本發(fā)明涉及一種肝細胞癌的藥物及胰高血糖素樣肽-1受體激動劑和/或二肽基肽酶4抑制劑的應用。

背景技術：

肝細胞癌(hcc)是第五大最常見的癌癥和全球癌癥死亡的第三大原因。流行病學研究表明，ii型糖尿病(t2d)與hcc的風險高3倍相關。重要的是，多種t2d相關的病理狀況，如高血糖，已被確定為hcc的重要誘導和預后因素。在發(fā)達國家，近10％的成年人患有糖尿病，且患病率每年都在增加。此外，69.5％的t2d患者具有非酒精性脂肪肝病(nafld)，其使患者易于形成hcc。nafld具有從脂肪變性，脂肪性肝炎(nash)，纖維化到肝硬化的廣泛的病理學譜。臨床研究報道約27％的nash相關性肝硬化進一步發(fā)展為hcc。隨著nafld和糖尿病發(fā)病率在世界各地的穩(wěn)定增加，預計大量的人口將發(fā)生hcc的風險更高。

胰高血糖素樣肽-1(glp-1)是可通過二肽基肽酶-4(dpp-4)降解的腸降血糖素激素，可以改善t2d患者的系統(tǒng)性血糖控制。長效glp-1r激動劑艾塞那肽(ex-4)和dpp-4抑制劑已經用于通過激活glp-1r信號傳導維持血糖穩(wěn)態(tài)。胰高血糖素樣肽-1受體(glp-1r)受多種t2d相關病理狀況調節(jié)，并且在許多組織如胰腺，結腸，乳腺，肝和肺中廣泛表達。以前的研究表明nash患者具有低肝臟水平的glp-1r，表明受損的glp-1r信號傳導。glp-1r的活化顯示降低肝脂質含量，降低丙氨酸轉氨酶(alt)水平，減少氧化應激，從而減輕nafld。

隨著glp-1r基于藥物在臨床中的廣泛使用，對glp-1r活化和患者中不同癌癥的關聯的爭論越來越多。例如，據報道，glp-1r激動劑和dpp-4抑制劑在β細胞中發(fā)揮抗細胞凋亡作用，并刺激胰腺炎，胰腺癌和甲狀腺癌。相反，其他研究顯示與glp-1r活化相關的胰腺癌風險沒有顯著升高，并且ex-4顯示抑制乳腺，前列腺和結腸癌細胞的增殖。盡管糖尿病和hcc的顯著關聯，glp-1r活化在肝癌發(fā)生中的結果仍然未確定。

技術實現要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是：提供一種肝細胞癌的藥物及胰高血糖素樣肽-1受體激動劑和/或二肽基肽酶4抑制劑在制造用于預防或治療肝細胞癌的藥物中的應用、在制造用于肝移植手術后肝功能恢復的藥物中的應用以及在制造用于預防肝移植手術后肝癌再發(fā)的藥物中的應用。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案為：一種治療肝細胞癌的藥物，該藥物包括胰高血糖素樣肽-1受體激動劑和/或二肽基肽酶4抑制劑。

進一步的，所述的胰高血糖素樣肽-1受體激動劑選自利拉魯肽、艾塞那肽中的任意一種或幾種。

進一步的，所述的二肽基肽酶4抑制劑選自西格列汀、利拉利汀、沙格列汀和維格列汀的任意一種或幾種。

進一步的，還包括藥學上可接受的載體。

本發(fā)明還提供胰高血糖素樣肽-1受體激動劑和/或二肽基肽酶4抑制劑在制造用于預防或治療肝細胞癌的藥物中的應用。

本發(fā)明還提供胰高血糖素樣肽-1受體激動劑和/或二肽基肽酶4抑制劑在制造用于肝移植手術后肝功能恢復的藥物中的應用。

本發(fā)明還提供胰高血糖素樣肽-1受體激動劑和/或二肽基肽酶4抑制劑在制造用于預防肝移植手術后肝癌再發(fā)的藥物中的應用。

進一步的，該藥物被腹膜內或靜脈內給藥。

本發(fā)明的有益效果在于：胰高血糖素樣肽-1受體激動劑和/或二肽基肽酶4抑制劑通過組織特異性方式施加差異效應，抑制癌細胞增殖并增加癌細胞凋亡，同時使肝細胞被保護免于凋亡，從而治療減弱肥胖依賴性和非依賴性肝癌發(fā)生。

附圖說明

圖1表示ex-4處理在體內抑制den誘導的hcc形成。

圖2表示ex-4處理降低腫瘤細胞增殖并增強凋亡。

圖3表示ex-4刺激hcc中的glp-1r信號傳導。

圖4表示ex-4使來自hfhc喂養(yǎng)的小鼠的腫瘤中的egfr-stat3信號傳導失活。

圖5表示ex-4抑制hepg2和huh7細胞生長及其伴隨的egfr信號傳導。

圖6表示pka和egfr活性介導ex-4對stat3活化和肝癌細胞生長的抑制作用。

具體實施方式

為詳細說明本發(fā)明的技術內容、所實現目的及效果，以下結合實施方式并配合附圖予以說明。

腸促胰素治療藥物的以下兩類中：(1)胰高血糖素樣肽-1(glp-1)受體激動劑，包括利拉魯肽(liraglutide)、艾塞那肽每日2次制劑和艾塞那肽每周1次制劑；(2)二肽基肽酶4(dpp-4)抑制劑，包括西格列汀(sitagliptin)、利拉利汀(linagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)和維格列汀(vildagliptin)，dpp-4抑制劑可限制內源性glp-1的降解。這2類藥物具有某些共性，如葡萄糖依賴性刺激胰島素分泌，低血糖發(fā)生率低。

本發(fā)明提供一種治療肝細胞癌的藥物，該藥物包括胰高血糖素樣肽-1受體激動劑和/或二肽基肽酶4抑制劑。

進一步的，所述的胰高血糖素樣肽-1受體激動劑選自利拉魯肽、艾塞那肽中的任意一種或幾種。

進一步的，所述的二肽基肽酶4抑制劑選自西格列汀、利拉利汀、沙格列汀和維格列汀的任意一種或幾種。

進一步的，還包括藥學上可接受的載體。

本發(fā)明還提供胰高血糖素樣肽-1受體激動劑和/或二肽基肽酶4抑制劑在制造用于預防或治療肝細胞癌的藥物中的應用。

本發(fā)明還提供胰高血糖素樣肽-1受體激動劑和/或二肽基肽酶4抑制劑在制造用于肝移植手術后肝功能恢復的藥物中的應用。

本發(fā)明還提供胰高血糖素樣肽-1受體激動劑和/或二肽基肽酶4抑制劑在制造用于預防肝移植手術后肝癌再發(fā)的藥物中的應用。

進一步的，該藥物被腹膜內或靜脈內給藥。

以下實施例通過研究ex-4在消耗低脂低碳水化合物(lflc)或高脂高碳水化合物(hfhc)飲食的二乙基亞硝胺(den)處理的小鼠中的效果，證明了腸促胰素治療藥物中的胰高血糖素樣肽-1受體激動劑和/或二肽基肽酶4抑制劑可治療肝細胞癌。

實施例

為了檢查hcc中glp-1r活化的影響，我們在小鼠中建立了hcc模型，其中施用den用于hcc誘導，并且飼喂低脂和低碳水化合物(lflc)或高脂和高碳水化合物(hfhc)飲食用于nash發(fā)展，旨在模擬從nash到hcc的病理進展。hfhc和den治療的小鼠具有臨床相關性，因為所得的病理狀況高度類似于人類糖尿病和hcc。在這里我們發(fā)現，ex-4治療的glp-1r激活顯著降低lflc和hfhc喂養(yǎng)的小鼠中的hcc多重性。特別感興趣的是，ex-4以組織特異性方式施加差異效應，其由多種信號傳導級聯介導。這些信息定義了glp-1r激活在保護肝臟免于發(fā)展hcc中的關鍵作用，并且提供了基于這種腫瘤抑制效應的新的機械學見解。

將雄性c57bl/6n小鼠在22～24℃下在12小時光-暗循環(huán)下飼養(yǎng)。在出生后第14天的小鼠腹膜內注射單劑量的den(5mg/kg體重)。在10周齡時，將小鼠分成2組，并喂食lflc或hfhc飲食。hfhc飲食由高脂肪飲食(研究飲食d12331,58％kcal來自脂肪)和高碳水化合物飲料(42g/l碳水化合物，55％果糖和45％蔗糖)組成，其被證明誘導nash。為了激活glp-1r信號傳導，以10nmol/kg體重的劑量或等量體積的(磷酸鹽緩沖液)pbs作為對照從3個月齡到處死每日腹膜內注射ex-4(wako)。為了監(jiān)測ex-4的抗糖尿病作用，如前所述進行口服葡萄糖耐量試驗(ogtt)。在處死前，將小鼠用氯胺酮和xyline安樂死，并通過心臟穿刺放血。分離腫瘤，計數并稱重。將解剖組織在液氮中快速冷凍或固定在福爾馬林中用于組織學分析。

免疫組化染色增殖和凋亡

肝切片中的增殖細胞如先前所述通過ki67抗體(labvision)染色。通過tunel染色(roche)分析凋亡。使用光學顯微鏡(zeiss)獲得圖像。在兩個實驗中，通過imagej計數在至少四個獨立視野中的陽性染色的細胞，并計算增殖或凋亡指數作為針對總肝細胞的陽性細胞(每組n＝5)。

實時pcr和western印跡

從肝組織提取總rna并轉錄成cdna。使用sybrgreenmix(takara)，使用特異性引物制備實時pcr。在appliedbiosystems7900htfastreal-timepcrsystem(appliedbiosystems)上進行pcr。在補充有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的ripa裂解緩沖液中提取蛋白質。裂解的蛋白質變性，分離并轉移到pvdf膜。用于檢測的抗體在補充方法中列出。通過imagej定量條帶的強度。

體外細胞生長測定和分子信號分析

hepg2和huh7細胞在補充有10％fbs，青霉素和鏈霉素的高葡萄糖dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2h-四唑溴化物(mtt)測定(sigma)測定具有指定治療的活細胞數。對于分子實驗，將人egfr基因克隆并插入cmv啟動子下游的表達質粒pcdna3.1(+)中。使用(polyplus轉染)通過egfr質粒的瞬時轉染誘導體外egfr過表達。h89(calbiochem)用于在體外研究中抑制pka活性。通過如手冊中所述的單獨的商業(yè)試劑盒(arbor測定)測量camp含量或pka活性。

統(tǒng)計

數據表示為平均值±標準誤差平均值(sem)。組之間的差異通過anova，隨后是學生t檢驗來確定。與p<0.05的比較被認為是統(tǒng)計學顯著的。

結果

(1)ex-4治療減弱肥胖依賴性和非依賴性肝癌發(fā)生

鑒于ex-4在減輕糖尿病癥狀以及t2d和hcc形成的密切關聯方面的已證明的功效，我們假設ex-4可能對肥胖癥誘導的肝癌發(fā)生發(fā)揮保護作用。為了解決這個問題，我們檢查了在用hfhc飲食喂養(yǎng)的den注射的c57bl/6n小鼠中ex-4的體內功能(圖1a)。這種動物模型可以模擬人類中糖尿病相關hcc的自然發(fā)展，因為den是肝癌的一種已經確定的致癌物，并且hfhc飲食先前已顯示在小鼠中誘導脂肪性肝炎和纖維化。同時，另一組注射den的小鼠被給予lflc飲食用于肥胖和瘦模型之間的比較。

我們首先評估不同組的小鼠使用ogtt的飲食相關血糖反應。簡言之，記錄刺激后血糖濃度的時間依賴性變化(圖1b)，并且將各個測量曲線下的面積用于直接比較(圖1c)。在pbs治療的對照中，hfhc喂養(yǎng)的小鼠的血糖水平可以高于lflc喂養(yǎng)的小鼠的血糖水平。雖然ex-4不干擾lflc喂養(yǎng)的小鼠中的葡萄糖體內平衡，但它顯著降低了喂食hfhc的小鼠中的血糖水平(圖1b-c，p<0.01)。此外，與lflc喂養(yǎng)組相比，ex-4還顯著降低了hfhc喂養(yǎng)的小鼠中血清甘油三酯，膽固醇和空腹胰島素的水平(圖1d，p<0.05)。在35周齡時，處死所有小鼠并檢查體重和肝重量。與lflc飲食相比，hfhc飲食顯著增加pbs處理的小鼠的身體和肝臟質量(圖1e，白色條，p<0.001和p<0.05)。值得注意的是，這種hfhc依賴性體重增加和肝腫大基本上被ex-4處理所消除(圖1e，黑色柱，p<0.001和p<0.05)。另外，ex-4處理顯著降低了hfhc引起的肝臟中的甘油三脂和脂肪酸含量(圖1f，黑色柱，p<0.001和p<0.05)。這些結果說明了ex-4抑制hfhc誘導的肥胖的有效性，這與ex-4在糖尿病患者中的輔助作用一致。

我們接下來檢查用于den誘導的hcc的解剖的小鼠肝臟(圖1f)，并且量化單獨組中的腫瘤多樣性和質量(圖1g)。在pbs處理的小鼠中，den的致癌作用被hfhc飲食顯著增強，所得腫瘤數量和重量分別比lflc飼養(yǎng)小鼠中發(fā)現的腫瘤數量和重量高3至6倍(圖1g，白色條，p<0.001和p<0.05)。與之形成鮮明對比的是，在ex-4處理的小鼠中，hfhc飲食僅將hcc豐度增加到有限程度(圖1g，黑色柱)。重要的是，當與pbs處理的對照相比時，在lflc-和hfhc-喂養(yǎng)的小鼠中，ex-4使hcc多樣性顯著降低高達78％(圖1f-gp<0.01和p<0.0001)。與這些結果一致，ex-4還在另一個den處理的m/db瘦小鼠模型中將hcc發(fā)病率限制45％，在hbx轉基因小鼠模型中將58％限制在其中病毒蛋白hbx可誘導hcc形成的補充圖1)。這種體內信息證明了ex-4對肥胖相關和不相關的肝癌發(fā)生的強抑制功能。

(2)ex-4抑制細胞增殖并增加hcc中的凋亡

為了描述ex-4在hcc中的抗腫瘤發(fā)生作用，我們比較了解剖的小鼠肝臟的非腫瘤和腫瘤組織中生長和垂死細胞的比例。通過染色對于細胞增殖的核標記物ki67，我們發(fā)現在lflc-和hfhc喂養(yǎng)的小鼠中，ex-4處理顯著地將增殖的腫瘤細胞的百分比降低高達3倍(圖2a，p<0.05和p<0.05)。值得注意的是，ex-4沒有改變任何一個飲食組的非腫瘤組織中的肝細胞增殖。接下來，我們使用tunel試劑盒測量相同組織中的細胞凋亡水平。結果表明，在lflc-和hfhc喂養(yǎng)的小鼠中，ex-4使凋亡腫瘤細胞的數量顯著增加高達2.7倍(圖2b，p<0.01和p<0.05)。有趣的是，ex-4的作用在非腫瘤組織中也是不同的，其中肝細胞被保護免于細胞凋亡?？傊?，我們的數據表明ex-4通過限制細胞增殖和驅動凋亡來抵消肝癌的發(fā)生。

(3)glp-1r表達在來自小鼠hcc模型和人肝癌細胞的腫瘤中上調

鑒于ex-4的上述組織特異性功能，我們進一步檢查了在相同的小鼠肝樣品中glp-1r的非腫瘤和腫瘤表達，glp-1r是ex-4的體內分子靶標和功能性介質。qrt-pcr分析顯示，在lflc和hfhc喂養(yǎng)的小鼠中，腫瘤組織中的glp-1r轉錄物水平比非腫瘤組織中的glp-1r轉錄物水平高>2倍(圖3a，p<0.05和p<0.05)，表明在hcc細胞中對ex-4治療的更大易感性。值得注意的是，在用lflc或hfhc飲食喂養(yǎng)的ex-4處理的小鼠中，在腫瘤組織中的這種glp-1r誘導不太明顯(圖3a)，顯示glp-1r表達以及致瘤性在長期處理實施例4。此外，我們對兩個永生化人正常肝細胞系(miha和lo2)和六個人類hcc細胞系(bel7402，hep3b，hepg2，huh7，plc5和sk-hep1)進行了相同的qrt-pcr分析。結果顯示，與正常對照相比，glp-1r在hcc中顯著上調(圖3b，全部p<0.05)。結果表明相對于正常對應物，glp-1r在hcc細胞中的過表達。

先前的研究已經證明glp-1r的活化與camp-pka信號傳導相關。為了確定在hcc中由glp-1r激活產生的分子反應，我們測量了肝組織中的細胞內camp含量和pka活性。由于我們對肥胖相關的hcc和來自lflc喂養(yǎng)的小鼠的腫瘤樣品不足的主要興趣，我們使用來自hfhc喂養(yǎng)的小鼠的組織樣品用于進一步的實驗。結果顯示在腫瘤組織中ex-4上調camp含量26％，pka活性50％(圖3c，p<0.05和p<0.01)，而在非腫瘤組織中未檢測到顯著變化來自相同的小鼠(圖3d)。為了證實這些結果，我們進一步檢查了pka最佳活性所需的pka催化亞基(pka-c)的磷酸化狀態(tài)(27)。如圖所示。3e，ex-4與pbs處理的對照相比顯著增強了腫瘤中的pka-c磷酸化(p<0.05)。與camp和pka活性結果(圖3c和d)一致，ex-4對非腫瘤組織中的pka-c磷酸化沒有顯著影響(圖3f)。這些實驗證明ex-4，glp-1r，camp和pka在hcc中的陽性結合。

(4)ex-4在體內減弱egfr-stat3信號傳導

鑒于glp-1r信號傳導的激活，我們接下來試圖確定肝癌發(fā)生中camp-pka信號傳導的下游的分子途徑。以前的報告表明，pka磷酸化絲氨酸殘基的egfr以降低其激酶活性，如通過減少y1173自磷酸化所示，并導致stat3的去磷酸化。當egfr的停靠位點(y1068)被磷酸化時，egfr可以在y705募集并磷酸化stat3以刺激其下游信號傳導(30-32)。我們確定相對于來自pbs處理的小鼠的非腫瘤，腫瘤中egfr(y1068/1173)以及其靶stat3(y705)的磷酸化水平顯著增強(圖4a，p<0.05，p<0.05和p<0.05)，表明hcc中egfr-stat3通路的活化。引人注目的是，與pbs處理的對照相比，ex-4顯著減少了egfr(y1068/1173)磷酸化，并且消除了腫瘤中的stat3(y705)磷酸化(圖4b，p<0.01，p<0.01和p<0.05)與camp-pka的ex-4依賴性誘導(圖3c和e)并行。重要的是，在相同的腫瘤組織中，包括c-myc，細胞周期蛋白d1，存活蛋白，bcl-2和bcl-xl的stat3-調節(jié)的基因的蛋白和轉錄水平一致地被ex-4抑制(圖4c，p<0.05)，說明ex-4在轉錄水平的多種功能效應。除了egfr-stat3信號轉導，我們還檢查了ex-4在由erk1/2，mtor，β-連環(huán)蛋白和炎癥細胞因子tnf-α和il-6調節(jié)的自噬和其它致癌途徑中的潛在作用。然而，在腫瘤樣品或人肝癌hepg2細胞中未檢測到顯著的ex-4依賴性變化。共同地，這些體內數據表明ex-4關閉egfr-stat3調節(jié)的級聯以抑制hcc形成。

(5)ex-4以劑量和時間依賴性方式滅活egfr/stat3

為了研究hcc中ex-4的時間作用和有效濃度，我們在兩種肝癌細胞模型，hepg2和huh7中評估了ex-4的體外功能，其在我們的篩選中表達最高水平的glp-1r(圖2)。使用mtt測定，我們發(fā)現ex-4顯著降低hepg2和huh7細胞的生長速率，并且生長減少的程度與藥物劑量(圖5a)和治療時間(圖5b)正相關。然后我們檢查ex-4是否影響這兩種hcc細胞系中的egfr(y1173)磷酸化及其靶stat3(y705)磷酸化。類似于mtt結果(圖5a-b)，egfr(y1173)和stat3(y705)的酪氨酸磷酸化水平以劑量和時間依賴性方式被ex-4顯著下調(圖5c-d)。這些體外結果與我們的體內證據高度一致(圖2和4)，證實細胞生長停滯和egfr/stat3失活的相關性。

(6)pka和egfr信號傳導介導ex-4的腫瘤抑制作用

為了評估camp/pka在ex-4的抗腫瘤發(fā)生作用中的強制作用，我們用pka特異性抑制劑h89，與或不與ex-4一起處理hepg2和huh7細胞，然后通過mtt測定。在dmso處理的hepg2細胞中，ex-4的應用減少了egfr(y1173)和stat3(y705)的酪氨酸磷酸化(圖6a，p<0.05)，這在期望的范圍內。相比之下，在h89處理的hepg2細胞中，磷酸化egfr(y1173)和stat3(y705)的基礎水平顯著增加，并且對ex-4處理變得不敏感(圖6a，p<0.05)。這種對egfr和stat3的h89依賴性作用也在huh7細胞中保守(圖6b，p<0.05)。在功能重要性方面，在hepg2和huh7細胞中，h89顯著降低了細胞生長的ex-4-依賴性抑制(圖6c)。這些結果清楚地證明了pka在介導ex-4功能中的上游和關鍵作用。

為了進一步驗證ex-4作用中egfr/stat3信號傳導的必要性，我們在使用或不使用ex-4處理的情況下在hepg2和huh7細胞中過表達egfr，然后通過相同的mtt測定法測量細胞生長。在空載體(pcdna)轉染的hepg2細胞中，ex-4以預期的方式抑制egfr(y1173)和stat3(y705)的酪氨酸磷酸化(圖6d，p<0.05)。相反，在egfr轉染的hepg2細胞中，無論ex-4處理如何，egfr(y1173)和stat3(y705)的磷酸化均適度增加(圖6d，p<0.05)。在huh7細胞中也獲得了一致的結果(圖6e，p<0.05)。egfr的這種異位過表達隨后減少了ex-4在hepg2和huh7細胞中的抗增殖作用(圖6f)，證實了egfr在ex-4效應中的強制性作用。

幾乎沒有實驗報告記錄glp-1r活化和癌癥的關系，并且結果主要來自裸鼠中的體外研究或異種移植模型(19-22)。在這項研究中，我們調查通過激動劑ex-4施用在致癌誘導和hfhc飼養(yǎng)的小鼠hcc模型中的glp-1r活化的影響，其概括了肥胖和人類hcc的大多數臨床特征)。在這里我們第一次報告ex-4治療可以有效抑制hcc發(fā)展(圖1)，其通過抑制細胞增殖并在腫瘤而非非腫瘤細胞中誘導凋亡來實現(圖2)。機制上，ex-4治療靶向glp-1r上調camp依賴性pka活性(圖3)，這繼而導致egfr和stat3的失活，并最終導致多種效應基因的下調，包括c-myc，細胞周期蛋白d1，存活蛋白，bcl-2和bcl-x1(圖4)。這種體內模型來源的調節(jié)機制(圖6g)是固體，因為在兩種人肝癌細胞模型中分別驗證了在ex-4處理后pka和egfr的不可或缺的作用和功能效應(圖5-6)?？傊?，我們的發(fā)現證實了ex-4在肥胖相關的hcc中的有效抑制作用，說明了基于腸降血糖素的治療作為治療糖尿病和hcc的新的藥理學方法的潛在臨床應用。

由于t2d成為多種癌癥(包括hcc，前列腺癌和胰腺癌)的重要危險因素，更多的研究集中在抗糖尿病藥物的腫瘤調節(jié)功能。例如，二甲雙胍(t2d治療的一線藥物)據報道降低hcc風險，并發(fā)現噻唑烷二酮可降低t2d患者的肝癌和結腸直腸癌發(fā)病率。在這里，我們集中于t2d相關的hcc，并且顯示ex-4在體內和體外都表現出抗腫瘤發(fā)生作用(圖1-2,5a-b)。盡管已知ex-4可改善糖尿病并發(fā)癥，但應注意，ex-4的腫瘤抑制效應不僅僅依賴于致腫瘤發(fā)生的代謝狀況如高血糖和肝脂肪變性的抑制。這一觀點得到我們的體內數據的支持，ex-4治療也減弱了lflc喂養(yǎng)的小鼠中的腫瘤發(fā)展，而沒有顯著改變它們的葡萄糖耐量(圖1b-c)。此外，我們還確定ex-4在den誘導的hcc(m/db瘦小鼠)和hbx誘導的hcc(hbx-轉基因小鼠)中的腫瘤抑制效應(補充圖1)。此外，在沒有另外的脂質補充物的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hepg2和huh7細胞也響應于ex-4，并顯示顯著降低的增殖(圖5a-b)。這些數據顯示ex-4可以在高血糖肥胖和正常血糖貧乏條件下抑制肝癌發(fā)生。

hcc形成是細胞增殖和凋亡失調的結果。在這里我們確定ex-4以組織特異性方式影響這兩種細胞過程。我們的體內數據清楚地證明了ex-4在腫瘤中而不在非腫瘤組織中的抗增殖和促凋亡作用(圖2)。我們假設ex-4的這種腫瘤特異性功能歸因于glp-1r在不同組織中的差異表達?；谝郧暗难芯浚琯lp-1r在人體中廣泛表達，但其在肝中的表達仍在爭論中。enref_38我們進行qrt-pcr以檢查glp-1r的mrna表達，在肝癌組織和細胞系中glp-1r的高表達(圖3a-b)。與我們的假設一致，與glp-1r缺陷型bel-7402和plc5細胞(數據)相比，ex-4的抗腫瘤作用在glp-1r豐富的hepg2和huh7細胞中最突出(圖5-6)未示出)。雖然腫瘤樣品具有更高的glp-1r表達，但是應該注意到，在沒有ex-4處理的情況下，glp-1r相關的信號傳導在腫瘤中沒有顯著活化，如通過非腫瘤和腫瘤組織(圖3c-d)。這些集體的結果表明ex-4的抗腫瘤活性由glp-1r介導，其可以作為預測和監(jiān)測ex-4在糖尿病hcc患者中的反應的生物標志物。

以前的研究報道了camp和pka在不同癌癥中的多效性作用。盡管細胞內camp含量顯示抑制hcc發(fā)展(38)，但是pkc在hcc中的功能仍然是有爭議的。據報道，pka的上調可抑制hcc形成(39)。然而，其他研究顯示pka的抑制減少了前列腺素e2誘導的肝癌細胞的粘附和遷移率。pka在癌癥發(fā)展中的不同作用可能是由于在亞細胞微區(qū)中分離的pka的不均勻活化通過pka錨定蛋白。在這項研究中，我們確定了pka活性的ex-4依賴性上調與其上游因子camp的誘導(圖3c)，并且這兩種事件與體內腫瘤多樣性的減少相關(圖3，1f-g)。特別重要的是，對camp和pka活性的ex-4的刺激限于腫瘤而不是非腫瘤組織(圖3c-f)，證明了ex-4的腫瘤特異性效應。這個信息與先前報道的camp在hcc中的抗腫瘤發(fā)生作用一致，并且支持pka保護肝臟抵抗hcc形成的觀念。

egfr被發(fā)現是突變體組成型活性致癌v-erbb酪氨酸激酶的原癌基因。臨床研究先前已證明egfr在40％至70％的hcc患者中的上調，并且egfr抑制劑顯示在人肝癌細胞和大鼠肝癌發(fā)生模型中發(fā)揮強拮抗作用。我們的研究提供了體內和體外證據，egfr-stat3失活有助于ex-4的抗腫瘤作用(圖4-6)?；虮磉_分析顯示ex-4處理的小鼠具有多個stat3調節(jié)的基因(例如c-myc，細胞周期蛋白d1，存活蛋白，bcl-2和bcl-xl)的較低表達。這些基因與肝癌預后差，臨床病理特征和存活率高度相關。egfr-stat3-bcl-xl軸的功能重要性已經通過在頸部和頭部癌癥的鱗狀細胞癌中聯合靶向這三種分子的增強的抗腫瘤效應來證明。這些基因的抑制與ex-4的抗腫瘤效應和由ex-4調節(jié)的stat3信號傳導證實。

總之，我們已經確定ex-4在肥胖依賴性和非依賴性hcc中的保護作用，其中ex-4調節(jié)camp-pka-egfr-stat3分子軸以組織特異性方式抵消肝癌發(fā)生。鑒于這些重要的發(fā)現和ex-4在糖尿病患者中的良好確立的益處，未來的研究有必要驗證ex-4治療與降低的hcc風險在不同臨床隊列中的關聯。此外，精益小鼠hcc模型中ex-4的分子表征是必要的，以描繪glp-1r激活在無糖尿病hcc中的抗腫瘤機制，這將有助于確定glp-1r激動劑作為新型hcc-靶向藥物。

以下為上述實施例的附圖說明。

圖1-ex-4處理在體內抑制den誘導的hcc形成。(a)實驗方案。(b)ex-4改善了用hfhc飲食喂養(yǎng)的小鼠的血糖控制，如ogtt結果所示。(c)計算ogtt曲線下面積(auc)，并以平均值±sem表示。(d)ex-4處理改善了血清甘油三酯，膽固醇和空腹胰島素水平。(e)ex-4減弱hfhc誘導的體重增加和肝腫大。(f)代表性圖片顯示在ex-4處理的小鼠的肝臟中較少的腫瘤結節(jié)。(g)在具有l(wèi)flc或hfhc飲食的小鼠中，ex-4減少了腫瘤數目和總腫瘤重量。數據表示為平均值±sem。(b-c)，每組n＝7。(d-g)n＝10/組。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

圖2-ex-4處理降低腫瘤細胞增殖并增強凋亡。(a)ki67染色和(b)tunel染色在具有不同飲食和處理的小鼠的非腫瘤(nt)和腫瘤(t)切片上進行。陽性染色細胞的百分比表示為平均值±sem。*p<0.05；*p<0.01。

圖3-ex-4刺激hcc中的glp-1r信號傳導。(a)與非腫瘤(nt)樣品相比，腫瘤(t)樣品中glp-1r表達增強。(b)2個永生化肝細胞(白色柱)和6個肝癌細胞系(黑色柱)中的glp-1rmrna水平。通過lo2和個體hcc細胞系之間的比較計算統(tǒng)計學顯著性。(c-d)ex-4僅在(c)腫瘤而非(d)非腫瘤中激活c-amp和pka信號傳導。結果表示為camp含量或pka活性對蛋白質量。(e)腫瘤(t)和(f)非腫瘤(nt)裂解物中不同的(e-f)ex-4調節(jié)的pka催化亞基(pka-c)。代表性印跡顯示在左圖中，并且?guī)姸榷勘硎緸樵谟覉D中的磷酸化對總蛋白(p/t)比。數據以平均值±sem表示。(a)每組n＝10。(b)在每個hcc細胞系中一式三份。(c-f)n＝4或5每組。*p<0.05，**p<0.01。

圖4-ex-4使來自hfhc喂養(yǎng)的小鼠的腫瘤中的egfr-stat3信號傳導失活。(a)與非腫瘤組織相比，腫瘤中egfr-stat3信號傳導增強。左圖中顯示了來自hfhc喂養(yǎng)的小鼠的配對的非腫瘤(nt)和腫瘤(t)樣品中的egfr(y1173，y1068)和stat3(y705)磷酸化的代表性蛋白質印跡，并且?guī)姸榷勘硎緸榱姿峄偟鞍?p/t)比率。(b)ex-4降低y1173和y1068處的egfr磷酸化，以及腫瘤裂解物中y705處的stat3磷酸化。(c)在腫瘤樣品(pbs組中n＝10；ex-4組中n＝7)中，stat3靶向基因的蛋白和mrna表達水平被ex-4抑制，數據顯示為平均值±sem。*p<0.05；**p<0.01。

圖5-ex-4治療停止hepg2和huh7細胞生長伴隨egfr信號傳導的抑制。(a-b)ex-4處理以mtt測定顯示的(a)劑量和(b)時間依賴性方式降低hepg2或huh7細胞數目。(c)劑量-和(d)時間依賴性ex-4處理后，(c-d)egfr(y1173)和stat3(y705)磷酸化被抑制。定量條帶強度，相對于總蛋白的水平標準化，并且表示為與空白或時間零組相比的倍數變化。數據表示為來自三個單獨實驗的平均值±sem。*p<0.05；**p<0.01。

圖6-pka和egfr活性介導ex-4對stat3活化和肝癌細胞生長的抑制作用。(a-b)通過h89處理的pka的失活減弱了hepg2和huh7細胞中egfr(y1173)和stat3(y705)磷酸化的ex-4-依賴性抑制。(c)通過h89處理減弱ex-4處理的活細胞減少。將結果計算為與dmso處理的細胞相比的細胞生長的百分比，并且表示為來自三個單獨實驗的平均值±sem。(d-e)在hepg2和huh7細胞中egfr過表達消除了ex-4對stat3磷酸化的抑制。(f)ex-4處理的活細胞減少在egfr過表達的hepg2和huh7細胞中減弱。(g)描述了ex-4在肝臟中的抗腫瘤發(fā)生作用的示意圖。*p<0.05；**p<0.01。

綜上所述，本發(fā)明的有益效果在于：施用ex-4在瘦和肥胖den處理的小鼠中顯著降低hcc多樣性，其中抑制的增殖和誘導的細胞凋亡被限制于腫瘤細胞。ex-4的抗腫瘤發(fā)生作用與glp-1r的高表達和camp和pka的活化有關。重要的是，ex-4也下調egfr和stat3，其位于camp-pka信號傳導的下游，導致包括c-myc，細胞周期蛋白d1，存活蛋白，bcl-2和bcl-x1的多個stat3靶向基因的抑制。ex-4的生長抑制作用在glp-1r豐富的肝癌細胞系hepg2和huh7中一致，其中pka和egfr兩者在介導ex-4功能中發(fā)揮必要的作用?？傊?，ex-4通過camp-pka-egfr-stat3信號傳導引起針對肥胖依賴性和非依賴性hcc的保護功能，表明其作為減少糖尿病患者中的hcc風險的新方法的施用。

以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內容所作的等同變換，或直接或間接運用在相關的技術領域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內。