本發(fā)明涉及光學成像與圖像處理模式識別領域，涉及一種瞬時正交光學投影層析成像系統(tǒng)。
背景技術：
：揭示生命的本質、關注人類健康是當代科技發(fā)展的主線。通過對生物樣本進行成像來研究樣本的結構特點和生理功能，可達到為醫(yī)學臨床診斷提供客觀依據(jù)的目的。光學投影層析成像(OpticalProjectionTomography，OPT)技術將CT技術和顯微技術相結合，能對熒光和非熒光物質進行三維成像的新技術。OPT具有比核磁共振更高的分辨率，可達微米量級；具有比共焦顯微成像更大的成像深度，能夠對厚達十幾毫米的樣品進行成像，也可以利用彩色或熒光染料對樣本進行組織特異性或基因特異性著色處理。OPT成像時，先采集樣品不同斷層在不同角度下的投影數(shù)據(jù)，再由計算機對這些數(shù)據(jù)運用Radon逆變換來重組圖像。OPT在組織發(fā)育、基因表達、以及醫(yī)療診斷等方面的研究中具有重要價值。了解生物系統(tǒng)不僅需要研究細胞的空間分布，還需要研究它們隨時間的動態(tài)變化。研究細胞的動態(tài)即細胞的移動情況，這對研究疾病變化、癌癥轉移是極為重要的。組織中被迫壞地方會有炎癥反應，免疫細胞會發(fā)生變化，這時白細胞會增多。細胞移動情況可以依據(jù)組織內的三維模型展開。在染病的模型中，研究活體生物體內細胞移動，這對生物醫(yī)藥機理研究具有重要的現(xiàn)實意義。在生物樣本方面，斑馬魚幼體已經被用來作為炎癥研究重要模式生物，因為它有較短的生殖周期，胚胎具有透明度，容易進行藥物試驗，可以利用基因和分子的處理進行一系列操作。另外，斑馬魚的透明特征使完整的生物體的生理和病理過程變得可視化，有助于進一步了解生物對生病和受傷的全部反應。因此，出現(xiàn)了一些利用熒光顯微法對斑馬魚體內子區(qū)域細胞移動進行二維和三維成像的研究，但是目前為止對整條斑馬魚進行時間延遲細胞追蹤技術還沒有相關報道。針對我國生物醫(yī)藥領域的發(fā)展和對高精度研究生物功能信息的需求，為了更好的研究疾病發(fā)展、生命活動及藥物作用，本發(fā)明提出利用角度復用的OPT系統(tǒng)對斑馬魚體胚胎內的中性粒細胞進行三維跟蹤和形態(tài)學特征提取，希望得到較高的時間延遲分辨率，降低對樣本的光輻射。利用瞬時正交成像技術(在相互垂直的CCD同時采集兩幅圖像)來定位和跟蹤細胞的運動。研究細胞檢測與識別算法，提取細胞的多參量形態(tài)學特征。為生物組織研究和醫(yī)藥運行機理提供新的技術手段和思路。技術實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種解決或部分解決上述問題的一種高精度瞬時正交光學投影層析成像系統(tǒng)。為了達到上述技術方案的效果，本發(fā)明的技術方案為：將一個轉基因突變的斑馬魚胚胎作為一個標準模型，標準模型是透明的，并且體內中性粒細胞中能表達出綠色熒光蛋白；對活體內中性粒細胞移動進行延時成像；轉基因突變的斑馬魚胚胎放入在胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在受精幾天后嵌入到低熔點瓊脂，低熔點瓊脂用于增加水的黏度，阻止麻醉的轉基因突變的斑馬魚胚胎的運動，低熔點瓊脂內含麻醉劑；轉基因突變的斑馬魚胚胎在麻醉后，被吸入透明的FEP氟化乙丙烯管子，在成像前，弄傷尾巴，提供了一個炎癥刺激，形成一個樣本；高精度瞬時正交光學投影層析成像系統(tǒng)包括有：散射片、光學快門、激光器、旋轉臺、EF濾光片A，L1鏡筒透鏡A、可調光闌A、L2鏡筒透鏡A、CCD相機A、EF濾光片B、L1鏡筒透鏡B、可調光闌B、L2鏡筒透鏡B、CCD相機B、采集裝置、電動控制快門、控制模塊、光學感應模塊、數(shù)據(jù)存儲模塊、匹配模塊，查詢模塊；控制模塊用Labview編程語言編程控制的部件有光學快門、旋轉臺、CCD相機A和CCD相機B，樣本懸浮在一個裝滿水的容器里，將裝滿水的容器固定在旋轉臺上，用一個473nm，25mw激光器用作寬場激發(fā)；寬場激發(fā)出的熒光在CCD相機A、CCD相機B上成像；用L1套筒透鏡A和L2套筒透鏡A作為消色差雙合透鏡在正交投影角度通過激發(fā)濾光片A產生的合適的視場和放大率；用L1套筒透鏡B和L2套筒透鏡B作為消色差雙合透鏡在正交投影角度通過激發(fā)濾光片B產生的合適的視場和放大率；用分別位于L1套筒透鏡A和L1套筒透鏡B焦平面上的調節(jié)光闌A和調節(jié)光闌B，從而產生一個有效采集數(shù)值孔徑，與透明的FEP氟化乙丙烯管子的內直徑近似匹配；一個電動控制快門直接放置在激光器后避免投影采集期間的曝光；采集裝置的參數(shù)設置和硬件控制通過編程進行實現(xiàn)，并包括有數(shù)據(jù)采集板、信號發(fā)生器；數(shù)據(jù)采集板的電平信號可以通過信號發(fā)生器進行同步觸發(fā)；控制模塊，用于根據(jù)查詢模塊的數(shù)據(jù)進行控制信號發(fā)生器；光學感應模塊，用于曝光后收集CCD相機A和CCD相機B的瞬間曝光信息，并且反饋給數(shù)據(jù)存儲模塊；光學感應模塊用于獲取根據(jù)CCD相機A和CCD相機B在樣本區(qū)域下拍攝的曝光數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)存儲模塊，通過光學感應模塊收集的信息，用于存儲不同的幀數(shù)模式產生的全部或部分曝光數(shù)據(jù)，其中，根據(jù)實際需要的幀數(shù)形成不同的幀數(shù)標識進行分類，并且存儲為列表，在列表中，每個不同的幀數(shù)標識的曝光數(shù)據(jù)作為列表的行，存儲在數(shù)據(jù)鏈表中；匹配模塊，用于根據(jù)請求中從數(shù)據(jù)鏈表開始查找匹配，將請求與數(shù)據(jù)鏈表的不同的幀數(shù)標識進行匹配，直到匹配到與不同的幀數(shù)標識的曝光數(shù)據(jù)為止，并把匹配到的曝光數(shù)據(jù)進行排序；查詢模塊，根據(jù)匹配模塊得到的排序的數(shù)據(jù)，建立根據(jù)實際需要的幀數(shù)而形成不同的幀數(shù)標識的一系列子列表以供參考，從而能減少CCD相機A和CCD相機B的瞬間曝光的反應時間，增加智能性；CCD相機A和CCD相機B實現(xiàn)同步采集，設置均為外觸發(fā)模式，允許來自數(shù)據(jù)采集板的電平信號的同步觸發(fā)；為了延時采集，電動控制快門打開，CCD相機A和CCD相機B由信號發(fā)生器給出信號給控制模塊，由控制模塊進行控制工作；一旦CCD相機A和CCD相機B的曝光時間得到滿足，電動控制快門關閉，CCD相機A和CCD相機B里的數(shù)據(jù)循序地被讀出形成圖像，圖像被保存，旋轉臺切換到下一個角度；最后在用戶定義的延遲時間里，再按預期設定的循環(huán)步驟重復進行。附圖說明圖1為高精度瞬時正交光學投影層析成像系統(tǒng)結構圖。具體實施方式為了使本發(fā)明所要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發(fā)明進行詳細的說明。應當說明的是，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明，能實現(xiàn)同樣功能的產品屬于等同替換和改進，均包含在本發(fā)明的保護范圍之內。具體方法如下：實施例1：旋轉式瞬時正交成像三維跟蹤系統(tǒng)，對活體模式動物的免疫細胞(如：中性粒細胞)進行三維跟蹤，努力提高時域精度。相對傳統(tǒng)三維跟蹤對樣本做每個時間點的三維成像，本發(fā)明利用瞬時正交成像系統(tǒng)實現(xiàn)了對樣本進行三維跟蹤的最小光輻射(最小光漂白和光毒性)，對生物活體的傷害小，為生物、醫(yī)學、醫(yī)藥研究提供了新的技術手段，具有重要的應用價值。并在正交投影角度來實現(xiàn)基于時間延遲的轉基因斑馬魚胚胎中性粒細胞的三維跟蹤。利用光與生物組織的相互作用進行成像，一直備受青睞，因為光學成像具有對組織干擾小，靈敏度高，信息豐富(可多參數(shù)聯(lián)合測量，這些參數(shù)包括結構、頻譜、偏振、量子效應和壽命等)，可達亞細胞層次分辨率水平，適于離體或活體實時成像，便于與其他技術如超聲結合使用，以及具備直接治療的潛能等優(yōu)點。光與組織的相互作用機制非常豐富，有反射、散射、吸收、熒光等，這些光學現(xiàn)象均可用于提取組織中的相關信息，從而產生基于它們的各種成像方法，使得光學方法成為生物組織成像里研究最為活躍、發(fā)展最為迅速的領域。但是，由于生物組織的不均勻性，對光波有吸收和強散射，因此光波很難深入組織內部，更難以從生物組織中提取出清晰的圖像。為了解決這個難題，近年來人們發(fā)展了一系列光學成像方法。例如：共聚焦/多光子光學成像技術、光學相干層析成像(OpicalCoherenceTomography，OCT)、光片顯微儀(LightSheetMicroscopy，LSM)、掃描激光光學斷層掃描(ScanningLaserOpticalTomography，SLOT)、光學投影層析成像(OPT)等。這些醫(yī)用成像技術手段有各自的適用范圍和各自的局限性，表1列出幾種常用成像技術的優(yōu)缺點。成像方式空間分辨率探測深度成像技術成本適用對象XCT0.7-2.0mm無限非光學成像較高＞cm宏觀樣本PET4-6mm無限非光學成像較高＞cm宏觀樣本UI＞100μm20-30mm非光學成像較高＞cm宏觀樣本MRT＞1mm100μm以下非光學成像最高＞cm宏觀樣本OCTμm量級1-5mm范圍光學成像較低mm-cm介觀樣本OPTμm量級～10mm范圍光學成像較低mm-cm介觀樣本表1常用生物醫(yī)學成像技術參數(shù)比較當前進行能夠對mm-cm量級生物對象進行三維光學成像的方法有：OPT、SLOT、LSM。LSM相對成像速度快，但成像的精度方向各異性，提取的圖像信息容易模糊。OPT和SLOT，結構簡單容易操作，成像精度各方向同性。但OPT是寬場成像方式，通過全場照明激發(fā)用CCD采集投影成像，采集速度更快。SLOT是通過單點激發(fā)和探測而成像。生物醫(yī)學三維成像為生物和醫(yī)學研究提供了新的技術手段。研究活體內細胞的動態(tài)分布(三維跟蹤)是生物醫(yī)學成像領域一個非常有意義的課題，為探測疾病的變化和研究藥物的作用機理提供了新的技術手段。目前為止，細胞三維跟蹤已經利用顯微鏡實現(xiàn)，需要在每個時間點獲取三維體積信息。共聚焦/多光子激光掃描顯微提供了光學切片，這些光學切片有利于熒光標記細胞三維圖像堆棧的獲取。這個方法被用于基于高分辨率研究斑馬魚的有炎癥小區(qū)域的中性粒細胞，比如：尾巴受傷的模型，大約100μm視場。然而，事實上大多數(shù)激光掃描顯微鏡在穿透深度和視場上受到限制，他們本質上展示出各項異性的分辨率，可以擴展到整個樣本的介觀成像，但需要高的激發(fā)功率和長的圖像采集時間。我們可選擇一些針對mm-cm量級生物組織的三維成像技術，這些技術得益于全場圖像采集，包括光學投影層析成像(opticalprojectiontomography)和光片顯微技術(lightsheetmicroscopy)。這些技術能夠直接擴展到三維體積成像，例如：在每個時間點獲取整個樣本的體積。利用激光掃描顯微成像中已經改進和實現(xiàn)的算法直接來實現(xiàn)三維時間延遲特征的跟蹤。遺憾的是，體積成像需要獲取每個時間點上針對LSM的滿堆棧圖像或者針對OPT的滿序列投影。毫米量級體積實現(xiàn)細胞級分辨率需要超過100幀每體積。這限制了時間延遲分辨率，這些特征在這段體積獲取時間移動了有效的距離。而且，在每個時間點獲取幾百個圖像，結果是在整個時間過程中對樣本的大量的光輻射，這也將導致光漂白或光毒性使得活體研究大打折扣。本發(fā)明用改進的OPT采集方案，跟蹤一個疾病模型(如：斑馬魚胚胎)的細胞移動是特別方便的。實施例二：提出一種瞬時正交成像技術進行體內稀疏分布的細胞三維跟蹤，擬利用光學投影層析成像得到較高的時間延遲分辨率。與傳統(tǒng)的三維跟蹤技術需要對每個時間點作三維立體空間采集不同，本發(fā)明擬降低對樣本的光輻射。并利用角度復用OPT系統(tǒng)在不同投影角度同時采集兩幅正交圖像，擬采用高達相機幀率的時間去定位和跟蹤特征目標。將樣本放置在旋轉臺，調焦兩個正交成像臂到旋轉軸，選擇合適的系統(tǒng)部件參數(shù)，激光器、CCD、電動控制快門、濾光片，光闌，透鏡等，搭建雙軸瞬時正交OPT成像系統(tǒng)。樣本準備，將一個轉基因突變的斑馬魚胚胎作為一個標準模型。該模型是透明的，并且其體內中性粒細胞中能表達出綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)。對其體內細胞移動進行時間延時成像。胚胎在胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在受精幾天后嵌入到低熔點瓊脂，內含麻醉劑。斑馬魚胚胎在麻醉后，吸入透明的FEP管子。該容器與水的折射率相似，能夠用于成像應用的折射率匹配容器。加入瓊脂是為了增加水的黏度，阻止麻醉的斑馬魚胚胎的運動。可以在成像前，弄傷尾巴，提供了一個炎癥刺激。通過發(fā)明，通過調焦兩個正交成像臂到旋轉軸(見圖1)，搭建角度復用光學投影層析成像(OPT)系統(tǒng)。雙圖像采集系統(tǒng)的實驗設置如圖1描述。將樣本放在一個旋轉臺，懸浮在一個裝滿水的小容器來提供折射率匹配?？梢杂靡粋€473nm，25mw激光器用作寬場激發(fā)。發(fā)出的熒光在兩個CCD相機(根據(jù)實際需要選擇合適參數(shù))上成像。用兩個同樣的成像系統(tǒng)(L1：消色差雙合透鏡，L2：消色差雙合透鏡和可調節(jié)孔徑)在正交投影角度通過合適的濾光片產生的合適的視場和放大率。采集數(shù)值孔徑用透鏡L1焦平面上的光闌調節(jié)，產生一個有效采集數(shù)值孔徑，與FEP(氟化乙丙烯)管子的內直徑近似匹配。一個電動控制快門直接放置在激勵源激光器后避免投影采集期間的曝光。采集裝置參數(shù)設置和硬件控制通過LabVIEW2010軟件編程實現(xiàn)。通過2個CCD實現(xiàn)同步采集，兩個相機設置為外觸發(fā)模式，允許來自數(shù)據(jù)采集板的TTL信號的同步觸發(fā)。為了延時采集，激發(fā)快門打開，CCD相機由信號發(fā)生器觸發(fā)。一旦CCD曝光時間滿足，快門關閉，CCD相機數(shù)據(jù)循序地被讀出，圖像被保存，旋轉臺切換到下一個角度。在用戶定義的延遲時間，這個步驟按預期設定的循環(huán)步驟重復進行。本發(fā)明采用非常完備的實驗條件：488nm激光器(200mw)、561nm激光器(200mw)、多個光譜儀、CCD、光電倍增管、探測器、電動位移臺、控制器、功率計、示波器、熒光顯微鏡系統(tǒng)、工作站等；控制模塊，用于根據(jù)查詢模塊的數(shù)據(jù)進行控制信號發(fā)生器；光學感應模塊，用于曝光后收集CCD相機A和CCD相機B的瞬間曝光信息，反饋給數(shù)據(jù)存儲模塊；光學感應模塊用于獲取根據(jù)CCD相機A和CCD相機B在樣本區(qū)域下拍攝的曝光數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)存儲模塊通過光學感應模塊收集的信息，用于存儲不同的幀數(shù)模式產生的曝光數(shù)據(jù)，其中，根據(jù)實際需要的幀數(shù)形成不同的幀數(shù)標識進行分類，并且存儲為列表，在列表中，每個不同的幀數(shù)標識的曝光數(shù)據(jù)作為列表的行，存儲在數(shù)據(jù)鏈表中；匹配模塊，用于根據(jù)請求中從數(shù)據(jù)鏈表開始查找匹配，直到匹配到與不同的幀數(shù)標識的曝光數(shù)據(jù)為止，并把匹配到的曝光數(shù)據(jù)進行排序；查詢模塊，根據(jù)匹配模塊得到的排序的數(shù)據(jù)，建立根據(jù)實際需要的幀數(shù)而形成不同的幀數(shù)標識的一系列子列表以供參考，減少CCD相機A和CCD相機B的瞬間曝光反應時間；CCD相機A和CCD相機B實現(xiàn)同步采集，設置均為外觸發(fā)模式，允許來自數(shù)據(jù)采集板的電平信號的同步觸發(fā)；為了延時采集，電動控制快門打開，CCD相機A和CCD相機B由信號發(fā)生器給出信號給控制模塊，由控制模塊進行控制工作；一旦CCD相機A和CCD相機B曝光時間得到滿足，電動控制快門關閉，CCD相機A和CCD相機B里的數(shù)據(jù)循序地被讀出形成圖像，圖像被保存，旋轉臺切換到下一個角度；在用戶定義的延遲時間里，再按預期設定的循環(huán)步驟重復進行。有益效果：通過本發(fā)明實現(xiàn)對斑馬魚胚胎內中性粒細胞的三維跟蹤。采集速度達到相機幀速率、對生物樣本光輻射小，得到細胞的位置變化和形態(tài)學特征。為下一步數(shù)據(jù)分析奠定基礎。分析中性粒細胞結構、形態(tài)學特征、運動軌跡與炎癥和藥物作用的相互關系，為研究疾病變化和藥物機理奠定實驗與理論基礎。以上所述僅為本發(fā)明之較佳實施例，并非用以限定本發(fā)明的權利要求保護范圍。同時以上說明，對于相關
技術領域：
的技術人員應可以理解及實施，因此其他基于本發(fā)明所揭示內容所完成的等同改變，均應包含在本權利要求書的涵蓋范圍內。當前第1頁1 2 3