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N15多肽在制備細(xì)菌抑制劑中的用途的制作方法

文檔序號(hào):12343149閱讀:553來源:國知局
N15多肽在制備細(xì)菌抑制劑中的用途的制作方法與工藝

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,具體指N15多肽在制備細(xì)菌抑制劑中的用途。



背景技術(shù):

人體中存在著很多種類的細(xì)菌,其中有些是有益菌,有益菌對(duì)維持人體微生環(huán)境有著重要的作用,還有些細(xì)菌則是致病菌,能引起人類疾病。細(xì)菌在人體內(nèi)寄生,增殖并引起疾病的特性稱為細(xì)菌的致病性或病原性(pathogenicity)。病原菌的致病作用與其毒力、侵入機(jī)體的數(shù)量、侵入途徑及機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。例如,大腸桿菌寄居于腸道內(nèi),它的單獨(dú)致病力不大,若和其他致病菌在一起時(shí),可造成嚴(yán)重的混合感染,常見的致病菌還有金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等。

藍(lán)藻之所以又稱藍(lán)細(xì)菌,是因?yàn)樗{(lán)藻是最原始、最古老的藻類.其結(jié)構(gòu)簡單,無典型的細(xì)胞核,所以又稱藍(lán)細(xì)菌,屬于原核生物。已知藍(lán)藻約2000種,中國已有記錄的約900種。藍(lán)藻有極大的適應(yīng)性,分布很廣。在一些營養(yǎng)豐富的水體中,有些藍(lán)藻常于夏季大量繁殖,并在水面形成一層藍(lán)綠色而有腥臭味的浮沫,稱為“水華”,大規(guī)模的藍(lán)藻爆發(fā),被稱為“綠潮”(和海洋發(fā)生的赤潮對(duì)應(yīng))。綠潮引起水質(zhì)惡化,嚴(yán)重時(shí)耗盡水中氧氣而造成魚類的死亡。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的在于提供一種多肽,該多肽能夠抑制多種致病菌和藍(lán)藻生長,具有制備細(xì)菌抑制劑的用途,它已被現(xiàn)有技術(shù)公開,名為N15多肽。

N15多肽是一個(gè)具有15個(gè)氨基酸的短肽,其序列為甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天門冬氨酸-脯氨酸,它具有多種生物學(xué)功能,包括調(diào)節(jié)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合目的基因的能力,影響NF-κB目的基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá);阻斷PCNA結(jié)合DNA聚合酶,從而阻止細(xì)胞DNA合成抑制細(xì)胞增殖;抑制上皮細(xì)胞增生,調(diào)節(jié)表皮增生及分化,使皮膚角化過程正?;?。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在研究中發(fā)現(xiàn)N15可以對(duì)多種革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、藍(lán)細(xì)菌的生長產(chǎn)生抑制作用。經(jīng)試驗(yàn)檢測,N15多肽抑制藍(lán)藻增殖可能是通過抑制DNA復(fù)制和異形胞分化基因的表達(dá),起到抑制藍(lán)藻增殖的。

本發(fā)明還提供了一種N15多肽制備的抗細(xì)菌藥物,為N15多肽的水溶液,濃度大于等于100μg/mL。

本發(fā)明的有益效果:N15多肽是一種結(jié)構(gòu)清晰,易于工業(yè)化生產(chǎn)的多肽,它可以抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、魚腥藍(lán)細(xì)菌等多種細(xì)菌的增殖,效果好且無毒副作用。

附圖說明

圖1為N15對(duì)大腸桿菌的抑菌曲線。

圖2為流式細(xì)胞儀檢測N15對(duì)金黃色葡萄球菌DNA含量的影響。

圖3為N15對(duì)魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120的抑菌曲線。

圖4為缺氮誘導(dǎo)48小時(shí)對(duì)照組和N15實(shí)驗(yàn)組魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC7120異形胞的分化情況。

圖5為熒光定量RT-PCR檢測N15對(duì)藍(lán)藻hetR基因mRNA表達(dá)量的影響。

圖6為熒光定量RT-PCR檢測N15對(duì)藍(lán)藻ntcA基因mRNA表達(dá)量的影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的論證說明,以下實(shí)驗(yàn)例僅是對(duì)本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實(shí)驗(yàn)例。

實(shí)驗(yàn)例1:N15抑制了大腸桿菌的生長

實(shí)驗(yàn)方法:

在液體培養(yǎng)基中,微生物隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而不斷增加,逐漸使培養(yǎng)基混濁,這一變化,可以用分光光度計(jì)測定,并可根據(jù)不同的時(shí)間里測定的數(shù)值而做出該種微生物的生長曲線。

以LB液體培養(yǎng)基作為空白,在分光光度計(jì)上調(diào)零點(diǎn)。從0時(shí)開始,添加N15至終濃度為500μg/mL,每隔2h測定液體LB培養(yǎng)液的OD600(波長600nm處的吸光度),同時(shí)設(shè)置不添加N15的菌株作為對(duì)照。以時(shí)間為橫坐標(biāo),以O(shè)D值為縱坐標(biāo),制作曲線,即為N15多肽對(duì)大腸桿菌的抑菌曲線,結(jié)果如圖1所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,加入N15多肽至終濃度為500μg/mL的大腸桿菌的生長和不加入N15的對(duì)照菌株比較,受N15多肽抑制大腸桿菌的生長較為緩慢,加入N15對(duì)大腸桿菌的生長具有抑制作用。

實(shí)驗(yàn)例2:N15對(duì)金黃色葡萄球菌的生長具有抑制作用

實(shí)驗(yàn)方法:

取金黃色葡萄球菌菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上,37℃下活化培養(yǎng),用接種環(huán)從斜面上挑菌到無菌水中制成菌懸液,接種培養(yǎng)無菌操作下,用取液器吸取100μL體積的菌液到滅菌小離心管中,充分混勻后,迅速注入到滅菌平皿中,在平板中加入N15多肽,以同體積的無菌水的混合液注入作空白,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí),觀察菌落生長情況,并對(duì)菌落計(jì)數(shù),結(jié)果見表1。

表1.N15對(duì)金黃色葡萄球菌生長抑制結(jié)果對(duì)照表

結(jié)果顯示,和對(duì)照相比,加入N15多肽的平板上金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)明顯減少,N15對(duì)金黃色葡萄球菌的生長具有抑制效應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)例3:N15對(duì)金黃色葡萄球菌的DNA復(fù)制具有抑制效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)方法:

制備YEPD液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)金黃色葡萄球菌,并加入N15到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基中,同時(shí)設(shè)置不加N15多肽的金黃色葡萄球菌作為對(duì)照(control),加入N15多肽(終濃度500μg/mL),在處理2小時(shí)分別取樣2mL金黃色葡萄球菌菌體,加入Sytox-Green染料對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞DNA染色后,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行金黃色葡萄球菌的DNA相對(duì)含量進(jìn)行測定,結(jié)果見圖2。

如實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示,橫坐標(biāo)表示單個(gè)金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)DNA的含量,縱坐標(biāo)表示酵母細(xì)胞數(shù)量。在N15處理2小時(shí)內(nèi),N15處理細(xì)胞內(nèi)的DNA含量和對(duì)照細(xì)胞相比沒有顯著性差異,而隨著時(shí)間的增加,在N15處理15小時(shí)以后,N15處理細(xì)胞內(nèi)的DNA含量和對(duì)照細(xì)胞相比明顯減少。該結(jié)果表明N15會(huì)引起金黃色葡萄球菌細(xì)胞DNA含量的減少。

實(shí)驗(yàn)例4:N15對(duì)沙門氏菌的生長具有抑制作用

實(shí)驗(yàn)方法:

取沙門氏菌菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上,37℃下活化培養(yǎng),用接種環(huán)從斜面上挑菌到無菌水中制成菌懸液,接種培養(yǎng)無菌操作下,用取液器吸取100μL體積的菌液到滅菌小離心管中,充分混勻后,迅速注入到滅菌平皿中,在平板中加入N15多肽,以同體積的無菌水的混合液注入作空白,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí),觀察菌落生長情況,并對(duì)菌落計(jì)數(shù),結(jié)果見表2。

表2.N15對(duì)沙門氏菌生長抑制結(jié)果對(duì)照表

結(jié)果顯示,和對(duì)照相比,加入N15多肽的平板上沙門氏菌的菌落數(shù)明顯減少,N15對(duì)沙門氏菌的生長具有抑制效應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)例5:N15抑制了魚腥藍(lán)細(xì)菌的生長

實(shí)驗(yàn)方法:

將魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120在液體BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD750(波長750nm處的吸光度)在0.3~0.4左右,添加N15至終濃度為100μg/mL,同時(shí)設(shè)置不添加N15的菌株作為對(duì)照。每隔24小時(shí)用分光光度計(jì)測定菌液的OD750,連續(xù)測定8天后根據(jù)數(shù)據(jù)繪制N15的抑菌曲線,結(jié)果如圖3所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,加入N15多肽至終濃度為100μg/mL的魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120的生長和不加入N15的對(duì)照菌株比較,受N15多肽抑制魚腥藍(lán)細(xì)菌的生長較為緩慢,加入N15對(duì)魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120的生長具有抑制作用。

實(shí)驗(yàn)例6:N15推遲了魚腥藍(lán)細(xì)菌的異形胞分化時(shí)間

實(shí)驗(yàn)方法:

魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120是一種絲狀細(xì)菌,其菌絲體能進(jìn)行光合作用。在環(huán)境中缺乏氮源的條件下,會(huì)分化出具有固氮功能的異形胞。為了觀察N15處理對(duì)異形胞發(fā)育的影響,本研究中在對(duì)魚腥藍(lán)細(xì)菌進(jìn)行缺氮處理的同時(shí),加入100ug/mL的N15,同時(shí)設(shè)置不加入N15的對(duì)照組,誘導(dǎo)后進(jìn)行顯微鏡觀察。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120的營養(yǎng)細(xì)胞在形成異形胞的過程中,產(chǎn)氧的光系統(tǒng)II復(fù)合物在異形胞中失活,因此在熒光顯微鏡下,只有營養(yǎng)細(xì)胞能夠發(fā)紅色熒光,而異形胞沒有熒光。在進(jìn)行缺氮誘導(dǎo)的同時(shí)加入100μg/mL的N15,分別在24小時(shí)、48小時(shí)候、72小時(shí)、96小時(shí)進(jìn)行顯微鏡觀察,結(jié)果顯示對(duì)照組的魚腥藍(lán)細(xì)菌在缺氮誘導(dǎo)24小時(shí)就有異形胞的產(chǎn)生,而加入N15的魚腥藍(lán)細(xì)菌直到96小時(shí)以后才有異形胞生成,缺氮誘導(dǎo)48小時(shí)的照片如圖4所示,加入N15的魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC 7120沒有異形胞產(chǎn)生,菌絲體的所有細(xì)胞在熒光顯微鏡下都發(fā)紅色熒光,而對(duì)照組菌絲有異形胞產(chǎn)生,這些異形胞在熒光顯微鏡下也沒有紅色熒光。由此我們得知,N15推遲了魚腥藍(lán)細(xì)菌PCC7120的異形胞發(fā)育生成的時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)例7:N15抑制了異形胞分化基因的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)方法:

為了觀察N15處理對(duì)異形胞發(fā)育的影響,本研究中在對(duì)魚腥藍(lán)細(xì)菌進(jìn)行缺氮處理的同時(shí),加入100μg/mL的N15,同時(shí)設(shè)置不加入N15的對(duì)照組,分別提取0hour、6hour、12hour、24hour的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每個(gè)樣品收集50mL菌體,提取RNA,并且用DNasel去除殘余的基因組DNA。利用紫外分光光度計(jì)對(duì)總RNA定量后,使用TakaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA。具體操作步驟參見產(chǎn)品說明書。用TakaRa公司的試劑盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit(Perfect Real Time)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR。具體操作參見產(chǎn)品說明書。分析軟件使用ROCHE LightCycler480進(jìn)行分析,定量方法為相對(duì)定量法。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

異形胞在發(fā)育過程中需要在許多基因的參與,其中hetR和ntcA基因是異形胞發(fā)育的關(guān)鍵基因,與異形胞發(fā)育的多個(gè)后期基因的轉(zhuǎn)錄激活依賴于hetR和ntcA。我們通過實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)檢測了N15對(duì)這幾個(gè)異形胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5和6所示。

和對(duì)照組相比,N15加入6hour、12hour、24hour后,較明顯的抑制了魚腥藍(lán)細(xì)菌中hetR和ntcA基因的表達(dá),由此我們得知N15對(duì)藍(lán)藻生長的抑制是通過抑制藍(lán)細(xì)菌中異形胞分化相關(guān)基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

N15多肽的抑菌效果可作用于革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、藍(lán)細(xì)菌,上述實(shí)施例僅為對(duì)細(xì)菌抑制劑的舉例,挑選了較有代表性的細(xì)菌,無法將所有細(xì)菌種類的抑制實(shí)驗(yàn)例一一列出,不因此限制本發(fā)明的范圍。

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