本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及表達TRAIL的溶瘤腺病毒聯(lián)合槲皮素在抑制肝癌癌細胞增殖中的用途。

背景技術(shù)：

肝細胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，其被列為全球第五最常見的癌癥，年死亡率超過50萬。

PCT/US2014/033675公開了用于治療包括原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌的各種癌癥的方法和組合物，同時涉及奎納克林在用于難治性肝癌的藥劑的制造中的用途。

PCT/US2008/081645提供用于治療肝癌的方法。這些方法包括給予包含修飾寡核苷酸的化合物，其中所述修飾寡核苷酸靶向miRNA。該發(fā)明還提供用于治療肝癌的組合物。這類組合物包括包含修飾寡核苷酸的化合物，其中所述修飾寡核苷酸靶向miRNA。該發(fā)明發(fā)現(xiàn)某些miRNA在肝癌(例如肝細胞癌)中過量表達，因此被選擇為由修飾寡核苷酸靶向。此外，該發(fā)明還發(fā)現(xiàn)某些miRNA在暴露于二惡英的肝細胞癌細胞中過量表達，進而被選擇為由修飾寡核苷酸靶向。

201080047449.3公開了通過給藥有效量的命名為ITE的對于芳基烴(Ah)受體(AhR)的內(nèi)源性配體或其類似物之一(活性成分)至患有癌癥的受試者，介入治療或根除癌癥的方法。通過測量給藥后受試者中所述活性成分的血液水平，確定其有效劑量和給藥頻率。將采用載體系統(tǒng)配制的活性成分局部地、腸內(nèi)地或腸胃外地施加至受試者。所述配制的藥物也可以與一種或多種其他癌癥治療藥一起給藥。在所述受試者擺脫癌癥后，提供維持給藥以確保根除癌癥。其中患有肝癌等癌癥的受試者優(yōu)選地接受治療。

腺病毒(Ad)首先由Wallace Rowe及其同事在1953年發(fā)現(xiàn)。由于在組織培養(yǎng)中Ad的致細胞病變效應，于1956年該病毒用于在臨床試驗研究中治療子宮頸癌。在過去二十年中，應用溶瘤病毒用已經(jīng)產(chǎn)生優(yōu)異的治療功效。大多數(shù)臨床和臨床前研究集中于溶瘤病毒修飾，以改進腫瘤轉(zhuǎn)導靶向、腫瘤特異性復制、腫瘤內(nèi)傳播、和抗病毒和抗腫瘤免疫應答的調(diào)節(jié)以及轉(zhuǎn)入外源基因。溶瘤病毒的修飾和溶瘤病毒的雜交工程是癌癥治療的特別有前景的新方法。使用溶瘤性Ad的病毒療法由于其高滴度，插入較大尺寸的治療基因的能力和在分裂和非分裂細胞中的高轉(zhuǎn)導效率而具有廣泛的臨床應用。重要的是，當溶瘤性Ad復制時，它們不將其基因組整合到宿主中；因此，它們不誘導致癌相關(guān)誘變。這些獨特的功能使得溶瘤Ad可以成為有效的基因載體，在基因傳遞方面具有最佳的安全性(和相關(guān)的溶瘤病毒，如溶瘤性逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒相比)。

目前，超過12種不同的溶瘤病毒正在進行針對不同類型癌癥的I期臨床試驗。溶瘤性Ad是迄今為止首次且最集中研究的溶瘤病毒，H101(缺失E1B55K基因的突變體)現(xiàn)已由中國食品和藥物管理局(CFDA)批準用于治療頭頸癌(Oncorine，上海雙威Biotech)。在以前的研究中，我們使用病毒療法策略開發(fā)了癌靶向基因(CTGVT)，并產(chǎn)生了一個新的E1B55K基因缺失溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL，其攜帶腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TRAIL)，該配體是腫瘤壞死因子超家族的成員并認為它是抗癌治療的新候選物。TRAIL可以選擇性誘導各種腫瘤細胞的凋亡，對周圍正常細胞的毒性可忽略不計。TRAIL在抑制腫瘤生長中的選擇性已經(jīng)在體外和體內(nèi)顯示。相比之下，TRAIL可以激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，導致拮抗死亡信號通路的基因的轉(zhuǎn)錄。不幸的是，由于TRAIL發(fā)揮的這種相反或調(diào)節(jié)作用，盡管其具有引人注目的抗腫瘤活性，但許多癌細胞也顯示對TRAIL的抗性。TRAIL參與通過NF-κB的凋亡信號的這種負反饋調(diào)節(jié)的實際機制尚未完全闡明。幸運的是，最近的研究表明，通過抑制存活信號和增殖基因的表達同時激活凋亡相關(guān)基因表達，與TRAIL和其他藥物或化學物質(zhì)的聯(lián)合治療可以協(xié)同增加各種腫瘤細胞中的細胞死亡或凋亡機制。

槲皮素(3,3'，4'，5,7-五羥基黃酮)是在多種水果和蔬菜中發(fā)現(xiàn)的主要膳食黃酮醇，包括洋蔥、蘋果皮、萵苣、花椰菜、辣椒、芹菜和未加糖的可可。槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗血管生成、抗增殖和促凋亡性質(zhì)，因此，可對抗癌癥的形成和進展。根據(jù)這些效應，通過其選擇性修飾與癌發(fā)生相關(guān)的信號傳導途徑以引起癌細胞死亡的能力，槲皮素導致細胞活力的降低，并且，誘導許多癌細胞(包括乳腺、結(jié)腸、肺、卵巢和前列腺癌)凋亡。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人首次證明ZD55-TRAIL和槲皮素可以在體外和體內(nèi)協(xié)同作用殺死HCC細胞。此外，我們的研究結(jié)果表明槲皮素顯著抑制由ZD55-TRAIL激活的NFκB通路，使得凋亡信號占優(yōu)勢。我們目前的研究表明，ZD55-TRAIL和槲皮素的聯(lián)合治療是一個新的實用治療策略。

為了更好的治愈肝癌或為治療肝癌提供另一種可行的選擇，提高患者的預后或者生活質(zhì)量，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，表達TRAIL的溶瘤腺病毒和槲皮素的組合對肝癌或肝癌細胞的增殖具有協(xié)同的治療或者抑制作用，進而為治療肝癌或抑制肝癌細胞的增殖提供了新的療法或手段。

本發(fā)明采用表達TRAIL的溶瘤腺病毒和槲皮素聯(lián)合抑制肝癌細胞增殖作用影響進行體外和體外實驗，結(jié)果顯示在表達TRAIL的溶瘤腺病毒和槲皮素兩者聯(lián)合應用具有協(xié)同抑制肝癌細胞增殖的作用。

本發(fā)明所述的表達TRAIL的溶瘤腺病毒可為攜帶TRAIL基因的復制型溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL(Han,X.,et al.,Synergistic combination of histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid and oncolytic adenovirus ZD55-TRAIL as a therapy against cervical cancer.Mol Med Rep,2015.12(1):p.435-41.)，其具有腫瘤復制特異性，對正常細胞無毒性。表達TRAIL的溶瘤腺病毒基因組結(jié)構(gòu)見圖1A。

因此，本發(fā)明一方面提供了表達TRAIL的溶瘤腺病毒在制備用于在受試者中治療肝癌或抑制肝癌細胞增殖的藥物組合物或藥盒中的用途，其中所述藥物組合物或藥盒含有表達TRAIL的溶瘤腺病毒和槲皮素，任選地，所述藥物組合物或藥盒還含有用于治療肝癌或抑制肝癌細胞增殖的其他藥物活性成分，例如吉西他濱、普樂沙福(AMD3100)或紫杉醇等。任選地，所述的藥物組合物或藥盒中的表達TRAIL的溶瘤腺病毒和槲皮素分別在分開的容器中存放或者表達TRAIL的溶瘤腺病毒和槲皮素在同一容器中存放。

本發(fā)明提供了在受試者中治療肝癌或抑制肝癌細胞增殖的方法，其包括向所述受試者同時或依次施用表達TRAIL的溶瘤腺病毒和槲皮素。任選地，在本發(fā)明的方法中，可以同時或者依次施用其他的治療肝癌或抑制肝癌細胞增殖的藥物活性成分，例如吉西他濱、普樂沙福(AMD3100)或紫杉醇等；或者同時或者依次施用奎尼丁。

對于本發(fā)明所述的受試者，其優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為人。

對于本發(fā)明的表達TRAIL的溶瘤腺病毒和槲皮素，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對其作出任何修飾，前提是所述修飾不負面影響其活性。例如，可以對化合物進行修飾或裝載在其他載體上，以提高其在體內(nèi)的半衰期；或者可以與已知的穿透肽連接，以促進本發(fā)明化合物的透皮吸收或者越過血腦屏障等。總之，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對本發(fā)明的化合物進行各種修飾以提高遞送效率或用于其他目的并保持其活性。對于病毒的修飾，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進行基因修飾，以使其表達其他的抵抗癌癥的活性成分。這類修飾也是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的。

本發(fā)明的作為活性成分的表達TRAIL的溶瘤腺病毒和槲皮素可以連同藥學上可接受的載體一起使用。除活性成分外，本發(fā)明的方法、用途和產(chǎn)品還可以包含合適的藥學上可接受的載體，包括促進活性成分加工成制劑(例如適于注射或輸注的制劑)的賦形劑和助劑。

適于注射或輸注的制劑可包括水性和非水性無菌注射液和水性和非水性無菌混懸劑，所述無菌注射液可任選地包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和能使制劑與目的接收者的血液等壓的溶質(zhì)，所述無菌混懸劑可包括懸浮劑和增稠劑。所述制劑可存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿，并且可以保存在凍結(jié)干燥的(凍干)條件，在立即使用前僅需要加入無菌液體載體，例如注射用水。

本發(fā)明的活性成分任選地可與固體賦形劑相組合，且任選地磨碎所得到的混合物，并且需要時，在加入合適的助劑后，加工顆粒的混合物，以獲得所需劑型。合適的賦形劑特別是填充劑例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纖維素或淀粉制劑、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要時，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽例如海藻酸鈉。

在本發(fā)明中施用表達TRAIL的溶瘤腺病毒和槲皮素的量可為能協(xié)同治療受試者中肝癌或抑制肝癌細胞增殖的任何量，其可以是相當于約0.2-25mg槲皮素，優(yōu)選0.02-30mg槲皮素和1-100MOI表達TRAIL的溶瘤腺病毒的劑量。更優(yōu)選地，劑量單位包括約1-5mg的槲皮素和20-60MOI表達TRAIL的溶瘤腺病毒。最優(yōu)選地，劑量單位包括約2-3mg的槲皮素和40-50MOI表達TRAIL的溶瘤腺病毒。有效量的測定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)，特別是根據(jù)本文提供的公開內(nèi)容的啟示下。

根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的藥學產(chǎn)品(藥物、藥劑)或藥物組合物可以以任意有效劑量施用給藥受試者。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥學產(chǎn)品(藥物、藥劑或藥盒)或藥物組合物可以以多次劑量給藥，例如從約2至約15次劑量，更優(yōu)選從約4-10次劑量，最優(yōu)選約6次劑量。在特別優(yōu)選的實施方案，在給藥過程中，以每三周給藥約一次的頻率將本發(fā)明的藥學產(chǎn)品(藥物、藥劑)或藥物組合物給藥至受試者，例如注射、輸注或口服。在特別優(yōu)選的實施方案，給藥為通過靜脈注射施用槲皮素，通過腹腔注射表達TRAIL的溶瘤腺病毒。

應當理解本發(fā)明的藥學產(chǎn)品(藥物、藥劑或藥盒)或藥物組合物可以按用于通過任意適宜的途徑給藥的任意適宜的方式配制。

本發(fā)明的藥學產(chǎn)品(藥物、藥劑)或藥物組合物的劑量單位是基于常規(guī)進行給藥受試者。例如，劑量單位可以給藥多于每日一次、每周一次、每月一次等。劑量單位可以是以兩次/周為基礎(chǔ)給藥，即每周兩次，例如每三天一次。

如本文所使用的，“包含”與“包括”、“含有”或“特征在于”同義，并且是包括在內(nèi)的或開放性的，并且不排除另外的未陳述的元件或方法步驟。術(shù)語“包含”在本文中的任何表述，特別是在描述本發(fā)明的方法、用途或產(chǎn)品時，應理解為包括基本上由所述組分或元件或步驟組成和由所述組分或元件或步驟組成的那些產(chǎn)品、方法和用途。本文示例性描述的本發(fā)明適當?shù)乜梢栽诓淮嬖诒疚奈淳唧w公開的任何一種或多種元件、一種或多種限制的情況下進行實踐。

本發(fā)明的藥學產(chǎn)品(例如藥物組合物或藥盒)中可包含涉及該藥學產(chǎn)品的說明書，且該說明書可以含有如下內(nèi)容：適應癥(例如肝癌)、施用劑量(例如上述所示例性說明的)以及可能產(chǎn)生的副作用等等。

本文已采用的術(shù)語和表述用作描述性而不是限制性術(shù)語，并且在此種術(shù)語和表述的使用中不預期排除所示和所述特征或其部分的任何等價物，但應認識到各種修飾在請求保護的本發(fā)明的范圍內(nèi)是可能的。因此，應當理解盡管本發(fā)明已通過優(yōu)選實施方案和任選特征具體公開，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用本文公開的概念的修飾和變化，并且此類修飾和變化被視為在如由附加權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。

為更清楚地說明本發(fā)明，現(xiàn)結(jié)合如下實施例進行詳細說明，但這些實施例僅僅是對本發(fā)明的示例性描述，并不能解釋為對本申請的限制。

附圖說明

圖1：ZD55-TRAIL的表征。(A)ZD55-TRAIL的示意性結(jié)構(gòu)。在ZD55-TRAIL中，E1B 55-kDa基因被SV40polyA和TRAIL的表達盒代替。(B)通過western印跡分析鑒定ZD55-TRAIL。分別用槲皮素(10μM)、ZD55-TRAIL(2MOI)、或槲皮素(10μM)和ZD55-TRAIL(2MOI)處理HuH-7細胞。48小時后，制備細胞裂解物用于分析TRAIL和E1A蛋白的表達。模擬感染的細胞作為對照。GAPDH用作蛋白質(zhì)上樣對照。

圖2：槲皮素增強ZD55-TRAIL介導的HCC細胞生長抑制。(A)HCC細胞系HepG2、HuH-7和SMMC-7721分別用ZD55-TRAIL(1,2,5,10MOI)、槲皮素(5,10,25,50μM)或組合處理48小時。該圖顯示了三次獨立實驗的示例性結(jié)果。通過MTT測定評價細胞存活力。(B)ZD55-TRAIL聯(lián)合槲皮素對HCC細胞的協(xié)同效應。通過組合指數(shù)(CIN)分析進行定量，并表示為1g(CIN)對受影響的比例。在可能進行計算的情況下，顯示95％的置信區(qū)間。

圖3：槲皮素增強ZD55-TRAILα誘導的HCC細胞凋亡。(A)使用Hoechst 33342染色來檢測凋亡。將HuH-7鋪板在96孔板中并用ZD55-TRAIL(2MOI)、槲皮素(10μM)或ZD55-TRAIL(2MOI)加槲皮素(10μM)感染。為了確定凋亡程度，處理后72小時用Hoechst 33342處理HuH-7細胞30分鐘，然后在倒置熒光顯微鏡下觀察。紅色箭頭表示陽性凋亡細胞。原始放大倍數(shù)為400。(B)HuH-7細胞如下處理：ZD55-TRAIL(2MOI)，槲皮素(10μM)或ZD55-TRAIL(2MOI)加槲皮素(10μM)。未處理的細胞作為對照。48小時后，通過流式細胞術(shù)測定凋亡。(C)用ZD55-TRAIL(2MOI)，槲皮素(10μM)或ZD55-TRAIL(2MOI)加槲皮素(10μM)感染HuH-7細胞48小時。制備全細胞提取物，并進行Western免疫印跡以檢測caspase途徑的活化。使用表達的GAPDH作為加樣對照。

圖4：槲皮素抑制ZD55-TRAIL誘導的HCC細胞中NF-κB的活化。用ZD55-TRAIL(2MOI)、槲皮素(10μM)或ZD55-TRAIL(2MOI)加槲皮素(10μM)處理HuH-7細胞。48小時后，收集細胞裂解物并進行Western印跡測定以檢查IκBα、p65和p50的變化。使用表達的GAPDH作為加樣對照。

圖5：ZD55-TRAIL和槲皮素的體內(nèi)協(xié)同效應。(A)在治療后不同時間測量腫瘤體積。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD(n＝6)。**，P<0.01。(B)該圖顯示了在處死小鼠的最后時間點(第55天)各組對腫瘤生長的抑制作用。

具體實施方式

本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步的說明。

在本申請的發(fā)明的實施例中所用的材料和方法如下。

細胞系和病毒

人類肝癌細胞系SMMC-7721，HepG2和HuH-7購自中國科學院細胞培養(yǎng)物保藏中心細胞庫(CBTCCAS，中國上海)，并培養(yǎng)在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，GIBCO，Carlsbad，CA)，其補充有10％熱滅活的胎牛血清(FBS，GIBCO，Carlsbad，CA)。將細胞在37℃下在5％CO₂潮濕培養(yǎng)箱中溫育。重組溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL的構(gòu)建和生產(chǎn)如前所述。通過感染HEK293細胞進行重組腺病毒的擴增。

體外協(xié)同作用的細胞毒性測定和定量分析

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)購自Sigma-Aldrich(St Louis，MO)。如前所述通過MTT測定來獲得細胞活力。簡言之，將1×10⁴個SMMC-7721，HepG2或HuH-7細胞接種在96孔板中，并用指定濃度的ZD55-TRAIL和槲皮素處理。處理后48小時，向每個孔中加入10μL MTT溶液(5g/L)，并在37℃下孵育4小時。使用DNA酶標儀(Tecan，Maennedorf，Switzerland)測量570nm處的吸光度。

Hoechst 33342染色

Hoechst 33342染色用于檢測凋亡變化。HuH-7細胞分別用ZD55-TRAIL，槲皮素或ZD55-TRAIL和槲皮素的組合處理。處理72小時后，將5μL的Hoechst 33342(1mg/ml，Sigma-Aldrich，St Louis，MO)加入細胞30分鐘，并在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。未處理的細胞用作對照。

流式細胞術(shù)分析

用ZD55-TRAIL(2MOI)、槲皮素(10μM)、或ZD55-TRAIL(2MOI)和槲皮素(10μM)處理HuH-7細胞。48小時后，根據(jù)說明書，使用Annexin V-FITC和PI雙染色或PI染色單獨檢測凋亡細胞。使用流式細胞術(shù)(FACStar cytofluorometer，BD Biosciences)檢查細胞凋亡和細胞周期進展。

蛋白質(zhì)印跡分析

收集HuH-7細胞并用PBS洗滌兩次，然后在RIPA緩沖液中裂解。通過將細胞提取物裝載在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上并隨后轉(zhuǎn)移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜來分離蛋白質(zhì)。然后將膜與針對以下因子的一抗和稀釋液孵育：腺病毒-5E1A(1:1000)，TRAIL(1:1000)，capase-9(1:1000)，caspase-3(1:1000)，PARP(1:1000)，GAPDH(1:1000)，p65(1:500)，p60(1:500)和IκBα(1:500)。所用的二抗及其稀釋液為抗兔(1:5000)和抗小鼠(1:5000)?？瓜俨《?5E1A，Capase-9，Caspase-3，PARP和GAPDH的抗體購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。針對p65，p60和IκBα的抗體獲自Cell Signaling(Danvers，MA)。

動物實驗

動物實驗的許可由中國的動物保護和使用委員會授予。動物和實驗根據(jù)上述機構(gòu)的標準進行。5周齡的雄性BALB/C裸鼠購自中國上海中國科學院上海實驗動物中心。將HuH-7細胞皮下注射到雄性裸鼠的右脅腹中。每周檢查小鼠三次以觀察腫瘤發(fā)展。一旦皮下腫瘤發(fā)展并達到約100-150mm³，將裸鼠隨機分成四組(每組6只小鼠)。隨后，分別用ZD55-TRAIL、槲皮素，和所述病毒和所述藥物的組合或PBS注射小鼠。以腫瘤內(nèi)注射方式施用ZD55-TRAIL(1×10⁹噬菌斑形成單位-PFU，每只小鼠)，同時通過以150mg/kg體重的劑量向小鼠胃內(nèi)施用槲皮素或通過注射或通過胃內(nèi)施用給向平行對照施用100μlPBS媒介物。使用游標卡尺每3天測量腫瘤長度和寬度(mm)，并使用下式計算腫瘤體積：腫瘤體積(mm³)＝(A×B²)/2，其中A和B分別表示長度和寬度。然后根據(jù)體積測量獲得腫瘤生長曲線。

統(tǒng)計分析

實驗統(tǒng)計學顯著性表示為平均值±標準偏差(SD)，并通過Graph Pad 6.0軟件(GraphPad Software，San Diego，CA)分析。進行學生t檢驗以確定統(tǒng)計學顯著性。P值<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

實施例1：槲皮素增強ZD55-TRAIL介導的HCC細胞生長抑制。

通過缺失腺病毒5的E1B 55-kDa基因構(gòu)建溶瘤腺病毒載體ZD55；它可以在許多腫瘤細胞中選擇性復制?；诎┌Y靶向基因-Viro-Therapy，我們使用ZD55包裝治療基因TRAIL并獲得新的重組溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL(圖1A)。為了驗證ZD55-TRAIL的表征，我們使用western印跡分析來檢測腺病毒E1A和治療基因TRAIL的蛋白質(zhì)表達。與沒有ZD55-TRAIL處理的對照細胞相比，在用ZD55-TRAIL和ZD55-TRAIL加槲皮素感染的HuH-7細胞中存在E1A和TRAIL的強表達，表明ZD55-TRAIL可以在HCC細胞中高水平選擇性復制圖1B)。

為了評估槲皮素是否增強ZD55-TRAIL誘導的HCC細胞的細胞死亡，如材料和方法中所述進行MTT測定。用單獨的ZD55-TRAIL、單獨的槲皮素或兩者的組合感染HCC細胞系SMMC-7721，HepG2和HuH-7。結(jié)果顯示，與對照細胞系相比，ZD55-TRAIL和槲皮素的組合處理導致對HCC的增強的腫瘤殺傷作用(圖2)。

實施例2：槲皮素增強ZD55-TRAIL誘導HCC細胞凋亡。

隨后進行Hoechst 33342染色以測定用ZD55-TRAIL加槲皮素、ZD55-TRAIL或單獨的槲皮素處理的HuH-7細胞的形態(tài)學改變。結(jié)果示于圖3A。這證明，與ZD55-TRAIL單獨處理相比，用槲皮素的共處理導致明顯的凋亡，其特征在于觀察到染色質(zhì)濃縮，核碎裂和凋亡小體。為了定量槲皮素和ZD55-TRAIL誘導的凋亡的作用，使用膜聯(lián)蛋白-V-熒光素異硫氰酸酯(FITC)/PI雙染色來分析細胞凋亡(圖3B)。結(jié)果表明，與ZD55-TRAIL和槲皮素共同處理的HuH-7細胞凋亡率為58.9％，幾乎是ZD55-TRAIL單獨處理的兩倍(27.4％)。

Western印跡分析證明ZD55-TRAIL具有激活caspase依賴性通路的能力，包括caspase-9，caspase-3的激活和PARP的切割。這種獨特的效果可以通過用槲皮素和ZD55-TRAIL共同治療進一步增強(圖3C)。

實施例3：槲皮素抑制ZD55-TRAIL誘導的HCC細胞中NF-κB的活化

為了證明槲皮素具有抑制NF-κB依賴性轉(zhuǎn)錄并繼而使HCC細胞對ZD55-TRAIL敏感的能力，我們使用蛋白質(zhì)印跡確定所述處理引起的IκBα、p65和p50的表達變化。如圖4所示，在槲皮素和ZD55-TRAIL的聯(lián)合治療中IkBa、p65和p50的降低的表達比ZD55-TRAIL單獨誘導的更顯著，其表明槲皮素確實可以減少ZD55-TRAIL介導的NF-κB激活，并通過促進ZD55-TRAIL誘導的凋亡來降低其轉(zhuǎn)錄活性(圖4)。

實施例4：槲皮素增強體內(nèi)ZD55-TRAIL-介導的HCC腫瘤生長抑制

為了在體內(nèi)測試組合的槲皮素和ZD55-TRAIL處理的治療效果，使用用HuH-7細胞建立的HCC腫瘤異種移植模型具有單一和聯(lián)合治療處理的進行動物實驗。繪制腫瘤生長曲線以比較在49天觀察期間其抗腫瘤功效的差異。如圖所示。如圖5A所示，與接受PBS注射的那些相比，接受單獨槲皮素，ZD55-TRAIL和聯(lián)合治療的腫瘤內(nèi)注射的動物的平均腫瘤體積顯著減少。如預期的，組合治療比槲皮素(P＝0.001)和單獨的ZD55-TRAIL(P＝0.002)治療更有效。此外，與載體，槲皮素或ZD55-TRAIL單獨處理相比，槲皮素和ZD55-TRAIL的聯(lián)合治療導致改善的動物存活率(圖5B)。

實施例5：ZD55-TRAIL、槲皮素和奎尼丁三者在體內(nèi)顯著抑制肝癌細胞生長

4-5周齡的雌性BALB/c裸鼠購自中國科學院上海實驗動物中心(上海，中國)。所有的實驗操作均符合實驗動物在福利和倫理的要求。將HuH-7細胞細胞(2X10⁶，在PBS中)在裸鼠的右側(cè)皮下注射。一旦皮下腫瘤大小到達100-150mm³，將裸鼠隨機分為3組(每組8只)。然后施用槲皮素和ZD55-TRAIL的組合、和槲皮素、ZD55-TRAIL和奎尼丁(quinidine，Quin)三者的組合。ZD55-TRAIL(1X10⁹PFU/鼠)采用腫瘤內(nèi)注射的方式，而槲皮素和奎尼丁均以5mg/Kg體重的量腹膜內(nèi)注射，100μl PBS作為對照，連續(xù)注射三次，隔天注射。從注射開始，每5天測量腫瘤大小并在75天的時間內(nèi)統(tǒng)計裸鼠的存活。

結(jié)果證實，在第50天的時候槲皮素和ZD55-TRAIL的組合以及槲皮素、ZD55-TRAIL和奎尼丁的組合均能基本消除裸鼠的荷瘤塊，但是在實驗結(jié)束時的第75天，槲皮素和ZD55-TRAIL的組合使得裸鼠的存活率是62.5％(3只裸鼠死亡)，而槲皮素、ZD55-TRAIL和奎尼丁三者的組合的裸鼠存活率為87.5％(1只裸鼠死亡)。

雖然用上述實施方式描述了本發(fā)明，應當理解的是，在不背離本發(fā)明的精神的前提下，本發(fā)明可進行進一步的修飾和變動，且這些修飾和變動均屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。