本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種高血氨影響大鼠腦內(nèi)凋亡基因表達(dá)的模型及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù):
大量研究表明,凋亡(即程序性死亡)參與多種原因?qū)е碌纳窠?jīng)系統(tǒng)損害病理過程,如腦缺血、缺氧性損害等。氨中毒學(xué)說在肝性腦病的發(fā)病機(jī)制中占重要地位,氨對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用主要是通過干擾腦的能量代謝實(shí)現(xiàn),且課題組前期工作證實(shí)其導(dǎo)致一定程度的認(rèn)知功能的障礙。但目前已有的研究集中在氨對(duì)大腦代謝及功能影響方面,而關(guān)于氨對(duì)大腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響鮮有報(bào)道,Bcl-2和Bax是傳統(tǒng)的凋亡相關(guān)因子,在其他腦病方面的研究較多,已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí),Bcl-2和Bax在一些病理狀態(tài)下如缺血、缺氧時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。由于關(guān)于氨中毒時(shí)腦組織細(xì)胞凋亡的研究較少,因此針對(duì)該模型的這兩個(gè)凋亡相關(guān)因子的研究可以完善氨中毒時(shí)腦組織細(xì)胞凋亡相關(guān)理論,為后續(xù)的治療方面提供理論支持。
綜上所述,目前已有的研究集中在氨對(duì)大腦代謝及功能影響方面,而關(guān)于氨對(duì)大腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響屬于技術(shù)空白。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供一種高血氨影響大鼠腦內(nèi)凋亡基因表達(dá)的模型及其構(gòu)建方法,旨在解決目前已有的研究集中在氨對(duì)大腦代謝及功能影響方面,而關(guān)于氨對(duì)大腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響屬于技術(shù)空白的問題。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的,一種高血氨影響大鼠腦內(nèi)凋亡基因表達(dá)的模型,所述高血氨影響大鼠腦內(nèi)凋亡基因表達(dá)的模型為:40只雄性SD大鼠,隨機(jī)分為兩組,每組20只:正常對(duì)照組,高血氨模型組;水迷宮試驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能,大鼠麻醉后,分離血漿檢測(cè)血氨,大鼠腦組織一部分4%多聚甲醛固定,一部分-80℃保存;Tunel試劑盒檢測(cè)大鼠腦組織凋亡情況;RT-qPCR檢測(cè)大鼠腦組織Bcl-2、Bax基因的表達(dá)。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述高血氨影響大鼠腦內(nèi)凋亡基因表達(dá)的模型的構(gòu)建方法,所述高血氨影響大鼠腦內(nèi)凋亡基因表達(dá)的模型的構(gòu)建方法包括以下步驟:
步驟一,40只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照隨機(jī)原則分為2組:A組,正常對(duì)照組;B組,高血氨模型組,每組20只;B組:每只大鼠腹腔內(nèi)注射5%氯化銨,劑量為0.5ml/100g,每周前4天每天1次。A組:作為對(duì)照,腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.5ml/100g;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥四周建立高血氨模型;
步驟二,第五實(shí)驗(yàn)周開始水迷宮實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)前后均稱量體重;每天上、下午兩段固定時(shí)間進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn),一共5天;
步驟三,將大鼠面向水池壁,從4個(gè)象限固定的入水點(diǎn)按順序分別放入池中,之后立即采用遮光簾和間接光源,攝像頭及視頻圖像采集系統(tǒng)可自動(dòng)記錄大鼠尋找平臺(tái)過程中的游泳軌跡及時(shí)間;
步驟四,水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠,下腔靜脈采到的血標(biāo)本放入肝素抗凝試管顛倒幾次,迅速置入冰??;腦組織分離皮層與海馬組織,一部分置入4%多聚甲醛溶液。一部分超低溫冰箱保存;
步驟五,經(jīng)肝素抗凝的大鼠全血置入加蓋EP管低溫3500rpm離心5min,分離得血漿,強(qiáng)生VITRO S350生化分析儀檢測(cè)血氨。
進(jìn)一步,當(dāng)大鼠爬上平臺(tái)時(shí),水迷宮視頻分析系統(tǒng)能夠立即計(jì)算出Time值和distance值;每次大鼠到達(dá)平臺(tái)后,讓其在平臺(tái)上停留30秒;如果在訓(xùn)練中大鼠超過120s不能找到平臺(tái),引導(dǎo)至平臺(tái),并停留30秒鐘;將水迷宮實(shí)驗(yàn)的最后一次訓(xùn)練的學(xué)習(xí)記憶參數(shù)作為水迷宮的最終結(jié)果。
進(jìn)一步,高血氨模型大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡增加,由于腦組織內(nèi)多因子作用的結(jié)果,Bcl-2、Bax凋亡基因表達(dá)平衡失調(diào)所致為重要機(jī)制。
本發(fā)明提供的高血氨影響大鼠腦內(nèi)凋亡基因表達(dá)的模型及其構(gòu)建方法,探討高血氨大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡的的分子機(jī)制;方法:40只雄性SD大鼠,隨機(jī)分為兩組,每組20只:正常對(duì)照組(A組),高血氨模型組(B組)。水迷宮試驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能,大鼠麻醉后,分離血漿檢測(cè)血氨,大鼠腦組織一部分4%多聚甲醛固定,一部分超低溫(-80℃)保存;Tunel試劑盒檢測(cè)大鼠腦組織凋亡情況;RT-qPCR檢測(cè)大鼠腦組織Bcl-2、Bax基因的表達(dá)。結(jié)果:與正常對(duì)照組比較,高血氨模型組大鼠血氨水平明顯升高,行為學(xué)試驗(yàn)表現(xiàn)為平均逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)和游泳總路程增加(P<0.05),提示學(xué)習(xí)記憶能力下降。高血氨模型組大鼠腦組織凋亡指數(shù)升高(P<0.05),并且該組大腦皮層、海馬Bcl-2基因表達(dá)均下降(P<0.05),而Bax基因表達(dá)亦均升高(P<0.05)。結(jié)論:高血氨模型大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡增加,可能是由于腦組織Bcl-2、Bax等凋亡基因表達(dá)平衡失調(diào)所致。
附圖說明
圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的高血氨影響大鼠腦內(nèi)凋亡基因表達(dá)的模型的構(gòu)建方法流程圖。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白,以下結(jié)合實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解,此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明,并不用于限定本發(fā)明。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
如圖1所示,本發(fā)明實(shí)施例提供的高血氨影響大鼠腦內(nèi)凋亡基因表達(dá)的模型的構(gòu)建方法包括以下步驟:
S101:40只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照隨機(jī)原則(統(tǒng)計(jì)學(xué)隨機(jī)數(shù)字表法)分為2組:A組(正常對(duì)照組)、B組(高血氨模型組),每組20只。B組:每只大鼠腹腔內(nèi)注射5%氯化銨,劑量為0.5ml/100g,每周前4天每天1次。A組:作為對(duì)照,腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.5ml/100g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥四周建立高血氨模型;
S102:第五實(shí)驗(yàn)周開始水迷宮實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)前后均稱量體重。每天上、下午兩段固定時(shí)間進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn),一共5天;
S103:將大鼠面向水池壁(水池含墨色顏料),從4個(gè)象限固定的入水點(diǎn)按順序分別放入池中,之后立即采用遮光簾和間接光源(避免光對(duì)圖像采集時(shí)的干擾),攝像頭及視頻圖像采集系統(tǒng)可自動(dòng)記錄大鼠尋找平臺(tái)過程中的游泳軌跡及時(shí)間,當(dāng)大鼠爬上平臺(tái)時(shí),水迷宮視頻分析系統(tǒng)能夠立即計(jì)算出Time值(平均逃避潛伏期)和distance值(游泳總距離),此兩種指標(biāo)反映學(xué)習(xí)記憶功能用兩個(gè)參數(shù)。每次大鼠到達(dá)平臺(tái)后,讓其在平臺(tái)上停留30秒;如果在訓(xùn)練中大鼠超過120s不能找到平臺(tái),就引導(dǎo)其至平臺(tái),并停留30秒鐘。將水迷宮實(shí)驗(yàn)的最后一次訓(xùn)練的學(xué)習(xí)記憶參數(shù)作為水迷宮的最終結(jié)果。注意要操作輕柔,避免不必要的應(yīng)激刺激。每天水迷宮結(jié)束后盡量將大鼠的毛發(fā)干燥;
S104:水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠,下腔靜脈采到的血標(biāo)本放入肝素抗凝試管輕輕顛倒幾次(避免劇烈搖晃,防止溶血),迅速置入冰浴(盡快送檢)。腦組織分離皮層與海馬組織,一部分置入4%多聚甲醛溶液。一部分超低溫冰箱保存;
S105:經(jīng)肝素抗凝的大鼠全血置入加蓋EP管低溫3500rpm離心5min,分離得血漿,強(qiáng)生VITRO S350生化分析儀檢測(cè)血氨。
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。
本實(shí)驗(yàn)擬觀察高血氨大鼠腦內(nèi)凋亡因子的的表達(dá)變化,并進(jìn)一步探討腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡與學(xué)習(xí)記憶能力下降的聯(lián)系,具體步驟如下:
1 材料和方法
1.1 主要材料
40只大鼠(雄性,清潔級(jí),體重180~200克,Sprague-Dawley系),由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證SCXK浙2010-0150);氯化銨粉劑(分析純級(jí),無錫市民豐試劑廠)。Tunel試劑盒購自羅氏公司;RNA提取試劑(Trizo)購自Sigma公司;bcl-2和bax引物對(duì)(PAGE純化方式)由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成,cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自fermantas公司,熒光PCR試劑(產(chǎn)品型號(hào)SYBR GreenⅠMaster)購自羅氏公司。
1.2 動(dòng)物分組和高血氨模型制造
40只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照隨機(jī)原則(統(tǒng)計(jì)學(xué)隨機(jī)數(shù)字表法)分為2組:A組(正常對(duì)照組)、B組(高血氨模型組),每組20只。B組:每只大鼠腹腔內(nèi)注射5%氯化銨,劑量為0.5ml/100g,每周前4天每天1次。A組:作為對(duì)照,腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.5ml/100g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥四周建立高血氨模型。
1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)
第五實(shí)驗(yàn)周開始水迷宮實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)前后均稱量體重。每天上、下午兩段固定時(shí)間進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn),一共5天。操作方法:將大鼠面向水池壁(水池含墨色顏料),從4個(gè)象限固定的入水點(diǎn)按順序分別放入池中,之后立即采用遮光簾和間接光源(避免光對(duì)圖像采集時(shí)的干擾),攝像頭及視頻圖像采集系統(tǒng)可自動(dòng)記錄大鼠尋找平臺(tái)過程中的游泳軌跡及時(shí)間,當(dāng)大鼠爬上平臺(tái)時(shí),水迷宮視頻分析系統(tǒng)能夠立即計(jì)算出Time值(平均逃避潛伏期)和distance值(游泳總距離),此兩種指標(biāo)反映學(xué)習(xí)記憶功能用兩個(gè)參數(shù)。每次大鼠到達(dá)平臺(tái)后,讓其在平臺(tái)上停留30秒;如果在訓(xùn)練中大鼠超過120s不能找到平臺(tái),就引導(dǎo)其至平臺(tái),并停留30秒鐘。將水迷宮實(shí)驗(yàn)的最后一次訓(xùn)練的學(xué)習(xí)記憶參數(shù)作為水迷宮的最終結(jié)果。注意要操作輕柔,避免不必要的應(yīng)激刺激。每天水迷宮結(jié)束后盡量將大鼠的毛發(fā)干燥。
1.4.動(dòng)物標(biāo)本收集及血氨的檢測(cè)
水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠,下腔靜脈采到的血標(biāo)本放入肝素抗凝試管輕輕顛倒幾次(避免劇烈搖晃,防止溶血),迅速置入冰浴(盡快送檢)。腦組織分離皮層與海馬組織,一部分置入4%多聚甲醛溶液。一部分超低溫冰箱保存。
經(jīng)肝素抗凝的大鼠全血置入加蓋EP管低溫3500rpm離心5min,分離得血漿,強(qiáng)生VITRO S350生化分析儀檢測(cè)血氨。
1.5 神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)
腦組織用4%的多聚甲醛固定24小時(shí),常規(guī)梯度酒精慢脫水后石蠟包埋。蠟塊連續(xù)冠狀切片,厚4μm,載玻片預(yù)先用多聚-L-賴氨酸處理。
腦組織凋亡檢測(cè)按照TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明操作。
光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞:凋亡細(xì)胞核中有棕黃色顆粒。高倍視野(×400)下觀察凋亡細(xì)胞數(shù),隨機(jī)計(jì)算5個(gè)視野,每個(gè)視野數(shù)100個(gè)細(xì)胞,凋亡細(xì)胞所占的百分率為凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)。
1.6 RT-qPCR
1.6.1 取低溫保存的大鼠腦組織20-30mg。Trizol法提取總RNA(超凈工作臺(tái)內(nèi)操作,臺(tái)面用DEPC水處理過)。根據(jù)總RNA濃度的公式計(jì)算RNA樣品濃度。
1.6.2 RT(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))
按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明方法將mRNA逆轉(zhuǎn)成cDNA。
1.6.3 引物合成
登錄Ensemble網(wǎng)站,分別找到bcl-2基因的cDNA序列(編號(hào)ENSRNOT00000016561)、bax基因cDNA序列(編號(hào)ENSRNOT00000028328)的,genetool軟件設(shè)計(jì)引物,bcl-2和bax引物對(duì)(PAGE純化方式)合成自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。
bcl-2引物對(duì):正鏈5-ccggcatctgcacacctgga-3,負(fù)鏈5-ccagagtgatgcaggccccc-3,產(chǎn)物為152bp。
bax引物對(duì):正鏈5-ggacccccacatggcagacagt-3,負(fù)鏈5-gcctttccccgttccccattcat-3,產(chǎn)物為164bp。
1.6.4 qPCR(Real time quantative PCR)
按兩步法在ABI 7900實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行,以β-actin為內(nèi)參照。20ul反應(yīng)體系,加入384孔板中冰上操作,每個(gè)樣品重復(fù)3次。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10min;95℃變性15s,60℃復(fù)性及延伸30s,45個(gè)cycle。ABI 7900HT型熒光定量PCR儀自帶SDS2.4分析軟件,得到域值循環(huán)數(shù)Ct值(threshold cyCle number,),計(jì)算目的基因相對(duì)內(nèi)參表達(dá)量。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以(±S)表示,使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,采用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù),P<0.05時(shí)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 各組大鼠血氨檢測(cè)結(jié)果
與A組(正常對(duì)照組)比較,B組(高血氨模型組)大鼠血氨水平明顯升高(P<0.05)(見表1)。
表1血氨水平和學(xué)習(xí)記憶參數(shù)(±S)
2.2 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶參數(shù)
Morris水迷宮試驗(yàn)中,B組大鼠較A組平均逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)和游泳總路程增加(P<0.05)(見表1),可見高血氨模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。
2.3 大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡檢測(cè)結(jié)果(見表2)
光鏡下TUNEL陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)見到棕黃色顆粒,各組大鼠腦組織未見明顯壞死病灶。
與A組(正常對(duì)照組)比較,B組(高血氨模型組)大鼠腦海馬組織、皮層組織細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.05);
表2兩組大鼠腦內(nèi)凋亡情況比較(±S)
2.4 RT-qPCR檢測(cè)大鼠腦組織bcl-2基因mRNA結(jié)果(見表3)
B組(高血氨模型組)海馬組織、皮層組織bcl-2基因mRNA表達(dá)較A組(正常對(duì)照組)均明顯下降(P<0.05)。
表3兩組大鼠腦組織bcl-2基因表達(dá)情況(±S)
2.5 RT-qPCR檢測(cè)bax基因mRNA結(jié)果(見表4)
B組(高血氨模型組)海馬組織、皮層組織bax基因mRNA表達(dá)較A組(正常對(duì)照組)均明顯升高(P<0.05)。
表4兩組大鼠腦組織bax基因表達(dá)情況(±S)
氨對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性作用,既往研究表明氨主要是通過干擾腦的能量代謝發(fā)揮作用。在本發(fā)明Morris水迷宮試驗(yàn)中,高血氨模型組大鼠平均逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)和游泳總距離增加(P<0.05)。證實(shí)了高血氨可導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的下降。凋亡是神經(jīng)元死亡的另一種重要形式,神經(jīng)元凋亡對(duì)其功能的變化的影響也備受關(guān)注。腦組織在缺血缺氧等病理情況下,學(xué)習(xí)記憶功能受影響,而且其腦組織神經(jīng)元凋亡增加。在本發(fā)明中,采用末端轉(zhuǎn)移標(biāo)記技術(shù)(TUNEL法)檢測(cè)大鼠腦組織的凋亡情況。研究結(jié)果顯示,高血氨模型組大鼠腦海馬組織、皮層組織細(xì)胞凋亡都較正常對(duì)照組明顯增多(P<0.05)。由此可見,已被明確干擾腦組織能量代謝的氨,也影響著腦組織中的神經(jīng)元的凋亡發(fā)生。因此明確其機(jī)制有重要意義。Bcl-2基因目前被認(rèn)為是一種重要的內(nèi)源性抗凋亡因子,通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡:包括維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)、抗氧化作用、抑制凋亡蛋白酶的激活、保持線粒體膜的穩(wěn)定性等[9]。有學(xué)者建立低O2高CO2模型探討B(tài)cl-2基因表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bcl-2表達(dá)下降,未能有效的抑制凋亡,則細(xì)胞繼而發(fā)生凋亡,說明Bcl-2基因表達(dá)對(duì)阻止低氧引起的神經(jīng)元凋亡起重要作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在凋亡發(fā)生增加的高血氨模型組,腦組織中無論是海馬組織,還是皮層組織,bcl-2基因表達(dá)較正常對(duì)照組均明顯下降??梢娫诘陌庇绊懴?,凋亡發(fā)生的機(jī)制與抗凋亡因子bcl-2表達(dá)下降有關(guān)。Bax是Bcl-2家族中最重要的死亡促進(jìn)基因,其可能促凋亡機(jī)制為:不僅使抗凋亡蛋白喪失對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用,而且引起各種促凋亡因子的釋放,此外,還能夠增加靶細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性,從而導(dǎo)致引起細(xì)胞器功能的喪失和細(xì)胞凋亡。本發(fā)明對(duì)腦組織中的bax基因mRNA表達(dá)做了檢測(cè),結(jié)果顯示在凋亡發(fā)生增加的高血氨模型組,腦組織中無論是海馬組織,還是皮層組織,bax基因表達(dá)較正常對(duì)照組均明顯增加,也證實(shí),在凋亡增加的組織內(nèi),促凋亡因子bax的表達(dá)起了重要作用。
因此,綜上所述,高血氨模型大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡增加,是由于腦組織內(nèi)多因子作用的結(jié)果,Bcl-2、Bax等凋亡基因表達(dá)平衡失調(diào)所致為其重要機(jī)制。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。