本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及異黃酮類天然產(chǎn)物3′，4′，5，7-四羥基異黃酮(OROBOL)及3′位羥基系列生長的修飾物在抗小RNA病毒科病毒感染中的應(yīng)用。

用于制備預(yù)防和/或治療含有3C蛋白酶的小RNA病毒科病毒感染的抗病毒藥物中的用途。

背景技術(shù)：

小RNA病毒科病毒是一組顆粒直徑為22～30nm大小，無膜，單正鏈RNA病毒，其基因組長度大約為10Kb個核苷酸左右，能在宿主細(xì)胞中復(fù)制繁殖?；谶z傳組成和病毒翻譯機(jī)制的不同，小RNA病毒科目前被分為六個屬，其成員中有些是人和動物的重要病原體，包括腸道病毒屬的柯薩奇病毒、口蹄疫病毒屬的口蹄疫病毒、心病毒屬的腦心肌炎病毒、肝病毒屬的甲肝病毒和鼻病毒屬的人類鼻病毒，可引發(fā)的醫(yī)學(xué)重要疾病有普通感冒、無菌性腦膜炎、結(jié)膜炎、腦炎和呼吸道疾??；昆蟲的蟋蟀麻痹病毒、蜜蜂殘翅翼病毒、果蠅C病毒、蜜蜂急性麻痹病毒、茶尺蠖小RNA病毒、家蠶軟化病病毒與柞蠶iflavirus病毒等人和動物的重要病原體[1]Baker A C，Schroeder D C.The use of RNA-dependent RNA polymerase for the taxonomic assignment of Picorna-like viruses(order Picornavirales)infecting Apis mellifera L.

小RNA病毒科病毒存在200多種血清型，僅鼻病毒屬就超過100多種，除人脊髓灰質(zhì)炎病毒外，目前還沒有有效的預(yù)防用疫苗和治療方法。

3C蛋白酶是小RNA病毒科基因編碼共有的重要功能蛋白酶，在其復(fù)制及侵染宿主的過程中發(fā)揮重要作用。通過研究證明，該病毒的3C蛋白酶在人體中沒有與其同源基因，在人體內(nèi)沒有與其相似的蛋白酶。鑒于其在病毒的生命周期中的作用，抑制其催化功能可有效抑制病毒前體蛋白的切割，阻斷病毒復(fù)制， 是一個理想的小RNA病毒藥物治療研究的靶點之一

OROBOL(3′，4′，5，7-四羥基異黃酮)，為黃色粉末，溶于甲醇，分子式為C15H10O8，分子量286.05，熔點270℃，沸點616.1℃，是從植物中分離出來的異黃酮類天然產(chǎn)物。

目前尚未有OROBOL及其修飾物作為抗小RNA病毒科病毒3C蛋白酶抑制劑應(yīng)用的任何報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供OROBOL及其修飾物在抗小RNA病毒科病毒感染中的應(yīng)用。尤其是用于制備預(yù)防和/或治療含有3C蛋白酶的小RNA病毒科病毒感染的抗病毒藥物中的用途。

本發(fā)明應(yīng)用虛擬篩選技術(shù)對含有10萬個分子的chembridge分子庫進(jìn)行篩選，依據(jù)成藥性及經(jīng)驗原則，從篩選結(jié)果中選擇了多個結(jié)構(gòu)系列的目標(biāo)化合物，經(jīng)體外抑制3C蛋白酶活性篩選，獲得了1個結(jié)構(gòu)新穎的3C蛋白酶抑制劑OROBOL,結(jié)構(gòu)式如式Ⅰ所示，其中R＝H：

OROBOL能夠抑制小RNA病毒科病毒3C蛋白酶的催化功能，進(jìn)而抑制小RNA病毒科病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制作用。

OROBOL的系列修飾物在制備抗小RNA病毒科病毒藥物中的用途，為OROBOL在其3′位羥基做生長的系列修飾物，其系列修飾物的R分別為：

以上化合物的合成方法可以從已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)和專利中獲取。該系列修飾物能夠抑制小RNA病毒科病毒3C蛋白酶的催化功能，進(jìn)而抑制小RNA病毒科病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制作用。

進(jìn)一步的，小RNA病毒科病毒，包括人脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、腦心肌炎病毒、甲肝病毒、人類鼻病毒、動物口蹄疫病毒、蟋蟀麻痹病毒、蜜蜂殘翅翼病毒、果蠅C病毒、蜜蜂急性麻痹病毒、茶尺蠖小RNA病毒、家蠶軟化病病毒與柞蠶iflavirus病毒。

本發(fā)明提出的OROBOL及其系列修飾物可用于抗小RNA病毒科病毒藥物的制備，并用于治療各種包括腸道病毒屬的人脊髓灰質(zhì)炎病毒和柯薩奇病毒、口蹄疫病毒屬的口蹄疫病毒、心病毒屬的腦心肌炎病毒、肝病毒屬的甲肝病毒和鼻病毒屬的人類鼻病毒，可引發(fā)的醫(yī)學(xué)重要疾病有普通感冒、無菌性腦膜炎、結(jié)膜炎、腦炎和呼吸道疾病，以及昆蟲的蟋蟀麻痹病毒、蜜蜂殘翅翼病毒、果蠅C病毒、蜜蜂急性麻痹病毒、茶尺蠖小RNA病毒、家蠶軟化病病毒、柞蠶iflavirus病毒病等疾病。

附圖說明

圖1為在感染病毒的昆蟲細(xì)胞Sf9中添加不同濃度OROBOL 16h后，用q-PCR法測定的病毒復(fù)制的變化情況。

圖2為OROBOL對Sf9細(xì)胞的生長抑制作用，加藥24小時后，用CCK-8法測定的細(xì)胞生長情況。

具體實施方式

實施例1 體外檢測OROBOL對ApIV病毒復(fù)制的抑制作用

將狀態(tài)良好的sf9以3.7×10⁵/ml個/孔的細(xì)胞密度接種在12孔板中，于27℃、條件下培養(yǎng)24h后，加入OROBOL，使其最終濃度分別為0.1，1，10μg/ml和10μl的病毒，以不加OROBOL作為對照組。16h后，提取細(xì)胞總RNA后，用β-actin做內(nèi)參，用沒有加OROBOL的細(xì)胞做對照，用q-PCR檢測OROBOL對病毒的復(fù)制的作用，其結(jié)果見圖1，實驗結(jié)果表明隨著加入的OROBOL濃度的升高，其對病毒復(fù)制的抑制作用越強(qiáng)，當(dāng)加入的OROBOL的濃度為10μg/ml時，病毒復(fù)制的抑制率已達(dá)到80.5％，表明OROBOL可以抑制ApIV病毒的復(fù)制。

實施例2 OROBOL對昆蟲細(xì)胞生長的影響。

培養(yǎng)Sf9細(xì)胞，以5.0×10⁴個/孔的細(xì)胞密度接種到96孔板，培養(yǎng)24小時(h)后，加入OROBOL，使其最終濃度分別為10μg/ml，16h后用CCK-8法檢測OROBOL的細(xì)胞毒性，實驗同時設(shè)置對照孔和空白孔，每個組設(shè)5個平行。

加入OROBOL 16h后的細(xì)胞生長結(jié)果統(tǒng)計并以柱狀圖表示，當(dāng)OROBOL的濃度為10μg/ml時，細(xì)胞活性的降低僅為3.42％，而q-PCR中當(dāng)OROBOL的濃度為10μg/ml時，對ApIV病毒復(fù)制的抑制率已達(dá)到80.5％，細(xì)胞存活狀態(tài)良好，可以排除OROBOL是由于其細(xì)胞毒作用而抑制ApIV病毒在細(xì)胞中的復(fù)制的可能。

實施例3 CCK-8細(xì)胞毒性檢測

在加入化合物的細(xì)胞中每孔加入10μlCCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育4小時后取出，用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。

實施例4 OROBOL 3’位羥基系列修飾物篩選

基于結(jié)構(gòu)的先導(dǎo)化合物優(yōu)化主要集中于蛋白靶標(biāo)的活性位點的化合物結(jié)構(gòu) 的設(shè)計。Grow Scaffold工具可以根據(jù)蛋白靶標(biāo)活性位點的特點，通過基于化學(xué)反應(yīng)的原位生長(eaction-based in situ enumeration)方法來找出那些能夠產(chǎn)生潛在化合物的試劑，根據(jù)結(jié)合效果的分析，選出6個化合物。

實施例5 Discovery Studio中Molecular Dynamics Simulation模擬分析、虛擬測試

Molecular Dynamics Simulation是分子模擬中最常用的方法之一。該方法基于分子立場，能夠動態(tài)的描述生命的動態(tài)過程。運(yùn)行Molecular Dynamics Simulation后，計算受體與配體之間的相互作用能，較低的相互作用能預(yù)示著較強(qiáng)的作用力。通過分子對接及預(yù)測的數(shù)據(jù)可知，OROBOL的修飾物比OROBOL與受體之間的相互作用能均有不同程度的降低，說明這些化合物對ApIV病毒的復(fù)制應(yīng)有較好的抑制作用。

表1為使用Discovery Studio軟件中的原位生長模塊對OROBOL進(jìn)行修飾后，Molecular Dynamics Simulation測定受體與配體(OROBOL及其修飾物)間相互作用能。

表1

OROBOL對ApIV病毒的抑制活性測試結(jié)果表明，本發(fā)明所提供化合物具有抑制小RNA病毒科病毒3C蛋白酶效果，同時對小RNA病毒科病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制的具有抑制作用。

使用Discovery Studio軟件中的原位生長模塊對OROBOL進(jìn)行修飾后，Molecular Dynamics Simulation測定受體與配體(OROBOL及其修飾物)間相互作用能，OROBOL的修飾物比OROBOL與受體之間的相互作用能均有不同程度的降低，說明這些化合物對ApIV病毒的復(fù)制應(yīng)有較好的抑制作用。