mercaptopropyl]amino-2-phenylbenzoyl]methionine methyl ester trifluoroacetate salt

經(jīng)驗(yàn)分子式(希爾表示法)C₂₂H₂₉N₃O₃S₂·xC₂HF₃O₂，，分子量447.61(free base basis)

MDL number MFCD06795840

(3)Lonafarnib(Sch66336)

(4)Tipifarnib

易化膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)藥物，包括上述的法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。

法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑在制備抗癡呆藥物中的應(yīng)用。

上述癡呆病癥為老年性癡呆、阿爾茨海默病癡呆、血管性癡呆和帕金森病癡呆。

抗癡呆藥物，包括上述的法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。

有益效果：法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(farnesyltransferase inhibitors，F(xiàn)TI)對(duì)老年性癡呆，阿爾茨海默病認(rèn)知障礙，血管性癡呆和帕金森病認(rèn)知功能減退都具有明顯的改善作用。具體的說(shuō)，在老齡小鼠、阿爾茨海默病模型小鼠、腦缺血的癡呆模型小鼠和帕金森病認(rèn)知功能減退模型小鼠，F(xiàn)TI經(jīng)口腔、腹腔注射、腦室內(nèi)注入或細(xì)胞孵育等途徑處理都能劑量依賴(lài)地(1)增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞乙酰膽堿受體α7亞型(α7nACh)的活性和表達(dá)，(2)改善癡呆行為，(3)恢復(fù)海馬腦區(qū)的突觸傳遞效應(yīng)和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)誘導(dǎo)。

附圖說(shuō)明

圖1為法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑FTI-277和SCH66336增強(qiáng)海馬腦組織的α7nACh受體活性和表達(dá)的試驗(yàn)結(jié)果圖，(A和B)分別為2-4小時(shí)用FTI-277和SCH66336處理海馬腦片后，乙酰膽堿(ACh)誘導(dǎo)的α7nACh受體內(nèi)向電流(I_ACh)的密度曲線(xiàn)。(C和D)分別為FTI-277和SCH66336連續(xù)5天進(jìn)行小鼠腹腔注射后，海馬α7nACh受體蛋白水平。α7nAChR：α7nACh受體；FTI：FTI-277；SCH：SCH66336。(E和F)分別為FTI-277和SCH66336連續(xù)5天進(jìn)行小鼠腹腔注射后，海馬α7nACh受體mRNA水平。*P<0.05和**P<0.01vs.對(duì)照組。

圖2為FTI-277增強(qiáng)老齡小鼠空間認(rèn)知功能——改善老年性認(rèn)知功能減退的試驗(yàn)結(jié)果圖；為FTI-277連續(xù)10天進(jìn)行老齡(14月齡)小鼠腹腔注射后，(A)Morris水迷宮隱蔽平臺(tái)的逃避潛伏期；(B)Morris水迷宮空間探索時(shí)的各象限游泳時(shí)間百分比(PQ：站臺(tái)象限；R-AQ：站臺(tái)右側(cè)象限；L-AQ：站臺(tái)左側(cè)象限；OQ：站臺(tái)對(duì)側(cè)象限；FTI：FTI-277)；(C)“Y“迷宮的進(jìn)臂交替率；(D)海馬CA1區(qū)的輸入–輸出(input-output relationship，I/O)曲線(xiàn)。*P<0.05和**P<0.01vs.4月齡小鼠；#P<0.05和##P<0.01vs.14月齡小鼠；+P<0.05和++P<0.01vs.FTI-277處理的14月齡小鼠。

圖3為FTI-277和SCH66336改善阿爾茨海默病模型(APP/PS1轉(zhuǎn)基因)小鼠的認(rèn)知功能——抗阿爾茨海默病癡呆的試驗(yàn)結(jié)果圖；分別為FTI-277連續(xù)20天進(jìn)行APP/PS1小鼠腹腔注射后，(A-B)Morris水迷宮隱蔽平臺(tái)的逃避潛伏期；(C)Morris水迷宮空間探索時(shí)的各象限游泳時(shí)間百分比；(D)“Y“迷宮的進(jìn)臂交替率(％)；(E-F)海馬CA1區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)誘導(dǎo)。FTI：FTI-277；SCH：SCH66336，GAL：Galantamine hydrobromide。*P<0.05和**P<0.01vs.野生型小鼠；#P<0.05和##P<0.01vs.APP/PS1小鼠；+P<0.05和++P<0.01vs.DMXB處理的APP/PS1小鼠。

圖4為SCH66336改善阿爾茨海默病模型(Aβ_25-35)小鼠的認(rèn)知功能——抗阿爾茨海默病癡呆的試驗(yàn)結(jié)果圖；分別為SCH66336連續(xù)20天進(jìn)行Aβ_25-35小鼠腹腔注射后，(A-B)Morris水迷宮隱蔽平臺(tái)的逃避潛伏期；(C)Morris水迷宮空間探索時(shí)的各象限游泳時(shí)間百分比；(D)“Y“迷宮的進(jìn)臂交替率(％)；(E)海馬CA1區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)誘導(dǎo)。SCH：SCH66336。*P<0.05和**P<0.01vs.對(duì)照組小鼠；#P<0.05和##P<0.01vs.Aβ_25-35小鼠；+P<0.05和++P<0.01vs.DMXB處理的Aβ_25-35小鼠。

圖5為FTI-277改善局部腦缺血小鼠的認(rèn)知功能——抗血管性癡呆的試驗(yàn)結(jié)果圖；(A)Morris水迷宮隱蔽平臺(tái)的逃避潛伏期。(B)Morris水迷宮空間探索的各象限游泳時(shí)間百分比。(C)“Y“迷宮的進(jìn)臂交替率(％)。FTI：FTI-277，*P<0.05和**P<0.01vs.sham-op小鼠(假手術(shù)組作為對(duì)照組小鼠)；#P<0.05和##P<0.01vs.MCAO小鼠。

圖6為SCH66336改善帕金森病癡呆小鼠的認(rèn)知功能——抗帕金森病癡呆的試驗(yàn)結(jié)果圖；“Y“迷宮的進(jìn)臂交替率(％)。*P<0.05vs.對(duì)照組小鼠；#P<0.05vs.MPTP小鼠。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明(1)法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑能增強(qiáng)α7nACh受體的活性和表達(dá)；(2)采用多種認(rèn)知障礙(癡呆)的動(dòng)物模型，抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶對(duì)老年性認(rèn)知功能減退、阿爾茨海默病認(rèn)知障礙、血管性癡呆和抗帕金森病癡呆都有顯著的抗癡呆作用及其相關(guān)機(jī)制。

實(shí)施例1：法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑能增強(qiáng)α7nACh受體的活性和表達(dá)

實(shí)驗(yàn)主要材料：

30-35天齡的ICR小鼠購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)在南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并且維持在溫度23±2℃，濕度55±5％，12:12h光/暗循環(huán)的環(huán)境下。它們可以自由的取食食物和水。

藥物和試劑

法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(farnesyltransferase inhibitors，F(xiàn)TI)：①Farnesyl transferase inhibitor(FTI,FTI-277)從美國(guó)Calbiochem公司購(gòu)買(mǎi)(Cat#344555)，在5％Tween 80產(chǎn)生乳液或溶解于dimethyl sulfoxide(DMSO)，進(jìn)行腹腔注射(50mg/kg)或腦片孵育(1μM)。②Lonafarnib(SCH66336)從美國(guó)Medchemexpress公司購(gòu)買(mǎi)(Cat#HY-15136)，溶解于dimethyl sulfoxide(DMSO)，進(jìn)行灌胃給藥(50mg/kg)或腦片孵育(5μM)。

實(shí)驗(yàn)操作

電生理的檢測(cè)和分析：(1)海馬腦片制備：乙醚麻醉后快速斷頭取腦，置于0-4℃冰凍ACSF中1分鐘備用。ACSF使用前通混合氣(95％O₂，5％CO₂)使PH值穩(wěn)定在7.4。鼠腦稍加修飾后移至振動(dòng)切片機(jī)浴槽內(nèi)，在0-4℃ACSF中切取包含海馬的冠狀腦片3-6片(厚度350μm)。將切好的腦片迅速轉(zhuǎn)移至持續(xù)通混合氣的氧飽和ACSF中，在28℃左右孵育至少60分鐘后移至記錄浴槽。浴槽為浸潤(rùn)式灌流系統(tǒng)，灌流速度2mL/min，灌流液為持續(xù)通95％O₂/5％CO₂混合氣體的ACSF。微電極的拉制：選用長(zhǎng)10cm，外徑為1.5mm，內(nèi)徑為0.86mm標(biāo)準(zhǔn)硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管，在水平拉制儀上用四步拉制法拉制成記錄用微電極。充灌電極內(nèi)液后電極尖端入水阻抗為4-6MΩ。電極無(wú)需拋光即可直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。循環(huán)灌流系統(tǒng)：實(shí)驗(yàn)中ACSF用作灌流液進(jìn)行循環(huán)灌流。溶液置于一定容積的刻度管中，并持續(xù)給95％O₂/5％CO₂混合氣，通過(guò)恒流泵的動(dòng)力作用將氧飽和ACSF泵入記錄槽。溶液灌流速度由調(diào)節(jié)閥進(jìn)行控制，通常為2-3mL/min，需要特殊沖洗的實(shí)驗(yàn)，可將流速調(diào)至5-8mL/min，以使藥物快速而有效的作用于腦片細(xì)胞或者將殘留的藥物迅速?zèng)_洗干凈。灌流液溫度通過(guò)恒溫水浴鍋控制在28-30℃，使得記錄槽溫度維持在室溫附近。保持實(shí)驗(yàn)室封閉透光，室內(nèi)常溫(22-25℃)，并具備較好的隔離噪音等條件。灌流系統(tǒng)所用的灌流管定期(兩周)更換，以免被污塘堵塞。

(2)全細(xì)胞膜片鉗記錄：實(shí)驗(yàn)在室溫(22-25℃)下進(jìn)行。將孵育好的腦片，轉(zhuǎn)移到記錄糟內(nèi)，并用鉑金絲網(wǎng)固定，置于正置顯微鏡載物臺(tái)(配有40×的水鏡)上。在40×水鏡下，通過(guò)CCD(EvolutuonQE)采集圖象并可在顯示器上進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選取腦片上CA1或CA3區(qū)胞體飽滿(mǎn)均勻，邊界清晰的神經(jīng)元為記錄對(duì)象。在電壓鉗模式下用MP-225微型操縱儀引導(dǎo)充有電極內(nèi)液的玻璃微電極靠近細(xì)胞，記錄電極入水前要先給予一正壓(將1mL注射器向前輕推1/10的體積)，以防止電極尖端被污染。待電極靠近細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)小凹陷，并能觀察到電極阻抗上升3-5MΩ，釋放正壓并用給予適當(dāng)負(fù)壓進(jìn)行封接，同時(shí)逐步將鉗制電壓調(diào)節(jié)到–70mV，形成高阻封接(>1GΩ)。待形成穩(wěn)定的封接后，給予強(qiáng)烈而短促的負(fù)壓打破電極尖端下的小片細(xì)胞膜，從而形成穩(wěn)定的全細(xì)胞記錄模式。全細(xì)胞膜片鉗所用放大器為EPC-10，數(shù)據(jù)采集使用2.9kHz低通濾波，并在10kHz采樣。在電流記錄時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)控窗口，監(jiān)測(cè)串聯(lián)電阻(Rs)的變化，防止破膜的回封引起電流動(dòng)力學(xué)參數(shù)如幅度和衰減時(shí)間(decay time)的變化。其中Rs或者電容值的變化不應(yīng)超過(guò)原值的20％，同時(shí)保持Rs<30M，Ra>200M。所采集數(shù)據(jù)中統(tǒng)計(jì)時(shí)舍去未補(bǔ)償?shù)拇?lián)電阻導(dǎo)致的電壓鉗誤差超過(guò)5mV的神經(jīng)元數(shù)據(jù)。采樣后數(shù)據(jù)用PulseFit(HEKA公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。記錄α7nACh受體電流(I_ACh)時(shí)，鉗制為–60mV，乙酰膽堿(ACh)溶解到灌流液中，通過(guò)快速?lài)娝幭到y(tǒng)局部對(duì)目標(biāo)神經(jīng)元胞體進(jìn)行加藥。同時(shí)浴槽循環(huán)灌流液中加入1μM strychnine，10μM bicuculline，10μM NBQX和0.1μM TTX。電生理結(jié)果用pClamp軟件(Axon公司)或PulseFit軟件(HEKA公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。膜片鉗記錄數(shù)據(jù)分析：相關(guān)量效曲線(xiàn)用Hill方程進(jìn)行擬合，n為Hill系數(shù)，EC₅₀為半數(shù)有效劑量。

Western blot檢測(cè)

乙醚麻醉小鼠，斷頭取腦，分離海馬局部組織。加入RIPA蛋白裂解液，勻漿后低溫高速離心(4℃，12000r/min，15分鐘)，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，上清液置于-80℃保存。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100℃加熱5分鐘，離心3分鐘，取上清加樣后進(jìn)行蛋白電泳。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)至PVDF膜、5％脫脂牛奶封閉后，加α7nACh受體特異性一抗4℃孵育過(guò)夜。第二天，TBST洗脫3遍之后，再與辣根過(guò)氧化物(HRP)標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫反應(yīng)2h，經(jīng)適當(dāng)洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，X光片壓片曝光。之后將PVDF膜用抗體洗脫液洗滌15分鐘，重新封閉后加β-actin一抗及相應(yīng)二抗體再次顯色曝光。用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行薄層密度掃描，并用Image J分析軟件反映蛋白含量。

實(shí)時(shí)定量RT-PCR

小鼠麻醉后斷頭取腦，冰上快速分離海馬和皮層置于離心管中，加入TRIzol RNA提取液，超聲粉碎裂解后，靜置15分鐘。加入氯仿混勻后離心15分鐘(12000rpm，4℃)。轉(zhuǎn)移上層無(wú)色水相至新的離心管中，加入異丙醇充分混勻后離心10分鐘(12000rpm，4℃)，棄上清，RNA沉淀于管底。加入75％乙醇振蕩后離心5分鐘(7500rpm，4℃)，棄上清，用DEPC處理水溶解RNA沉淀。核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定樣品OD260、OD280和RNA的濃度，使OD260/OD280比值在1.8-2.0左右的RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板。運(yùn)用PCR擴(kuò)增儀和RT Master Mix試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(10μL體系)，反應(yīng)條件：37℃15分鐘，85℃5秒終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄后的cDNA加DEPC水稀釋10倍。PCR擴(kuò)增體系(5μLPremix Ex TaqTM，0.2μL Primer Forward，0.2μL Primer Reverse，1μL cDNA，3.6μL ddH2O)加入到96孔板中，每個(gè)樣品的目的基因和內(nèi)參基因都設(shè)三個(gè)平行反應(yīng)管。擴(kuò)增條件：預(yù)變性90℃30秒，40個(gè)循環(huán)(95℃5秒，60℃30秒，72℃30秒)，總延伸72℃10分鐘。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)結(jié)束后輸出Ct值，根據(jù)以下公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間目的基因的相對(duì)表達(dá)差異。(Fold：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因拷貝數(shù)的比值；Ct11：實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct值；Ct10：實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct值；Ct01：對(duì)照組目的基因Ct值；Ct00：對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值。)Fold＝2^-ΔΔCt；ΔΔCt＝(Ct11–Ct10)–(Ct₀₁–Ct00)。α7nACh受體的引物序列為：5′-CACATTCCACACCAACGTCTT-3′和5′-AAAAGGGAACCAGCGTACATC-3′。GAPDH的引物序列為：5′-TGGGTGTGAACCACGAG-3′和5′-AAGTTGTCATGGATGACCTT-3′。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)海馬腦片進(jìn)行FTI-277(1μM)或SCH66336(5μM)2-4小時(shí)孵育，能增加乙酰膽堿(ACh)誘導(dǎo)的α7nACh受體內(nèi)向電流(I_ACh)的密度(FTI-277：P<0.05，n＝10小鼠；圖1-A，SCH66336：P<0.05，n＝10；圖1-B)。

(2)給與小鼠連續(xù)5天的FTI-277(50mg/kg)或SCH66336(50mg/kg)腹腔注射，引起小鼠海馬組織α7nACh受體的蛋白水平增加(FTI-277：P<0.01，n＝10；圖1-C，SCH66336：P<0.01，n＝10；圖1-D)。

(3)給與小鼠連續(xù)5天的FTI-277(50mg/kg)或SCH66336(50mg/kg)腹腔注射，引起小鼠海馬組織α7nACh受體的mRNA水平(FTI-277：P<0.01，n＝10；圖1-E，SCH66336：P<0.01，n＝10；圖1-F)。

結(jié)論：抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶能增強(qiáng)α7nACh受體的活性和表達(dá)。

實(shí)施例2：法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑改善老齡小鼠的認(rèn)知功能——抗老年性癡呆。

實(shí)驗(yàn)主要材料

4月齡和14月齡的雄性ICR小鼠(體重27-30g，SPF級(jí))由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2007－0005，合格證號(hào)：2007000517888。清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度22－25℃，使用SPF級(jí)專(zhuān)用大小鼠顆粒飼料和SPF級(jí)消毒墊料(南京安立默科技有限公司提供)。12小時(shí)(6:00-18:00)明暗周期，自由進(jìn)食水(南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心)。所有接觸動(dòng)物的操作器械和材料均經(jīng)紫外消毒滅菌，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作人員經(jīng)專(zhuān)門(mén)培訓(xùn)，有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用上崗合格證，試驗(yàn)用液體的配制在醫(yī)用凈化工作臺(tái)中進(jìn)行。動(dòng)物抵達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開(kāi)始試驗(yàn)。動(dòng)物活殺或處死均在麻醉?xiàng)l件下進(jìn)行。

藥物和試劑

同實(shí)施例1。

α7nACh受體拮抗劑methyllycaconitine(MLA,Sigma Research Biochemicals,Natick,MA)溶解在生理鹽水中進(jìn)行腹腔注射(5mg/kg)。

實(shí)驗(yàn)操作

空間認(rèn)知行為的評(píng)價(jià)：

Morris水迷宮試驗(yàn):水迷宮水溫保持(23±2)℃，池壁上標(biāo)有東南西北四個(gè)入水點(diǎn)，將水池等分為四個(gè)象限(E、S、W、N)，迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，用以同步記錄小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。訓(xùn)練期間迷宮外參照物保持不變，以供鼠定位平臺(tái)。此實(shí)驗(yàn)主要由隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)和探索試驗(yàn)。(1)隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)(hidden platform trial)。試驗(yàn)時(shí)平臺(tái)位置固定不變(第四象限)，分別從四個(gè)象限的入水點(diǎn)入水，訓(xùn)練時(shí)將動(dòng)物面朝池壁標(biāo)示輕輕放入水中。記錄鼠從入水至找到平臺(tái)的游泳路線(xiàn)的長(zhǎng)度及找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期，escape latency)，然后讓鼠在平臺(tái)上停留10秒。如果60秒內(nèi)找不到平臺(tái)，潛伏期記為60秒，并將鼠置于平臺(tái)上休息10秒。訓(xùn)練結(jié)束后，將鼠置于籠中，并注意保暖、用吹風(fēng)機(jī)烘干鼠毛。每天在4個(gè)入水點(diǎn)各訓(xùn)練1次，以四次潛伏期的算術(shù)均值作為這一天的成績(jī)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每天每只動(dòng)物入水點(diǎn)順序保持一致，同一組內(nèi)不同動(dòng)物不同，以排除組內(nèi)動(dòng)物信息交流。空間探索試驗(yàn)(probe trial)。隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)結(jié)束24小時(shí)后，撤除平臺(tái)。然后從平臺(tái)的同一對(duì)角入水點(diǎn)入水，記錄鼠在60秒內(nèi)的游泳路徑，對(duì)小鼠原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間％進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。觀察受試鼠的空間定位能力，及在空間探索過(guò)程中的變化規(guī)律。

“Y”迷宮試驗(yàn)：自發(fā)性的交替行為可以用Y-maze實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估。Y-maze即黑色Y形三等分輻射式迷路箱，由3個(gè)支臂和一個(gè)連接區(qū)組成，三臂互相間夾角120°，每臂長(zhǎng)38.5厘米，上寬8厘米，下寬3.5厘米，高12厘米，三個(gè)臂可任選一臂為起始臂。每只小鼠從固定一臂的末端釋放，讓小鼠自由活動(dòng)8分鐘，記錄每次進(jìn)臂的次序。三次連續(xù)進(jìn)入不同的三個(gè)臂被定為交替進(jìn)臂(如：ABC，ACB，BAC，BCA，CAB，CBA)。交替進(jìn)臂率的計(jì)算為：1－(錯(cuò)誤次數(shù)/總次數(shù)－2)×100％。另外，總的進(jìn)臂次數(shù)也可以確定。

海馬突觸傳遞功能檢查

腦片制備：小鼠在乙醚麻醉下快速斷頭取腦，置于0–4℃冰凍人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中2min左右備用。ACSF成分為(mM)：124.0NaCl，4.5KCl，2.0CaCl₂，1.0MgCl₂，26.0NaHCO₃，1.2NaH₂PO₄，10.0D-glucose。使用前通混合氣(95％O₂，5％CO₂)使PH值穩(wěn)定在7.4。鼠腦經(jīng)稍加修飾后移至振動(dòng)切片機(jī)浴槽內(nèi)，在0–4℃ACSF中切取包含海馬的冠狀腦片2–4片(厚度400μm)。將切好的腦片迅速轉(zhuǎn)移至持續(xù)通飽和氧混合氣的ACSF中，在室溫(22–25℃)下孵育至少60min后移至恒溫記錄浴槽，浴槽為浸潤(rùn)式灌流系統(tǒng)，灌流速度1ml/min，溫度30±1℃，并持續(xù)通氧。記錄電極使用標(biāo)準(zhǔn)硼硅酸鹽玻璃管經(jīng)P-97拉制儀拉制，沖灌2M NaCl溶液后電極阻抗為4–5MΩ。刺激電極為自制雙極鎢絲電極，直徑50μm，極間距為100–150μm，尖端裸露40–60μm。刺激電極為雙極鎢絲電極置于海馬腦片CA2或CA1區(qū)的謝弗側(cè)支處，進(jìn)行順向刺激，距離刺激電極約2–3mm，其尖端位于腦片表面下50–200μm處，記錄興奮性的突觸后電位EPSP。記錄信號(hào)經(jīng)放大器放大，Bridge模式，濾波5kHz，經(jīng)A/D卡進(jìn)行數(shù)模轉(zhuǎn)換后用Clampex軟件(Axon Inc.，USA)顯示并保存。使用SEN-3301刺激器，刺激波寬0.1ms，刺激強(qiáng)度約為0.1–1.0mA，刺激間隔為15秒，每4個(gè)刺激進(jìn)行一次疊加平均獲得標(biāo)準(zhǔn)EPSP。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)，刺激強(qiáng)度從閾值開(kāi)始直至誘發(fā)最大EPSP，測(cè)定輸入–輸出(input-output relationship，I/O)曲線(xiàn)。每一個(gè)刺激強(qiáng)度取5個(gè)反應(yīng)，以刺激強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，以平均的EPSP斜率為縱坐標(biāo)得到I/O曲線(xiàn)。根據(jù)I/O曲線(xiàn)，選擇最大反應(yīng)的刺激強(qiáng)度一半作為測(cè)試刺激強(qiáng)度進(jìn)行穩(wěn)定記錄。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

定量資料表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。Morris水迷宮原站臺(tái)所在象限時(shí)間％和“Y”迷宮采用雙因數(shù)和單因素方差分析。Scheffe`s檢驗(yàn)測(cè)定兩組間的差異顯著性。將差異P<0.05定義為差異顯著。

試驗(yàn)結(jié)果：

(1)Morris水迷宮—隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)：與4月齡小鼠相比，14月老齡小鼠的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01，n＝10，圖2-A)。FTI-277(5mg/kg)處理(10天)能減少14月齡小鼠的逃避潛伏期(P<0.01，n＝10)。α7nACh受體拮抗劑MLA(5mg/kg)能阻止FTI-277改善逃避潛伏期的作用(P<0.01，n＝10)。

(2)Morris水迷宮—空間探索試驗(yàn)：與4月齡小鼠相比，14月齡小鼠在站臺(tái)象限的游泳時(shí)間顯著減少(P<0.01，n＝10，圖2-B)。FTI-277處理能恢復(fù)14月齡小鼠在站臺(tái)象限的游泳時(shí)間(P<0.01，n＝10)。MLA能阻止FTI-277改善空間探索能力的作用(P<0.01，n＝10)。

(3)“Y“迷宮的檢測(cè)：14月齡小鼠與4月齡小鼠比較進(jìn)臂交替率有顯著性減少(P<0.05，n＝10，圖2-C)。FTI-277處理能明顯增加14月齡小鼠的進(jìn)臂交替率(P<0.05，n＝10)。MLA能阻止FTI-277改善進(jìn)臂交替率的作用(P<0.05，n＝10)。

(4)電生理檢測(cè)：14月齡小鼠的海馬CA1區(qū)的突觸傳遞斜率明顯低于4月齡小鼠(P<0.05和0.01，n＝10，圖2-D)。FTI-277處理能提高14月齡小鼠的突觸傳遞斜率(P<0.05和0.01，n＝10)。MLA能阻止FTI-277改善突觸傳遞斜率的作用(P<0.05和0.01，n＝10)。

結(jié)論：抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)增強(qiáng)α7nACh受體活性發(fā)揮抗老年性癡呆的作用。

實(shí)施例3：法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑改善阿爾茨海默病小鼠的認(rèn)知功能——抗阿爾茨海默病癡呆(1)

實(shí)驗(yàn)主要材料：

動(dòng)物飼養(yǎng)在南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并且維持在溫度23±2℃，濕度55±5％，12:12h光/暗循環(huán)的環(huán)境下。它們可以自由的取食物和水。

藥物和試劑

同實(shí)施例1和實(shí)施例2。

α7nACh受體激動(dòng)劑3-(2,4-dimethoxybenzylidene)-anabaseine(DMXB，日本大昭制藥公司提供，code name GTS-21,Taisho Pharmaceuticals,Tokushima,Japan)溶解在生理鹽水中進(jìn)行腹腔注射(0.2mg/kg)。乙酰膽堿酯酶抑制劑Galantamine hydrobromide(GAL，氫溴酸加蘭他敏，99％，Melonepharma，MD1560,Dalian,P.R.China)溶解在生理鹽水中進(jìn)行腹腔注射(2mg/kg)。

阿爾茨海默病模型小鼠

APP/PS1小鼠：8月齡雄性和雌性APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因型小鼠(以下簡(jiǎn)稱(chēng)，APP/PS1小鼠)從Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME，USA)購(gòu)得，運(yùn)用Jackson實(shí)驗(yàn)室推薦的PCR方法進(jìn)行基因型鑒定。

實(shí)驗(yàn)操作

空間認(rèn)知行為的評(píng)價(jià)：同實(shí)施例1。

海馬突觸傳遞功能檢查：同實(shí)施例1。

長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)的誘導(dǎo)是先用實(shí)驗(yàn)刺激強(qiáng)度刺激腦片作為條件測(cè)試，采集20分鐘作為平均的基值(100％)，然后進(jìn)行高頻條件刺激(HFS，100Hz，1秒)，再施以相同實(shí)驗(yàn)測(cè)試，至少穩(wěn)定記錄1小時(shí)，以判斷LTP的發(fā)生。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：同實(shí)施例1。

試驗(yàn)結(jié)果：

(1)Morris水迷宮—隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)：與野生型小鼠相比，APP/PS1小鼠的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01，n＝10，圖3-A)。FTI-277(50mg/kg)處理(20天)能減少APP/PS1小鼠的逃避潛伏期(P<0.05，n＝10)。氫溴酸加蘭他敏GAL(2mg/kg)或者α7nACh受體激動(dòng)劑DMXB(0.2mg/kg)20天處理并不能明顯改善APP/PS1小鼠的逃避潛伏期(P>0.05，n＝10，圖3-B)。但是，DMXB與FTI-277聯(lián)合使用能顯著地降低APP/PS1小鼠的逃避潛伏期(P<0.01，n＝10)。

(2)Morris水迷宮—空間探索試驗(yàn)：與野生型小鼠相比，APP/PS1小鼠在站臺(tái)象限的游泳時(shí)間顯著減少(P<0.01，n＝10，圖3-C)。FTI-277處理能增加APP/PS1小鼠在站臺(tái)象限的游泳時(shí)間(P<0.05，n＝10)。DMXB單獨(dú)處理并不能明顯改善APP/PS1小鼠在站臺(tái)象限的游泳時(shí)間(P>0.05，n＝10)。但是，DMXB與FTI-277聯(lián)合使用能顯著地增加APP/PS1小鼠在站臺(tái)象限的游泳時(shí)間(P<0.01，n＝10)。

(3)“Y“迷宮的檢測(cè)結(jié)果顯示，APP/PS1小鼠與野生型小鼠比較進(jìn)臂交替率有顯著性減少(P<0.01，n＝10，圖3-D)。FTI-277處理能明顯增加APP/PS1小鼠的進(jìn)臂交替率(P<0.05，n＝10)。DMXB單獨(dú)處理并不能明顯改善APP/PS1小鼠的進(jìn)臂交替率(P>0.05，n＝10)。但是，DMXB與FTI-277聯(lián)合使用能顯著地增加APP/PS1小鼠的進(jìn)臂交替率(P<0.01，n＝10)。

(4)電生理檢測(cè)結(jié)果顯示，APP/PS1小鼠的海馬CA1區(qū)的LTP不能誘導(dǎo)(n＝10，圖3-E)。FTI-277處理能恢復(fù)APP/PS1小鼠的LTP誘導(dǎo)(n＝10)。DMXB單獨(dú)處理并不能恢復(fù)APP/PS1小鼠的LTP誘導(dǎo)(n＝10，圖3-F)。但是，DMXB與FTI-277聯(lián)合使用能保護(hù)APP/PS1小鼠的LTP誘導(dǎo)(n＝10)。

結(jié)論：抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶能增強(qiáng)膽堿能受體激動(dòng)劑的抗阿爾茨海默病癡呆作用。

實(shí)施例4：法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑改善阿爾茨海默病小鼠的認(rèn)知功能——抗阿爾茨海默病癡呆(2)

實(shí)驗(yàn)主要材料：

動(dòng)物飼養(yǎng)在南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并且維持在溫度23±2℃，濕度55±5％，12:12h光/暗循環(huán)的環(huán)境下。它們可以自由的取食物和水。

藥物和試劑

同實(shí)施例1，實(shí)施例2和實(shí)施例3。

阿爾茨海默病模型小鼠

Aβ_25-35小鼠：4月齡雄性ICR小鼠(南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)麻醉后俯臥固定于立體定位儀，行背側(cè)頸正中切口，暴露顱骨，按Paxinos和Watson小鼠立體定位圖譜，并切開(kāi)，以前囟點(diǎn)為坐標(biāo)，前囟點(diǎn)后0.3mm，右側(cè)1mm，深2.5mm，為側(cè)腦室注射點(diǎn)。Aβ_25-35(sigma公司)置于37℃水浴箱中孵育96小時(shí)，使其聚集(老化)。用微量進(jìn)樣器于單側(cè)腦室內(nèi)注射Aβ_25-35約3μl。5分鐘內(nèi)緩慢注射，留針?lè)昼?，保證溶液充分進(jìn)入側(cè)腦室。注射完畢后以局部軟組織封閉針孔，縫合皮膚。建立AD小鼠模型。假手術(shù)組小鼠給予同容積的生理鹽水的側(cè)腦室注射。

實(shí)驗(yàn)操作

空間認(rèn)知行為的評(píng)價(jià)：同實(shí)施例1。

海馬突觸傳遞功能檢查：同實(shí)施例1和同實(shí)施例3。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：同實(shí)施例1。

試驗(yàn)結(jié)果：

(1)Morris水迷宮—隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)，與對(duì)照組相比，Aβ_25-35小鼠的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01，n＝10，圖4-A)。SCH66336(50mg/kg)處理(20天)能減少Aβ_25-35小鼠的逃避潛伏期(P<0.05，n＝10)。DMXB(0.2mg/kg)單獨(dú)處理并不能明顯改善Aβ_25-35小鼠的逃避潛伏期(P>0.05，n＝10，圖4-B)。但是，DMXB與SCH66336聯(lián)合使用能顯著地降低Aβ_25-35小鼠的逃避潛伏期(P<0.01，n＝10)。

(2)Morris水迷宮—空間探索試驗(yàn)：與野生型小鼠相比，Aβ_25-35小鼠在站臺(tái)象限的游泳時(shí)間顯著減少(P<0.01，n＝10，圖4-C)。SCH66336處理能增加Aβ_25-35小鼠在站臺(tái)象限的游泳時(shí)間(P<0.05，n＝10)。DMXB單獨(dú)處理并不能明顯改善Aβ_25-35小鼠在站臺(tái)象限的游泳時(shí)間(P>0.05，n＝10)。但是，DMXB與FTI-277聯(lián)合使用能顯著地增加Aβ_25-35小鼠在站臺(tái)象限的游泳時(shí)間(P<0.01，n＝10)。

(3)“Y“迷宮的檢測(cè)結(jié)果顯示，Aβ_25-35小鼠與對(duì)照組比較進(jìn)臂交替率有顯著性減少(P<0.05，n＝10，圖4-D)。SCH66336處理處理能明顯增加Aβ_25-35小鼠的進(jìn)臂交替率(P<0.05，n＝10)。DMXB單獨(dú)處理并不能明顯改善Aβ_25-35小鼠的逃避潛伏期(P>0.05，n＝10)。但是，DMXB與SCH66336聯(lián)合使用能顯著地增加Aβ_25-35小鼠的進(jìn)臂交替率(P<0.01，n＝10)。

(8)電生理檢測(cè)結(jié)果顯示，Aβ_25-35小鼠的海馬CA1區(qū)不能誘導(dǎo)LTP(n＝10，圖4-E)。SCH66336處理能恢復(fù)Aβ_25-35小鼠的LTP誘導(dǎo)(n＝10)。

結(jié)論：抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶能增強(qiáng)膽堿能受體活化的抗阿爾茨海默病癡呆作用。

實(shí)施例5：法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑改善腦卒中小鼠的認(rèn)知功能——抗血管性癡呆作用

實(shí)驗(yàn)主要材料：雄性ICR小鼠(體重25g～30g)購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

實(shí)驗(yàn)操作：

腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷闹苽洌焊鶕?jù)Zea-longa改良線(xiàn)栓法制備大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型：將尼龍線(xiàn)(0.4號(hào)，d＝0.104mm)剪成20mm長(zhǎng)，頭端約4mm蘸少許硅膠，懸掛在通風(fēng)處24小時(shí)以上晾干。在顯微鏡下篩選出前端光滑圓鈍的尼龍線(xiàn)，尼龍線(xiàn)的頂端形成膨大的球形，可使阻塞血流的效果更佳。模型小鼠以2％水合氯醛腹腔麻醉(20ml/kg，i.p.)，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮行頸正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎ECA與CCA，動(dòng)脈夾夾閉ICA遠(yuǎn)心端，用眼科剪在CCA作一切口，用眼科鑷夾住漁線(xiàn)經(jīng)切口處插入，松開(kāi)動(dòng)脈夾，繼續(xù)插入漁線(xiàn)至稍有阻力，插入深度為(12±0.5)mm左右，實(shí)現(xiàn)右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致的局部腦缺血，入口處做一單結(jié)，防止線(xiàn)栓的滑脫，用浸有生理鹽水的脫脂棉球蓋住頸部切口，1小時(shí)后拔出漁線(xiàn)，將之前的單結(jié)處重新結(jié)扎，縫好切口，實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈再灌注。所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，皮膚切開(kāi)處用青霉素抗菌。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將小鼠體溫控制在37℃左右。動(dòng)物清醒后，觀察小鼠的行為和神經(jīng)癥狀，根據(jù)Zea-Longa建立的神經(jīng)功能缺損程度的五級(jí)四分法標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)地評(píng)分。假手術(shù)組(sham-op)處理步驟同上，但漁線(xiàn)插入頸總動(dòng)脈而不插入大腦中動(dòng)脈。

空間認(rèn)知行為檢測(cè)：同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)Morris水迷宮—隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)，在MCAO后2周，MCAO小鼠的逃避潛伏期比對(duì)照組小鼠顯著延長(zhǎng)(P<0.01，n＝10，圖5-A)。FTI-277(50mg/kg)處理(20天)能減少M(fèi)CAO小鼠的逃避潛伏期(P<0.01，n＝10)。

(2)Morris水迷宮—空間探索試驗(yàn)：與假手術(shù)組小鼠相比，MCAO小鼠在站臺(tái)象限的游泳時(shí)間顯著減少(P<0.05，n＝10，圖5-B)。FTI-277處理能增加FTI-277在站臺(tái)象限的游泳時(shí)間(P<0.05，n＝10)。

(3)“Y“迷宮的檢測(cè)結(jié)果顯示，MCAO小鼠與假手術(shù)組小鼠相比進(jìn)臂交替率減少(P<0.05，n＝10，圖5-C)。FTI-277處理能改善MCAO小鼠的進(jìn)臂交替率(P<0.05，n＝10)。

結(jié)論：抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶有抗血管性癡呆的作用。

實(shí)施例6：法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑改善帕金森病小鼠的認(rèn)知功能——抗帕金森病癡呆作用

實(shí)驗(yàn)主要材料：4月齡雄性C57小鼠(SPF級(jí))由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。

實(shí)驗(yàn)操作：

帕金森病模型的制備：MPTP-MPTP(1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)是一種神經(jīng)毒素。MPTP能夠通過(guò)破壞黑質(zhì)中產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細(xì)胞影響認(rèn)知功能。MPTP(25mg/kg)進(jìn)行小鼠皮下注射每周2次，共進(jìn)行連續(xù)5周的MPTP處理。

空間認(rèn)知行為的評(píng)價(jià)：同實(shí)施例1。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)“Y“迷宮的檢測(cè)結(jié)果顯示，在MPTP處理5周后，MPTP小鼠與對(duì)照組小鼠相比進(jìn)臂交替率減少(P<0.05，n＝10，圖6)。SCH66336(50mg/kg)處理(20天)處理能改善MPTP小鼠的進(jìn)臂交替率(P<0.05，n＝10)。

結(jié)論：抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶有抗帕金森病癡呆的作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京醫(yī)科大學(xué)

<120> 法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑在制備易化膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)藥物中的應(yīng)用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacattccac accaacgtct t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaaagggaac cagcgtacat c 21

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgggtgtgaa ccacgag 17

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagttgtcat ggatgacctt 20